利用SLAF-seq技术开发新寡核苷酸探针鉴定小麦背景中的黑麦染色体
抗病小黑麦异染色体系的创制与鉴定
抗病小黑麦异染色体系的创制与鉴定小黑麦（Triticum timopheevii Zhuk.）是一种具有较强抗病性的小麦近缘物种，其对于抗病性的研究与利用一直备受关注。
小黑麦作为野生近缘种，其遗传背景相对复杂，同时其异染色体的研究在很长一段时间内并不够深入。
对小黑麦异染色体系进行创制与鉴定，对于深入挖掘小黑麦的遗传资源以及其抗病性基因的开发具有重要意义。
一、小黑麦的抗病性及其基因资源小黑麦作为野生近缘种，其抗病性水平相对较高，在小麦抗病育种中具有极大的潜力。
其主要表现在对于小麦锈病、白粉病、赤霉病等多种病害的高抗性。
由于小黑麦与小麦属于不同的染色体组，因此通过小黑麦与小麦的杂交，可以将小黑麦的抗病性相关基因导入到小麦中，从而提高小麦的抗病性。
二、小黑麦异染色体系的创制小黑麦是一种具有2n=4×=28条染色体的四倍体植物，其基因组包括了A、B两个亚基因组，分别对应着小麦的A、B两套染色体。
小黑麦还含有数条来自于野生千粒的球小麦的小染色体，即小黑麦的异染色体。
为了创制小黑麦的异染色体系，首先需要利用小黑麦与小麦进行杂交，得到相应的杂种后代。
然后通过染色体分析与分离技术，将小黑麦的异染色体与小麦的染色体分离开来。
通过对分离的异染色体进行鉴定、标记以及遗传分析，建立小黑麦的异染色体系。
针对小黑麦异染色体系的创制，需要综合运用细胞学、分子遗传学、分子生物学等多种技术手段，通过对异染色体的观察与分离，挖掘出小黑麦的抗病性相关基因，从而为小麦抗病育种提供一定的理论与技术支持。
小黑麦的异染色体系统在育种实践中具有重要的应用价值，因此对其进行准确鉴定是十分必要的。
通过对异染色体进行鉴定，可以帮助我们确定小黑麦的染色体组成，明确其遗传属性，为其在小麦抗病育种中的应用提供科学依据。
小黑麦的异染色体鉴定主要包括两个方面，一是对其异染色体的数量、形态、大小等进行观察与描述，二是通过染色体标记技术，对异染色体进行特异性标记。
抗条锈病小麦基因组中黑麦DNA插入片段的分子检测和序列分析
此可 见， Ｓ Ｓ Ｒ 标记 是 一 种新兴 的 理 想实 验手 段； 是 进行 作 物品 种 指 纹分 析、 目 的 基因
定位研究、 群体鉴别、 亲缘关系确定和遗传连锁图构建的理想标记方法。 但是， 高额 的开发成本和具有种属特异性的引物是微卫星标记技术应用过程中的缺点。 不过， 目 前许多物种的微卫星引物已经实现商品化， 一般的实验室只需利用现成的引物进行研
隆的 Ｄ Ｎ Ａ 序列， 而且可以定位整个基因组 Ｄ Ｎ Ａ ； 在用整个基因组 Ｄ Ｎ Ａ作探针时， 可
以明显地区分不同物种的染色体组成： 不仅可以 在细胞分裂中期进行外源遗传物质的
检测和定位，而且在细胞分裂间期也可以检测外源遗传物质和鉴定基因的表达行为
（ 马有志等，１ ９ ９ ７ ） 。但是，目 前利用原位杂交检测易位系仍然存在对小片段检测的
３ ． ５ ． ２ Ｒ Ａ Ｐ Ｄ标记
该技术是以基因组ｐ Ｎ Ａ为 模板， 以一个随机的寡核昔酸序列（ 通常 １ ０ 个碱基对）
作引物，通过 Ｐ Ｃ Ｒ扩增反应，产生不连续的Ｄ Ｎ Ａ产物，用于检测 Ｄ Ｎ Ａ的多态性
（ Ｗ ｉ ｌ ｌ ｉ ａ ｍ ｓ ｅ ｔ ａ ｌ ． ， １ ９ ９ ０ ） 。该方法简单易行， 受到研究者的普遍青睐。 但Ｒ Ａ Ｐ Ｄ技术最 大的缺点是稳定性差。为解决这个问 题， Ｐ ａ ｒ ａ ｎ ＆ Ｍ ｉ ｃ ｈ ｅ ｌ ｍ ｏ ｒ ｅ （ １ ９ ９ ３ ） 将Ｒ Ａ Ｐ Ｄ标记
在变性的聚丙烯酞胺上可检测到５ ０ － １ ０ ０ 甚至更多的扩增片段 （ Ｖ ｏ ｓ ｅ ｔ ａ ｌ ． ， １ ９ ９ ５ ） 。白
建荣等 （ ２ ０ ０ ０ ） 对４ 个小簇麦 及小麦亲本和抗源供体簇毛麦 进行了Ａ Ｆ Ｌ Ｐ 分析， 确定
基于SLAF-seq技术构建亚麻高密度遗传图谱
关键词 : 亚 麻 ;SLAF - seq技 术 ; 高通量测序 ;SNP标记;高密度遗传图谱 中图分类号 S565.903
:
文献标识码： A
文章编号 =1007 -9084(2017)03 -0334 -08
