核酸探针描述
核酸探针技术
中学生物学
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核酸探针技术
岳朝宽
摘 要
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\XYZ[; 目前应用较多的非放射性标记物是生物素和地
高辛， 二者都是半抗原。 生物素是一种小分子水溶性维生素， 对亲和素有 独特的亲和力， 两者能形成稳定复合物， 通过连接在 亲和素或抗生物素蛋白上的显色物质（ 如酶、 荧光素 等） 进行检测。 地高辛是一种类固醇半抗原分子， 可利用其抗体 进行免疫检测， 运用原理类似于生物素的检测。地高 辛标记核酸探针的检测灵敏度可与放射性同位素标 记的相当， 而特异性优于生物素标记， 其应用日趋广 泛。
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]^_‘Ma5b678 人工合成的寡核苷酸探针是在已知基因序列的
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情况下， 由核酸合成仪来完成， 可廉价获得大量的此 类探针， 长度一般长约 !"#$" %&， 甚至可达 ’" %& 。如 果已知核酸序列可根据已知 ()* 或 +)* 序列合成 精确互补的 ()* 探针，单一已知序列寡核苷酸探针 能与它们的目的序列准确配对， 可以准确地设计杂交 条件， 以保证探针只与目的序列杂交而不与序列相近 的非完全配对序列杂交， 对于一些未知序列的目的片 段则无效； 如果不知道核酸序列， 可依据其蛋白质产 物 的 氨 基 酸 顺 序 推 导 出 核 酸 序 列 从 而 合 成 ()* 探 针。 人工合成的寡核苷酸片段作为核酸杂交探针应 用十分广泛， 对于检测靶基因上单个核苷酸的点突变 和小段碱基的缺失或插入尤为适用。
如何自制核酸探针
如何自制核酸探针？什么是核酸探针？核酸探针是能与特定的靶分子发生特异性结合的一段核苷酸分子。
通过在核酸探针上连接一些小分子化合物，如生物素、荧光素、地高辛等，或者放射性同位素标记核苷酸，可以达到检测靶基因序列和纯化的目的。
这一过程被称为核酸杂交。
其原理是碱基互补的两条核酸分子退火形成双链。
探针应用核酸探针技术作为分子生物学中最常见的技术之一，是印记杂交，原位杂交，实时荧光PCR，microarray（微阵列）等技术不可或缺的组成部分。
探针技术能定性或者检测特异性DNA/RNA序列，还可用于病原微生物和寄生虫的检测，疾病诊断等领域。
探针制备探针标记主要分为放射性和非放射性标记法。
探针制备流程如图1所示。
Southern印迹、Northern印迹等需要较长的DNA探针，常使用缺口平移法和随机引物法进行标记。
而这些方法对于较短的DNA（200 bp以下）来说，效率很低，常使用末端标记法。
除了这三种方法，常见的还有PCR标记法。
图1. 探针制备流程。
随机引物法随机引物法的原理是利用随机引物（random primer，即DNA 水解、分离得到的六聚脱氧核苷酸作）与单链DNA随机互补结合，在Klenow大片段酶的作用下，合成互补链，直至下一个引物。
如果模板是RNA，则使用反转录酶。
随机引物法可以使标记均匀跨越探针全长。
相比于缺口平移法，探针的活性更高，但是产量相对较低。
图2. 随机引物法的原理。
Protocol试剂：[α-32P]dCTP (3000Ci/mmol), dATP,dTTP,dGTP (5 mmol/L),Klenow大片段（2U/uL），模板，随机引物，NA终止/贮存缓冲液（50 mmol/L Tris-Cl (pH 7.5)，50 mmol/L NaCl，5 mmol/L EDTA (pH 8.0)，0.5% (m/V) SDS）5X 随机引物缓冲液（250 mmol/L Tris (pH 8.0)，25 mmol/L MgCl2，100 mmol/L NaCl，10 mmol/L 二琉苏糖醇（DTT)，1 mol/L HEPES ( 用 4 mol/L NaOH 调至 pH 6.6），1 mol/L DTT 贮存于 -20℃，临用前用水稀释，使用后弃去稀释的 DTT。
生物检测技术——核酸探针
3)单链DNA探针和双链DNA探针
➢ 用双链探针杂交验测另一个远缘DNA时，探针序列与 被检测序列之间有很多错配，但是，2条探针互补链之 间的配对却十分稳定，即形成自身的无效杂交，结果 使检测效率下降。科学上采用单链探针则可解决这一 问题。单链DNA探针的合成方法:(1)从Ml3载体衍生序 列合成单链DNA探针。(2)以RNA为模板用反转录酶合 成单链cDNA探针。
核酸探针的前景
