DC细胞的分离及培养
bmdc培养方法
bmdc培养方法BMDC培养方法是一种常用的小鼠树突状细胞(Dendritic Cell, DC)培养方法，主要用于研究DC的功能和调控机制。
以下是关于BMDC 培养方法的详细介绍：1. 实验材料准备：小鼠骨髓细胞RPMI-1640培养基小鼠GM-CSF(粒细胞巨噬细胞集落刺激因子)和IL-4(白细胞介素-4)无菌培养箱、离心机、显微镜等实验设备2. BMDC的获取：从小鼠的股骨和胫骨中提取骨髓细胞，用RPMI-1640培养基洗涤并悬浮。
将骨髓细胞以1×10^6/mL的密度接种到无菌的培养瓶中，加入GM-CSF和IL-4，使其终浓度分别为50ng/mL和20ng/mL。
将培养瓶置于37℃，5%CO2的培养箱中，每两天更换一次培养基。
3. BMDC的成熟：在BMDC培养的第5天，用GM-CSF和IL-4继续诱导BMDC的成熟。
此时，GM-CSF的浓度可以降低至25ng/mL，而IL-4的浓度可以维持在20ng/mL。
在BMDC培养的第7天，观察BMDC的形态变化，成熟的BMDC 呈树突状，表面有丰富的毛刺状突起。
此时，可以收集成熟的BMDC 进行后续实验。
4. BMDC的功能检测：将成熟的BMDC与抗原提呈细胞(如B细胞、T细胞等)共培养，观察BMDC对抗原提呈细胞的激活作用。
将成熟的BMDC与特异性抗体结合，观察BMDC对抗原的识别和摄取能力。
将成熟的BMDC与免疫细胞(如T细胞、NK细胞等)共培养，观察BMDC对免疫细胞的调节作用。
5. BMDC的应用：用于研究DC的功能和调控机制，如DC的抗原提呈、共刺激信号传导、凋亡抑制等。
用于制备疫苗，通过激活T细胞和B细胞，提高机体对病原体的免疫力。
用于研究免疫耐受、自身免疫性疾病等疾病模型。
总之，BMDC培养方法是一种常用的小鼠树突状细胞培养方法，通过诱导骨髓细胞分化为成熟的树突状细胞，可以用于研究DC的功能和调控机制，以及制备疫苗等应用。
DC细胞解决方案
DC细胞解决方案DC细胞解决方案是一种用于治疗癌症和免疫系统相关疾病的新型治疗方法。
DC细胞，即树突状细胞（Dendritic Cells），是一种免疫系统中的重要成分，具有调节和激活免疫应答的能力。
DC细胞解决方案通过收集患者自身的DC细胞，经过处理和激活后再重新注入患者体内，以增强患者的免疫系统功能，从而达到治疗疾病的目的。
DC细胞解决方案的具体步骤如下：1. DC细胞采集：医生会从患者的外周血中采集到DC细胞。
这一步骤通常是通过简单的采血程序完成的。
2. DC细胞处理：采集到的DC细胞将被送往实验室进行处理。
处理过程中，细胞会被培养和激活，以增强其免疫活性。
3. DC细胞注射：经过处理的DC细胞会被重新注射回患者体内。
通常，这个过程会在医院或诊所内进行，由专业医生或护士负责操作。
4. 免疫增强：重新注射回患者体内的DC细胞会与患者的免疫系统相互作用，激活和增强患者的免疫应答。
这有助于患者的免疫系统更好地识别和攻击癌细胞或其他病原体。
DC细胞解决方案的优势和特点：1. 个性化治疗：DC细胞解决方案是一种个性化治疗方法，因为采集到的DC 细胞是来自患者自身的血液样本。
这样可以避免免疫排斥反应和其他副作用。
2. 免疫增强：DC细胞解决方案通过增强患者的免疫系统功能，帮助患者更好地对抗癌症和其他疾病。
相比传统的化疗和放疗等治疗方法，DC细胞解决方案能够提供更加持久和有效的治疗效果。
3. 低毒副作用：由于DC细胞解决方案采用的是患者自身的细胞，因此其毒副作用相对较低。