GAO Feng - yun1,2, SIQIN Bateer2, ZHANG Hui2, JIA Xiao - yun2, YI Liu - xi2, ZHOU Yu2, LI Qiang2, YE Ying - fu3, HOU Jian - hua1* (1. Inner Mongolia Agricultural University, Hohhot 010019 y China ； 2. Inner Mongolia Academy of Agricultural and Animal Husbandry Sciences , Hohhot 010031, China ； 3. Hohhot Vocational College, Hohhot 010051, China) Abstract ： To develop high - throughput SNP markers for high quality map of flax ( Linum usitatissimum L . ) , 100 individuals of 2 parents and their F2 population were detected by SLAF - seq technology. They were identified by high - throughput sequencing for SNP marker development and high - density genetic mapping. The 2 parents were varieties R43 and LH -8 9 . After in silico digestion of reference genome, 2 enzymes Hae IH and Rsa I were used to digest the genome DNA. Restriction fragments of 314 - 414bp were defined as SLAF. Polymorphic SLAFs were analysed and SNPs were detected according to data obtained by high - throughput sequencing. A high - densi ty genetic map was constructed using HighMap software. 196. 29M reads were obtained, with average Q30 value of 8 1 .95% , and average GC content 3 8 .64% . 260 380 SNPs were detected, of which 4 547 SNPs were qualified for genetic map construction. The final flax genetic map included 4 145 SNP markers on 15 linkage groups and was 2 632. 94 cM in length with an average distance of 0. 96 cM between adjacent markers. This first high density ge netic map in flax would be essential for genetic study and marker assistant breeding of flax. Key words： flax ； SLAF - seq technology ； high - throughput sequencing ； SNP markers; high - density genetic map
SLAF-seq技术原理及应用
基因型频率 差异分析
数量性状：
Super BSA
Super BSA信息分析内容
1. 标记筛选
SLAF分布图 Marker分布图 差异标记分布图
2. 关联分析
基因定位及注释
案例1：大豆抗病性状候选基因筛选
项目概况：
− − − − 群体类型：RILs群体 混池规模：抗病（30株）+感病（30株） 预计开发标签数量：50,000 完成时间：3个月
该方法既适合简单性状又适合复杂性状
• a图为简单性状（质量性状）
• b图为复杂性状（数量性状）
高通量测序解析酵母极端分离群体复杂性状
• 定位精细，通过基因 注释，可以直接确定 候选基因；
• 定位灵敏、准确，将 RM亲本中的RAD5RM 替换为RAD5BY，重 新杂交产生后代， RAD5峰消失（如 RAD5 Fixed所示）。
SLAF片段均匀分布整个基因组
玉米
谷子
水稻
大豆
桃
苹果
有效避开多数重复序列
简化前后重复序列对比
90.00%
80.00%
70.00% 重复序列比例 60.00% 50.00% 40.00% 30.00% 20.00% 10.00%
0.00%
Repeat in genome Repeat in SLAF-tag
•亲本间多态性仅为3.7%， SLAF-seq技术依然成功 构建了4,578个标记的遗 传图谱，标记间平均距 离仅0.69cM。 •这是大豆密度最高的遗 传图谱，小于1cM的标 记间隔可以将QTL锁定 在一个相对较小的区间， 从而实现QTL的精细定 位。