➢ 基因芯片在环保方面、食品检测方面的研究报道比较少， 这将成为将来的研究方向。从某种意义上我们可以认为： 基因结构或种类决定物种，基因功能或表达则决定生命即 生物的生、老、病、死。基因芯片技术将为我们提供一条 认识生命本质的捷径，同时它的发展也带动了蛋白质芯片、 细胞芯片、多肽芯片、组织芯片的发展和应用。
➢ 核酸探针具有特定的序列，能够与具有相应核苷酸碱 基互补序列的核酸片段结合，因此可用于样品中特定 基因片段的检测。
核酸探针的标记物
一.放射性标记
➢ 放射性同位素是最早使用、也是目前应用最广泛的 探针标记物。常用的同位素有 32P、3 H、35S。其中， 以32P应用最普遍。
➢ 放射性标记的优点是灵敏度高，可以检测到pg级； 缺点是易造成放射性污染，而且同位素半衰期短、 不稳定、成本高。因此，放射性标记的探针不能实 现商品化。目前，许多实验室都致力于研究非放射 性标记的探针。
➢ 在癌基因的检测和诊断、致病病原体的检测、遗传病的产 前诊断以及亲子关系鉴定等基因诊断方面以及特异性目的 基因及外源DNA的检测方面，核酸探针技术将越来越显出 其巨大的应用解脲脲原体(UU)核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法)
➢ 双链DNA探针的合成方法：切口平移法和随机引物合 成法。双链DNA探针在与靶序列杂交前，DNA分子必 须变为单链，这一般是通过加热使其变性而达到解链 目的。解链DNA分子被迅速冷却到只能缓慢复性的温 度以下，可使探针保持单链状态。
常用核酸探针标记方法
常用核酸探针标记方法1、切口平移法（nick translation）原理：先用适量的DNase I 在Mg2+存在下，在双链DNA 上打开若干个单链缺口。
利用E. coli DNA 聚合酶I 的5'- 3' 核酸外切酶活性在切处将旧链从5’-末端逐步切除。
同时DNA 聚合酶I的5'- 3'聚合酶活性的作用下，顺序将dNTP连接到切口的3’-末端-OH上，以互补的DNA 单链为模板合成新的DNA单链。
图1 切口平移法原理示意图特点：1）各种螺旋状态（超螺旋、闭环及开环）及线性的双链DNA均可作为缺口平移法的标记底物。
但单链DNA和RNA不能采用此方法进标记。
双链DNA小片段（>100-200bp）也不是此法标记的理想底物。
2）DNA多聚酶必须是E·Coli DNA多聚酶的全酶。
3）DNA模板要用纯化过DNA2、随机引物法（random priming）原理：将待标记的DNA探针片段变性后与随机引物一起杂交，然后以此杂交的寡核苷酸为引物，大肠杆菌DNA聚合酶I大片段（E·Coli DNA polymerase I Klenow Fragment）的催化下，合成与探针DNA互补的DNA链。
当反应液中含有标记的dNTP时，即形成标记的探针。
图2 随机引物标记法原理示意图特点：1）除了能进行双链DNA标记外，也可用于单链DNA和RNA探针的标记。
2）所得到的标记产物是新合成的DNA单链，而所加入的DNA片段本身并不能被标记。
3）新形成的标记DNA单链的长度与加入寡核苷酸引物的量成反比，因为加入的寡核苷酸数量越多，合成起点也越多，得到的片段的长度也越短。
按标准方法得到的标记产物长度一般为200-400bp。
3、末端标记与切口平移法和随机引物法不同，DNA末端标记法并不将DNA片段的全长进行标记，而是只将其一端（5’或3’端）进行部分标记。
其特点是可得到全长DNA片段，DNA片段并非均匀标记，标记活性不高。
核酸基因分子探针
核酸基因分子探针从化学和生物学的意义上理解，探针是一种已知特异性的分子，它带有合适的标记物供反应后检测。
探针和靶的相互反应如抗原-抗体、血凝素-碳水化合物、亲合素-生物素、受体和配体，以及核酸与其互补核酸间的杂交等反应均属此类。
用核酸探针与待检标本中核酸杂交，形成杂交体，再用呈色反应显示。
此方法用于疾病的诊断，称为分子杂交基因诊断。
此法开始用于遗传性疾病的诊断如血红蛋白病的诊断、先天性遗传病的产前诊断。
近来，已发展为诊断外源性病原体如病毒、细菌、原虫等的方法；内源性病变基因研究如癌基因检测、基因突变、基因缺失或变异引起的疾病的基因诊断；人类基因识别及其生理功能和衰老有关研究；在法医检测中有关性别鉴别和DNA指纹谱的鉴定。
基因探针的研究引起了人们高度重视，在探针的制备技术上有重大突破。
可将核酸分子探针检测比喻为在柴草堆中去找一根针的神奇技术。
据美国华尔街分析家预言：“在生物技术市场中，下一个突破和具有吸引力的是基因探针”。
它的巨大的开发潜力和经济效益，已引起人们的重视。
目前基因检测方法中以同位素标记（32P、35S等）DNA探针灵敏度最高，但由于放射性污染、半衰期短、需要特别的安全防护条件等，限制了同位素标记探针的广泛应用。