患者通常能够更好地耐受和接受这种治疗方法。
4. 多种适应症：DC细胞解决方案不仅适用于癌症治疗，还可以用于治疗免疫系统相关的疾病，如自身免疫性疾病和感染性疾病等。
需要注意的是，DC细胞解决方案虽然具有很大的潜力，但仍处于研究和临床实验阶段。
对于不同类型和阶段的癌症，以及其他疾病，DC细胞解决方案的治疗效果可能会有所不同。
因此，在选择和接受DC细胞解决方案治疗之前，患者应与医生进行详细的咨询和讨论，了解治疗的适应症、风险和预期效果。
DC细胞——精选推荐
DC细胞DC细胞概述DC细胞， 1973年Steiman和Cohn首次从脾脏中分离出一类与粒细胞、巨噬细胞和淋巴细胞形态和功都不同的白细胞，因其细胞膜向外伸出，形成与神经细胞轴突相似的膜性树状突起，故而命名为树突状细胞。
DC细胞图(dendritic cells，DCs)。
它是机体功能最强的专职抗原递呈细胞(Antigen presenting cells, APC)，它能高效地摄取、加工处理和递呈抗原，未成熟DC具有较强的迁移能力，成熟DC能有效激活初始型T细胞，处于启动、调控、并维持免疫应答的中心环节。
DC与肿瘤的发生、发展有着密切关系，大部分实体瘤内浸润的DC数量多则患者预后好。
有效的抗肿瘤免疫反应的核心是产生以CD8+ T细胞为主体的细胞免疫应答，这也是DC作为免疫治疗手段的基础。
美国杜克大学遗传和细胞治疗学中心的研究主任埃利-吉尔波瓦说过：“DC 是激发机体免疫系统激发抵御癌症侵袭最有效的途径之一。
”“DC作为高度专职化的主要抗原递呈细胞，在诱导针对相关抗原的高效、特异性T细胞免疫应答中起到关键作用。
”DC细胞刺激免疫反应的特点1.树突状细胞（DC)是人体内功能最强的专职抗原递呈细胞，DC相当于信使，将抗原信息传递给T细胞，并具有活化T细胞的功能，很少量就可以激发强大的T细胞反应。
2. 可致敏辅助T细胞的多种细胞因子，显著刺激初始型T细胞增殖，以激活体内静止状态的初始型T细胞（而巨噬细胞、B 细胞仅能刺激已活化的或记忆性T细胞）。
3. 帮助重建肿瘤患者对肿瘤细胞的免疫监视功能。
机体的免疫系统具有完备的监视功能，但肿瘤细胞对机体的免疫系统有抵抗和抑制作用，使得免疫细胞不能识别和杀伤肿瘤细胞。
在DC疫苗培养中用肿瘤抗原诱导DC使其致敏后，可将其抗原信息传递给T细胞，使T细胞重新识别和杀伤肿瘤细胞。
DC治疗流程1.抽取病人外周血50-60ml——分离单个核细胞，体外诱导DC细胞——DC细胞负载肿瘤抗原，通过静脉回输给病人或经皮下注射——经肿瘤抗原负载DC能刺激自体T细胞——产生强烈的抗肿瘤免疫应答。
dc细胞成熟条件
dc细胞成熟条件
DC（树突状细胞）是一类重要的抗原呈递细胞，能够激活和调节免疫应答。
成熟的DC具有更好的抗原呈递和刺激T细胞的能力。
为了培养出成熟的DC，可采用以下条件：
1.因源：DC通常是从外周血、骨髓、脾脏等组织中分离得到的。
常用的因源包括单个细胞悬浮液、组织片段和骨髓细胞。
2.生长因子：DC的培养需要添加一定的生长因子。
常用的包括GM-CSF（粒细胞巨噬细胞集落刺激因子）和IL-4（白细胞介素4），它们可以促进单核-巨噬细胞系列的细胞分化为DC。
3.培养基：一般采用含有适当量的生长因子的培养基，如RPMI-1640（一种常用的细胞培养基）。
4.刺激剂：为了促进DC成熟，需要给细胞添加刺激剂。
常用的刺激剂包括脂多糖、CpG寡核苷酸（一种大肠杆菌的细胞壁成分）和细胞因子如TNF-α（肿瘤坏死因子-α）等。