SLAF 多态性标记 图上标记 多态性比例 标签数量 数量 数量
抗条锈病小麦—黑麦5R（5B）代换系创制及黑麦5R染色体区段特异分子标记开发
摘要黑麦5R染色体带有小麦条锈病抗性基因，具有育种价值。
本研究利用SLAF-sequence测序技术和小麦-黑麦MA1R Ku-MA7R Ku单体附加系开发黑麦5R Ku染色体特异分子标记，利用非变性荧光原位杂交（ND-FISH）技术鉴定小麦-黑麦5R Ku(5B)代换系及黑麦5R Ku缺失系，并考察它们的条锈病抗性；利用5R Ku缺失系对5R Ku特异标记和条锈病抗性基因进行染色体区段定位；另外，对获得的5R Ku(5B)二体代换系的染色体的减数分裂行为进行了观察，对其自交后代进行了ND-FISH鉴定，结果如下：1.开发了114对5R Ku染色体特异分子标记；2.使用小麦-黑麦二体附加系DA1R I-7R I、DA1R Ki-7R Ki和单体附加系MA1R PI613196-7R PI613196及其黑麦亲本对5R Ku特异分子标记进行多态性验证，其中100个标记具有多态性；3.鉴定出了5R Ku(5B)二体代换系、5RL Ku(5B)双端体代换系、5RS Ku(5B)单端体代换系、5RS Ku.5BL易位系以及4种5R Ku缺失系。
根据探针Oligo-pSc119.2-1、Oligo-pSc200和Oligo-pSc250的信号位点以及缺失系的断裂位点，将5R Ku染色体分为S1、S2.1、S2.2、L1.1、L1.2、L2.1、L2.2、L3.1和L3.2九个区段。
4种5R Ku缺失系分别缺失了S1-S2.1、L1.2-L3.2、L2.2-L3.2和L3.2区段。
因此将这4种缺失系分别命名为DEL5RS S1-S2.1、DEL5RL L1.2-L3.2、DEL5RL L2.2-L3.2和DEL5RL L3.2。
利用这些缺失系，将5R Ku特异分子标记分别定位到S1-S2.1、S2.2、L1.1、L1.2-L2.1、L2.2-L3.1和L3.2六个区段；4.对所获得的材料进行了条锈病的抗性鉴定，结果表明：5R Ku单体附加系、5R Ku(5B)二体代换系、5RL Ku(5B)双端体代换系、DEL5RS S1-S2.1缺失系、DEL5RL L2.2-L3.2和DEL5RL L3.2中抗条锈病，5RS Ku.5BL易位系、5RS Ku(5B)单端体代换系和DEL5RL L1.2-L3.2缺失系都高感条锈病，因此将抗条锈病基因初步定位到L1.2-L2.1区段；5.5R Ku(5B)二体代换系的减数分裂中期I有5R Ku单价体的出现，后期I和末期I 都能观察到落后小麦染色体；在其自交后代中，发现了1A/1B、5A/5D、1B/1D、4B/7D、4B/4D等小麦染色体间的易位及5R/6A易位染色体，小麦染色体间的易位频率为5.94%，小麦与黑麦染色体的易位频率为0.50%。
小麦条锈病抗性基因定位及分子标记技术研究进展
小麦条锈病抗性基因定位及分子标记技术研究进展作者：杨芳萍曹世勤郭莹杜久元鲁清林吕迎春白斌周刚张文涛马瑞何瑞来源：《寒旱农业科学》2024年第01期摘要：条锈病流行对小麦生产造成巨大损失，选育和种植持久抗性品种是防治小麦条锈病最经济有效的策略。
为达到多基因聚合培育持久抗病品种的目标，必须不断发掘抗病种质、解析其抗病遗传机制并开发分子标记。
基于文献，对条锈病抗性基因发掘涉及的抗病性、分子标记、基因定位方法和定位进展及其在育种中的应用进行了综述，明确了小麦条锈病基因定位涉及技术的现状、局限性及优势，从而为后续的条锈病抗性基因发掘、多基因聚合和持久抗性小麦品种的选育与生产布局提供技术指导，以降低西北麦区和小麦主产区条锈病流行的频率，进一步促进国家粮食安全。
关键词：小麦；抗条锈基因；分子标记；连锁和关联分析；测序技术；育种应用中图分类号：S512.1 文献标志码：A 文章编号：2097-2172（2024）01-0001-10doi：10.3969/j.issn.2097-2172.2024.01.001Research Progresses on Mapping of Wheat Stripe RustResistance Genesand Molecular MarkersYANG Fangping 1， 2， CAO Shiqin 2， GUO Ying 2， DU Jiuyuan 2， LU Qinglin 2， LV Yingchun 3， BAI Bin 2，ZHOU Gang 2， ZHANG Wentao 2， MA Rui 2， HE Rui 2（1. Institute of Agricultural Economics and Information， Gansu