5.培养条件：通常将DC在体外培养数天，温度维持在37摄氏度，5%CO2含量的培养箱中。
培养期间需要保持适宜的pH 值、氧气和养分供应。
需要注意的是，以上条件是一般的培养条件，对于不同种类的DC和研究目的可能存在一些差异。
因此，具体的培养条件还需要根据实验需求和文献资料进行调整。
DC细胞解决方案
DC细胞解决方案背景介绍：DC细胞（Dendritic Cell）是一类免疫细胞，具有重要的抗原递呈和免疫调节功能。
DC细胞在免疫系统中起着至关重要的作用，可以识别和递呈抗原，激活和调节免疫应答，对于抗肿瘤、抗感染和自身免疫等疾病的治疗具有重要意义。
因此，开辟一种高效的DC细胞解决方案对于免疫治疗领域具有重要意义。
解决方案概述：本文将介绍一种基于先进技术的DC细胞解决方案，该方案包括DC细胞的制备、激活和应用等关键步骤。
通过该方案，可以快速高效地制备出具有活性和功能的DC细胞，为免疫治疗提供有力支持。
解决方案详细步骤：1. DC细胞的制备：a. 采集外周血或者骨髓等来源的单个核细胞（PBMCs）。
b. 利用密度梯度离心法分离出单个核细胞，并进行红细胞溶解。
c. 通过负选择或者正选择的方式，富集出CD14+单核细胞。
d. 将CD14+单核细胞培养于含有GM-CSF和IL-4的培养基中，诱导其分化为DC细胞。
2. DC细胞的激活：a. 将培养好的DC细胞转移到含有肿瘤相关抗原或者病原体抗原的培养基中。
b. 在培养基中加入适当的刺激剂（如LPS、CD40L等），激活DC细胞。
c. 经过适当时间的培养和刺激后，DC细胞表现出成熟的表型和功能。
3. DC细胞的应用：a. 将成熟的DC细胞采集，进行质量控制和鉴定。
b. 将DC细胞应用于免疫治疗中，如肿瘤免疫治疗、感染病治疗等。
c. 根据具体疾病的需求，可以通过不同的途径将DC细胞应用于患者体内，如注射、灌注等。
解决方案的优势：1. 高效快速：本方案采用先进的技术和方法，能够快速高效地制备出具有活性和功能的DC细胞。
2. 稳定可靠：通过严格的质量控制和鉴定，保证DC细胞的稳定性和可靠性。
3. 个性化定制：根据不同疾病和患者的需求，可以对DC细胞进行个性化定制，提高治疗效果。
4. 安全可控：本方案在制备和应用过程中，严格遵循规范操作和安全控制，确保治疗的安全性和可控性。
树突状细胞
器材
（1）水平式离心机（2）显微镜（3）血 ）水平式离心机（2）显微镜（3 球计数板、血盖片（4 球计数板、血盖片（4）载玻片、盖玻 片（5）定量移液器、洗耳球（6 片（5）定量移液器、洗耳球（6）刻度 离心管（7）试管、滴管、橡皮滴头（8 离心管（7）试管、滴管、橡皮滴头（8） 小滤纸、擦镜纸
试剂
3、培基第3 天换液，轻轻吸去原培养液，加入 、培基第3 等量含有IL等量含有IL-4 和GM-CSF 的新鲜1640 培氧液， GM的新鲜1640 继续置CO2 继续置CO2 孵箱中培养。 4、 促树突状细胞成熟：单核细胞经与IL-4 和 促树突状细胞成熟：单核细胞经与ILGM-CSF 的共同孵育，7 天左右使其分化成树突 GM的共同孵育，7 状细胞，但并未成熟。此时轻轻吸去含有IL状细胞，但并未成熟。此时轻轻吸去含有IL-4 和GM-CSF 的1640 培养液，更换等量的含有 GMIFNIFN-α的RPMI1640 培养液，继续置5%CO2 孵箱 培养液，继续置5%CO2 中，37℃培养，至第9 中，37℃培养，至第9 天时可获得成熟的树突 状细胞。