Academy of Agricultural Sciences， Lanzhou Gansu 730070， China;2. Wheat Research Institute， Gansu Academy of Agricultural Sciences， Lanzhou Gansu 730070， China;3. Gansu Academy of Agricultural Sciences， Lanzhou Gansu730070， China）Abstract： The epidemics of stripe rust cause significant yield losses in wheat production. Breeding and cultivation of durably resistant varieties are the most cost-effective strategy forcontrolling wheat stripe rust. To achieve the goal of breeding durably resistant varieties through multi-gene pyramiding， it is necessary to continuously explore disease-resistant germplasms， decipher their resistant genetic mechanisms and develop molecular markers. This paper summarized the research progresses of stripe rust resistance， molecular markers， gene mapping methods， and their application in breeding related to the identification of stripe rust resistant genes to further clarify the status， limitations， and advantages of association mapping technologies for mapping of stripe rust resistance genes. This paper aims to provide technical guidance for the subsequent discovery of stripe rust resistance genes， multi-gene pyramiding， and the breeding and production arrangement of durably resistant wheat varieties to reduce the frequency of stripe rust epidemics in the northwestern wheat region and major wheat producing areas to further guarantee national food security.Key words： Wheat; Resistance gene to stripe rust; Molecular marker; Linkage and association analysis; Sequencing technique; Breeding application小麦是世界上分布最广、种植面积最大、总贸易额最多的粮食作物，为人类提供了20%的热量和25%的蛋白质。
基于纤毛鹅观草特异的卫星重复序列开发寡核苷酸探针
基于纤毛鹅观草特异的卫星重复序列开发寡核苷酸探针程梦豪;Miroslava Karafiatova;孙昊杰;Kate Arina Holušva;Jaroslav Dolezel;宋新颖;王海燕;王秀娥【期刊名称】《南京农业大学学报》【年(卷),期】2022(45)3【摘要】[目的]本文旨在开发纤毛鹅观草特异的寡核苷酸(oligonucleotide,oligo)探针,进一步完善纤毛鹅观草染色体鉴定技术。
[方法]利用前期选育的普通小麦-纤毛鹅观草异附加系DA2S^(c)L和DA6S^(c),通过流式分拣和基因组二代测序获得纤毛鹅观草染色体6S^(c)和染色体臂2S^(c)长臂的基因组序列,利用Repeatexplorer2/TAREAN软件从中鉴定出卫星重复序列并设计成oligo探针,通过荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization,FISH)分析所开发oligo探针的应用价值。
[结果]从6S^(c)和2S^(c)L基因组序列中共鉴定出11个卫星重复序列并开发成11个oligo探针,oligo-FISH结果表明,其中6个探针可以在纤毛鹅观草染色体上产生明显杂交信号,而在小麦染色体上未产生明显杂交信号,可用于特异鉴定小麦背景中的纤毛鹅观草染色体或片段。
对1套普通小麦-纤毛鹅观草异附加系oligo-FISH分析发现,oligo-2S^(c)L^(-1)63和oligo-6S^(c)-111仅在S^(c)基因组染色体上产生明显信号,可作为纤毛鹅观草S^(c)组特异探针;将oligo-2S^(c)L-161和oligo-2S^(c)L-163组合,对1整套二体异附加系进行双色oligo-FISH,构建了纤毛鹅观草染色体的oligo-FISH核型。
[结论]本研究提供了纤毛鹅观草重复序列组成的初步信息,开发的探针能特异鉴定纤毛鹅观草染色体,阐明纤毛鹅观草2个基因组的来源和分化,对推动纤毛鹅观草优异基因的转移和利用有重要意义。
聚合７ＯＥ_亚基１Ｂ／１Ｒ_易位系材料的创制及其品质研究
麦类作物学报 ２０２３，４３（６）：６７８－６８４ＪｏｕｒｎａｌｏｆＴｒｉｔｉｃｅａｅＣｒｏｐｓｄｏｉ：１０．７６０６／ｊ．ｉｓｓｎ．１００９ １０４１．２０２３．０６．０２网络出版时间：２０２３ ０５ ２４网络出版地址：ｈｔｔｐｓ：／／ｋｎｓ．ｃｎｋｉ．ｎｅｔ／ｋｃｍｓ２／ｄｅｔａｉｌ／６１．１３５９．Ｓ．２０２３０５２３．０９３４．００４．ｈｔｍｌ聚合７犗犈亚基１犅／１犚易位系材料的创制及其品质研究收稿日期：２０２２ ０５ ０７ 修回日期：２０２２ ０９ １４基金项目：河北省重点研发项目（２０３２６３４８Ｄ）；河北省农林科学院基本科研业务费项目（２０２１１１０２０５）第一作者Ｅ ｍａｉｌ：５９８３００２８９＠ｑｑ．ｃｏｍ（姚楚玄）；１３７７３７４９２３＠ｑｑ．ｃｏｍ（张磊，与第一作者同等贡献）通讯作者：柴建芳（Ｅ ｍａｉｌ：ｃｈａｉ８７６５２１３０＠１６３．ｃｏｍ）姚楚玄１，２，张磊１，秘彩莉２，周硕１，董福双１，刘永伟１，杨帆１，焦博１，柴建芳１（１．河北省农林科学院生物技术与食品科学研究所／河北省植物转基因中心，河北石家庄０５００５１；２．河北师范大学生命科学学院，河北石家庄０５００２４）摘 要：为提高小麦１Ｂ／１Ｒ易位系的加工品质，本研究选用高分子量麦谷蛋白亚基组成为１／７＋９／２＋１２的小麦１Ｂ／１Ｒ易位系品种科农１９９为母本，与高分子量麦谷蛋白亚基组成为１／７ＯＥ＋８ ／５＋１０的强筋春小麦品种津强６号杂交，利用分子标记在Ｆ４代株系中筛选到一个７ＯＥ亚基基因与黑麦碱基因聚合在同一条染色体上的１Ｂ／１Ｒ易位系材料。
ＰＣＲ结果显示，该聚合材料和非聚合材料在Ｇｌｕ Ａ１和Ｇｌｕ Ｄ１位点没有差异。
在温室种植条件下，对这些聚合材料和非聚合材料及其亲本进行麦谷蛋白溶胀指数（ＳＩＧ）测定，结果表明，与１Ｂ／１Ｒ易位系亲本科农１９９比较，聚合５＋１０优质亚基后ＳＩＧ值显著提高，聚合７ＯＥ优质亚基后，ＳＩＧ值进一步显著提高，部分聚合材料达到了强筋亲本津强６号的水平。
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第34卷第4期 2016年12月四川农业大学学报Journal of Sichuan Agricultural UniversityVol.34 No.4Dec. 2016doi：10. 16036/j. issn. 1000-2650. 2016. 04. 002利用SLAF-seq技术开发新寡核苷酸探针鉴定小麦背景中的黑麦染色体刘洪坤1，唐宗祥2*(1.南充职业技术学院，四川南充637000;2.四川农业大学植物遗传育种省级重点实验室，成都611130)摘要：【目的】通过荧光原位杂交(FISH)技术能有效地检测小麦背景中的黑麦染色体，进一步发现利用寡核苷酸探针 和非变性FISH(ND-FISH)技术可以提高黑麦染色体的检测效率。
【方法】通过借助SLAF-seq(specificlengthamplified fragment sequencing)和生物信息学方法开发寡核苷酸探针。
【结果】开发了 3种新的寡核苷酸探针Oligo-2874、Oligo-5296和Oligo-9965，它们可用于ND-FISH分析。
通过与小麦背景中的黑麦染色体端部和亚端部特异杂交，从 而达到识别黑麦染色体的目的。
【结论】这些寡核苷酸探针可以用于快速高效地鉴定小麦背景中的黑麦染色体，丰富 了小麦-黑麦杂交后代FISH分析的探针源。
研究结果也表明SLAF-seq技术可以用来开发小麦近缘种属特异的重 复序列FISH分析探针。