基本原理 细胞因子GM细胞因子GM-CSF 和IL-4 使血液中单核细胞分化成树突状细 IL胞，并用IFN胞，并用IFN-α促进树突状细胞的成熟。 试剂和材料 ● 新鲜的外周（肝素）抗凝血液 ● 淋巴细胞分离液。无钙镁HanKs(CMF-HanKs)液 淋巴细胞分离液。无钙镁HanKs(CMF-HanKs)液 ● 制剂：人重组GM-CSF(hrGM-CSF)、hrIL-4、hrIFN-α。 制剂：人重组GM-CSF(hrGM-CSF)、hrILhrIFN●培养液： （1） RPMI1640 全培基：RPMI1640+10% 胎牛血清（ FCS、 全培基：RPMI1640+10% FCS、 热灭活）+2mmol/LL-谷氨酰胺+100IU/ml 青霉素+100μg/ml 热灭活）+2mmol/LL-谷氨酰胺+100IU/ml 青霉素+100μg/ml 链霉素+1g/L 非必需氨基酸+1 链霉素+1g/L 非必需氨基酸+1 mmol/L 丙酮酸钠+5×105 丙酮酸钠+5× mol/L 2 巯基乙醇。 （2） RPMI1640/IL-4/GM-CSF:即RPMI 全培基+ILRPMI1640/IL-4/GM-CSF:即 全培基+IL4(40ng/ml)+GM4(40ng/ml)+GM-CSF(50ng/ml). （3） RPMI1640/IFN-α:即RPMI 全培基+ IFN-α（1 RPMI1640/IFN-α:即 全培基+ IFN10ng/ml）。 10ng/ml）。
体外诱导树突状细胞活化的方法 -回复
体外诱导树突状细胞活化的方法-回复体外诱导树突状细胞（DC）活化的方法是一种重要的免疫治疗策略，可用于诱导或增强机体免疫应答。
树突状细胞是一类重要的抗原递呈细胞，其在促进免疫应答中起着关键的作用。
体外诱导树突状细胞活化的方法能够激活树突状细胞，使其能够有效地刺激T淋巴细胞，从而提高机体免疫应答的效果。
本文将详细介绍体外诱导树突状细胞活化的各个步骤和方法。
第一步：树突状细胞的获取与分离体外诱导树突状细胞活化的第一步是获取和分离树突状细胞。
树突状细胞可以来源于外周血、骨髓、脾脏等组织。
其中，外周血中的单个核细胞（PBMC）是最常用的来源。
获取PBMC可以通过密度梯度离心法，如Ficoll离心法，将血液样品混合与密度梯度介质，离心分离出PBMC。
而只限于使用糖胶（Dextran）纳米颗粒可以选择短时间分离出PBMC。
得到PBMC后，可以利用磁珠柱、细胞排序术等方法将树突状细胞分离出来。
第二步：树突状细胞的培养与扩增获得树突状细胞后，需要进行培养和扩增，以增加细胞数量，以便进行后续实验。
最常用的培养基是RPMI-1640，其中含有适量的常规培养基、胎牛血清（FBS）和生长因子，如GM-CSF（粒巢集落刺激因子）和IL-4（白细胞介素）。
通过培养基的添加，树突状细胞可以在体外环境中生长和繁殖。
第三步：树突状细胞的活化树突状细胞的活化是体外诱导其活化的关键一步。
目前常用的方法有两种：一种是使用细胞因子刺激，另一种是使用特定的抗原刺激。
第一种方法中，通过添加特定的细胞因子来活化树突状细胞。
最常用的细胞因子包括GM-CSF、IL-4和TNF-α等。
这些因子可以激活树突状细胞，促使其产生更多的树突状突起，并增强树突状细胞的抗原递呈能力。
第二种方法中，使用特定的抗原刺激树突状细胞。
这需要事先知道与所需刺激的免疫应答相关的抗原并进行合成。
抗原可以是蛋白质、肽段或者核酸等，需要装载在适当的载体上。