关键词院小麦；黑麦；寡核苷酸探针；非变性FISH; SLAF-seq中图分类号:S512.5 文献标志码：A 文章编号= 1000-2650(2016)04-0402-04Development of Novel Oligonucleotide Probes for Identifying RyeChromosomes in Wheat BackgroundLIU Hong-kun1,TANG Zong-xiang2*(1. Nanchong Vocational and Technical College, Nanchong 637000, Sichuan, China; 2. Province Key Laboratory ofPlant Breeding and Genetics, Sichuan Agricultural University, Chengdu 611130, China)Abstract:【Objective】Fluorescenceinsituhybridization(FISH)technologycanbeusedtoidentifyrye chromosomes effectively in wheat backgrounds.Oligonucleotide probes and non-denaturing FISH(ND- FISH)can increase the efficiency of detecting rye chromosomes.【Method】In this study，SLAF-seq (specific length amplified fragment sequencing)and bioinformatics methods were used to develop novel oligonucleotide probes.【Results】Three novel oligonucleotide probes Oligo-2874?Oligo-5296 and Oligo- 9965 were developed and they can be used for ND-FISH assays.The three probes only hybridize to telomeres and sub-telomeres of rye chromosomes.【Conclusion】Therefore?these oligonucleotide probes can discriminate rye chromosomes in wheat backgrounds quickly and efficiently?and they enrich the probe sources for FISH analysis of wheat-rye hybrids.The results also indicate that SLAF-seq can be used to develop specific repetitive DNA probes for FISH analysis of relatives of wheat.Key words:wheat；rye；oligonucleotideprobe；non-denaturingFISH；SLAF^eq黑麦在小麦育种中发挥了重要的作用，为小麦 麦1BL/1R S异位染色体在小麦育种中被得到广泛品种改良提供了多种优良基因^，尤其是小麦-黑 的应用[3]。
因此为了追踪、鉴定小麦背景中的黑麦染收稿日期=2016-09-05基金项目：国家自然科学基金项目（31471498)。
作者简介:刘洪坤，副教授，E-mail: 893146765@。
责任作者:唐宗祥，博士，教授，主要从事作物遗传育种研究工作，E-mail: zxtang@。
第4期刘洪坤，等：利用SLAF-seq技术开发新寡核苷酸探针鉴定小麦背景中的黑麦染色体403色质，先后发展了 C-带、原位杂交和基于P C R的分 子标记技术，并且都取得了巨大成功。
但因C-带技 术的耗时和技术要求高等缺点，限制了其在育种中 的应用[4]。
而基于P C R的分子标记虽然操作简便，但 不能反映外源染色体片段的大小，也无法检测小麦- 黑麦染色体之间的易位，荧光原位杂交(fluorescence insituhybridization,FISH)和基因组原位杂交(genomic insituhybridization，GISH)是鉴定和追踪异源染色 质的较理想的技术，已被广泛应用于杂种染色体组 成分析[M1。
FISH技术能通过不同的带型来鉴别染色 体'并且最近发展起来的合成寡核苷酸探针成功 地应用于荧光原位杂交，利用此方法分析小麦和黑 麦染色体，具有经济高效的优点[8-9]，同时还可通过 非变性荧光原位杂交(ND-FISH)来进行分析，大大 缩短了杂交时间，提高了材料鉴定的效率[10]。
目前，尽管可以利用寡核苷酸探针Oligo-1162、Oligo- pSc200和0ligo-pSc250代替黑麦基因组D N A探 针，通过ND-FISH途径分析小麦-黑麦杂交后代 [10]，但是 0ligo-pSc200 和 0ligo-pSc250 是根据已 知串联重复序列开发的寡核苷酸探针[10]，这在很大 程度上限制了新型寡核苷酸探针的开发。
此外，对于 小麦的其他近缘种属，也需要适当的方法来开发这 类寡核苷酸探针。
因此本研究借助SLAF-seq(specific lengthamplifiedfragmentsequencing)技术和生物信息学方法，开发了多个新的可以鉴定小麦背景中黑 麦染色体的寡核苷酸探针，并对开发这类寡核苷酸 探针的方法进行了综合讨论分析。
1材料和方法1.1试验材料通过利用普通小麦绵阳11与二倍体黑麦Kustro杂交，加倍获得八倍体小黑麦MK(2n=56)。
再利用M K根尖中期细胞染色体用于探针验证。
所 有试验材料均由四川农业大学植物遗传育种省级 重点实验室提供。
1.2试验方法1.2.1检测黑麦染色体的寡核苷酸探针的制备将黑麦Kustro的基因组DNA进行SLAF测序 (北京百迈克公司），测序程序主要参照ChenS.等[11]描述的试验方法，将黑麦Kustro的基因组DNA用 限制性内切酶HaeIII消化。
将测得的数据与小麦A、D基因组和普通小麦中国春的DNA序列(序列下载网址为：/triticum-urartu-progenitor- of-wheat-a-genome/；/，由北京百迈克公司分析)进行比对，获得大量同源性 低的长度为60b p的序列，再利用Perl语言进行数 据编程，对所得序列进行比对和聚类，从中随机选 取重复次数在1200以上的7条序列用于合成寡核 苷酸探针，已将这些寡核苷酸探针列于表1。
除表1中列出的新开发寡核苷酸探针外，另一种已报道的 寡核苷酸探针〇他。
-1162[10]也用于检测小麦背景中 的黑麦染色体。
1.2.2非变性荧光原位杂交(ND-FISH)寡核苷酸探针由上海Invitrogen公司合成，在 序列的5忆端添加6-FAM荧光标记，合成的探针用 1xTE(p H7.0)溶解，每个0D值加1X TE100滋L，杂 交时用1x T E稀释10倍，根据探针的不同，稀释的 最终浓度在51.06耀70.37 ng/滋L之间。
每张片子用量 0.4耀0.5滋L。
杂交液包含探针、2xSSC和1xTE(2xSSC 与1xTE按1:1等量混合)，每张片子加杂交液10滋L，探针和染色体都不需变性处理，盖上盖玻片，在湿 润的保鲜盒中42益杂交1h，2xSSC室温洗脱，再加 人含 DAPI 的抗裡色剂（VectorLaboratories，USA)，最后镜检、照相。
根尖细胞中期染色体制备按照表1合成的用于黑麦染色体检测的寡核苷酸探针序列Table 1 Sequences of synthesized oligonucleotide probes for detecting rye chromosomes探针名称Probe name核苷酸序列(5'-3'),Nucleotide sequence(5'-3')每张片子在所测序用量列中的重Applied 复次数amount for Repeat each slide(ng) numberOligo-1376 TGGATTGGGTATTCTTCAGAAAAAATAAACTAGGCTCATTTTCACAAAGAAAAAATAGC Oligo-2874 ATACGAACTCCGTTTGGGCTCCATGACCTGCCAAAACGACCGCAGCGAAAATTCGTA Oligo-5296 TGGACAAAACTGTGCATACCAGCTCTTCTACATTGCATTCGTACTGTTTGAAAATAATA Oligo-9965 AACTCTCGCGAAGAAACGGTGATCAAAGAAAATACAAAAATCAACCTAGAGTCCGAATT Oligo-12196 GCTAGTTCAAATCGGTGGGGGGTACTTTTGTAACACACCCTACATTTTGGACAAGCGCG Oligo-14990 CTTCAATTAGCATACTCATGTGAATGTACTTCCTCTTCATGCACAACCAGGGGGGAGGT Oligo-16521 GTGAATGTACTTCGACTTCATGCACAACCAGGGGGAGGCTGTACATCCATACAAACACG 27.52 4 530 27.68 6 270 27.27 6 200 25.53 1 299 28.03 1 890 28.15 1 807 27.35 1 808404四川农业大学学报第34卷HanF.等[12]描述的试验方法制备。