然后将这些载体与树突状细胞共同培养，使抗原与树突状细胞内的抗原递呈分子结合，从而激活树突状细胞。
DC-CIK共培养流程
DC-CIK细胞培养流程1.将采集的外周血收集到2支离心管中，2000r/min离心5min，弃上清，将沉淀细胞混合，到加生理盐水至25mL，使沉淀细胞充分悬浮。
另取1支离心管，加入淋巴细胞分离液20mL，用滴管将血细胞悬液缓慢转移至淋巴细胞分离液的表面，使二者之间形成清晰的界面。
2.2000r/min离心20min后，从管底到液面分为4层，依次为红细胞和粒细胞层、淋巴细胞分离液层、外周血单个核细胞层（PBMC层）、血浆层。
用吸管将PBMC层吸出，转移至另一支离心管中。
3.加生理盐水至40mL，1500r/min离心5min，结束后弃上清，将沉淀细胞悬浮，加入生理盐水至40mL，充分混匀后，1500r/min离心5min。
如此共离心洗涤3次。
4.最后一次离心结束后，弃上清，将沉淀细胞均分为3份，分别转移到3个培养瓶中，各加入40mL的AIM-V培养液培养，分别记为A1、A2、A3。
5.2h后取出培养的细胞，分别将A1、A2和A3中悬浮的淋巴细胞转移至另3个培养瓶中，分别记为B1、B2、B3。
3个B瓶中加入IFN-γ，第二天加入IC因子（含有IL-2和抗CD3单抗），诱导培养CIK；3个含有贴壁细胞的A 瓶中各加入40mL的AIM-V培养液和H1、Hb因子，诱导培养DC。
6.DC培养过程中，如有发黄，则换液，补加H1和Hb因子。
7.CIK培养过程中，如发现培养液发黄，则换液，换液后补加IL-2。
如发现有细胞团块结为不良絮状，则用离心管收集后静置沉降5min左右，待絮状物沉淀后，小心将上清细胞悬液倒回培养瓶中。
8.DC于第7天加入肿瘤抗原和TNF，第8天铲下收集后与相应的CIK混合共培养。
DC瓶弃去。
如果总的细胞量过于庞大，也可将DC和CIK混合后均分到A和B瓶中。
9.共培养的DC-CIK于第10天做微生物检测，第13、14、15天连续3次回输。
10.静脉回输液的制备：培养结束后，将培养瓶中的细胞悬液用离心管收集，1500r/min，5min离心洗涤3次，将25毫升白蛋白加入250ml盐水中，终浓度1%，加入细胞沉淀，配成细胞悬液后静脉回输。
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DC细胞的分离及培养
一、单个核细胞的分离
1. 取新鲜脐带血按等体积加血液稀释液或PBS，混合均匀。
2. 将Ficoll-Paque PLUS（GE Healthcare）瓶来回倒置几次，以确保其混合均匀。
使用带注射针头的注射器刺穿隔片，倒置Ficoll-Paque PLUS 瓶并抽取需要量的
Ficoll-Paque PLUS。
3. 将Ficoll-Paque PLUS 取3 ml 缓缓加入15 ml离心管中。
4. 轻轻加入稀释血液样品4 ml，使其置于Ficoll-Paque PREMIUM层上。加入稀释
血液时，尽量使样品与Ficoll-Paque PREMIUM分层，二者不得混合。
5. 在18-20 °C 下，离心400 g 30-40 分钟。
6. 使用无菌的吸管或移液器抽出上层液体，使淋巴细胞层在界面处保持原状。
7. 采用一无菌的吸管或移液器将淋巴细胞层移入一清洁的离心管中。在最小量
的情况下移出界面处所有的物质至关重要。移去多余的Ficoll-Paque PLUS会导致
粒细胞污染；而移去多余的上清液则会引起血小板污染。
8. 向装有淋巴细胞的试管中加入至少3倍体积的PBS溶液。
9. 用吸管轻轻地将细胞吹吸，使其悬浮。在18-20 °C 下，以60-100 g 速度离心
10 分钟，丢弃上清液。
10. 重复步骤8-9，至此，淋巴细胞应悬浮于适合CD34阳性细胞分选液中。
二、CD34阳性细胞分选
1. 使用含0.5% BSA的PBS（分选buffer）重悬制备好的单个核细胞，加入50~100
μl CD34+ microbeads（Miltenyi公司），4 °C混合半个小时。
2. 选择合适的分选柱，MS柱适合50 ml血量，更多则使用LS柱。
3. 用分选buffer平衡分选柱3个柱体积后，将分选柱至于磁极上。
4. 将步骤1的悬浊液混合物以300 g 速度离心10 分钟，丢弃上清液，并使用
2-3 ml的分选buffer重悬。
5. 把重悬后的细胞和磁珠缓缓加到分选柱上，使其缓慢流下。
6. 用分选buffer清洗分选柱3个柱体积。
7. 将分选柱自磁极上取下，加入一个柱体积的分选buffer，快速将之打入离心管
中。为提高回收效率，可重复一次。
8. 将洗下的细胞以300 g 速度离心10 分钟，丢弃上清液，并用PBS重悬。
9. 重复步骤8并用合适的培养基重悬以适应下面的细胞培养。
三、CD34阳性细胞培养
1. 培养基配置：IMDM培养基+10% FBS，细胞因子SCF 50 ng/ml、IL-3 5 ng/ml、
IL-6 20 ng/ml、FL-3t 50 ng/ml、TPO 20 ng/ml，加双抗。
2. 将分离好的CD34阳性细胞置于六孔版的一孔或分于两孔中（视血量和细胞量
而定），每孔加入2 ml培养基，吹吸混匀，置于37°C、5% CO2下培养。
3. 一周后按照1：3的比例将接种的细胞传于六孔板的其它孔中。
4. 再一周后，将六孔版中的每3孔细胞传于一个10 cm盘中。
5. 之后一周两次对于10 cm盘中的细胞进行传代，稀释比例为1：2或2：3，视
细胞密度而定。
6. 传代至5-6周，细胞数目和状态都已至巅峰，可进行其它实验。培养时间不建
议超过6周，否则细胞状态难料；如果细胞量不足，最多延长至7周。
四、BCG处理细胞
1. BCG使用前提前2周左右接菌，生长至对数期较好。
2. 对于BCG计数，OD600为1时，1 ml菌液的细菌个数为3*108。
3. 取合适数目的BCG菌液，8000 g离心5 min，弃上清，用PBS或细胞培养基重
悬菌体。
4. 按照细胞与细菌1：10的数目比加入BCG，混合均匀。可同时加入少量LPS
以刺激DC的成熟。
5. 培养24-36 h后，收细胞，并进行后续实验。
五、肽的萃取及鉴定
1. 加入PBS溶液重悬细胞，超生1 min以破碎细胞（或直接使用8 M脲溶解细
胞）。15 000 g高速离心去除细胞碎片，取上清置于新的离心管中。
2. a) 加入MHC2的抗体，4 °C混合4 h。
b) 加入5倍体积的冷甲醇，12 000 rpm离心5 min，弃沉淀，取上清。
3. a) 继续加入已处理好的Protein A/G的beads，4 °C混合4 h。
b) 用旋转蒸发仪挥去甲醇，浓缩至原始体积。
4. a) 离心beads，清洗后，用酸性HAc-NH4Ac洗脱，过HLB柱子除盐。
b) 如不含脲可进一步浓缩，过HLB柱子除盐。
5. 除盐后洗脱液挥干再复溶，上LC-MS/MS分析。
6. 质谱结果使用无酶搜索，分析数据。