因此，非同位素标记探针的研制引起重视，自Langer等（1981）合成了生物素化dUTP和NTP类似物以来，开创了用非同位素标记的新领域，用生物素标记核酸探针检测和识别特定的核酸序列，已广泛应用于临床检验和科学研究。
Leary等（1983）用缺口平移法标记的生物素DNA探针成功地用于Southern印迹杂交技术。
Forst等（1985）发表了光敏生物素直接标记核酸的简便方法，使核酸和蛋白质的生物素标记探针技术前进一大步。
Renz等（1984）、Thorpe等（1985）和Pollars 、Knight等（1990）用化学法直接把辣根过氧化物酶接到DNA上，运用发光显影法提高了敏感性。
分子生物学试题(附答案)
分子生物学试题（附答案）一、单选题（共100题，每题1分，共100分）1、为了避免反复冻融对核酸样品产生的破坏作用，最好( )A、将核酸小量分装保存B、将核酸冻干保存C、将核酸大量保存D、将核酸溶解保存E、将核酸沉淀保存正确答案：A2、关于梅毒螺旋体的描述错误的是A、可侵犯皮肤黏膜、内脏器官，导致心血管及中枢神经系统损害B、梅毒螺旋体是梅毒的病原体C、梅毒螺旋体属于苍白密螺旋体的苍白亚种D、主要通过性接触、输血、胎盘或产道等途径感染人体E、不会对胎儿产生影响正确答案：E3、用于区分 HBV 主要基因型的序列是A、NS5b 区B、C 区C、NS3 区D、5’UTR 区E、NS5a 区正确答案：D4、下列是 PCR 反应体系中必须存在的成分， ( )除外A、引物B、模板C、dNTPD、Mg2+E、DMSO正确答案：E5、PCR 反应过程中，退火温度通常比引物的Tm 值A、低5℃B、低15℃C、高5℃D、高15℃E、相等正确答案：A6、关于 DNA 芯片描述不正确的是A、探针为已知序列B、有序地高密度地固定于支持物上C、理论基础是核酸杂交D、可研究基因序列E、不能研究基因突变正确答案：E7、硝酸纤维素膜最大的优点是( )A、高结合力B、本底低C、非共价键结合D、共价键结合E、脆性大正确答案：B8、下列物质不适于非放射性探针标记的是A、AKPB、ACPC、生物素D、地高辛E、荧光素正确答案：B9、检测 TB 的实验室技术中，被认为是目前最先进的一种检测TB 及其耐药性的方法是A、PCR 技术B、荧光定量 PCR 技术C、PCR-RFLP 技术D、全自动结核杆菌检测技术E、DNA 测序技术正确答案：D10、目前最常用的TB 分子检测方法是A、PCRB、real-time PCRC、SDAD、LPAE、DNA chip正确答案：B11、DNA 指纹分子的遗传性基础是A、连锁不平衡B、MHC 的多样性C、DNA 的多态性D、反向重复序列E、MHC 的限制性正确答案：C12、基因芯片原位合成的描述错误的是A、直接在芯片上用四种核苷酸合成所需探针B、适用于寡核苷酸探针C、适用于制作大规模 DNA 探针芯片D、可实现高密度芯片的标准化和规模化生产E、也称为离片合成正确答案：E13、个体识别所使用的 HLA 分型技术不包括下列哪项 ( )A、PCR-RFLPB、PCR-SSPC、PCR-SSOPD、PCR-指纹图E、FISH正确答案：E14、美国食品药品监督管理局规定用于检测尿液标本中淋病奈瑟菌的方法是A、革兰染色镜检B、抗酸染色镜检C、淋病奈瑟菌 16SrRNA 基因检查D、ELISAE、动物接种正确答案：C15、操纵子结构不存在于：A、大肠杆菌基因组中B、真核生物基因组中C、细菌基因组中D、原核生物基因组中E、病毒基因组中正确答案：B16、脆性 X 综合征的临床表现有A、智力低下伴眼距宽、鼻梁塌陷、通贯手、指间距宽B、智力正常、身材矮小、肘外翻、乳腺发育差、乳间距宽C、智力低下伴头皮缺损、多指、严重唇裂及膊裂D、智力正常张力亢进，特殊握拳姿势、摇椅足E、智力低下伴长脸、大耳朵、大下颌、大睾丸正确答案：A17、稀有碱基主要存在于A、核糖体 RNAB、信使 RNAC、转运 RNAD、核 DNAE、线粒体 DNA正确答案：C18、当标本核酸量非常低难以扩增时，可采用的 PCR 技术是A、逆转录 PCRB、转录介导扩增C、原位 PCRD、巢式 PCRE、荧光 PCR正确答案：D19、单基因遗传病诊断最重要的前提是A、了解患者的家族史B、疾病表型于基因关系已阐明C、了解相关基因的基因克隆和功能分析等知识D、进行个体的基因分型E、了解相关基因的染色体定位正确答案：A20、次氯酸钠去除临床分子生物学实验室污染源的原理是A、诱导同一 DNA 链上相邻的两个嘧啶之间形成嘧啶二聚体B、氧化损伤核酸C、水解核酸D、与扩增产物的嘧啶碱基形成单加成环丁烷衍生物E、与胞嘧啶形成羟氨基胞嘧啶正确答案：B21、PCR 反应体系不包括A、耐热的 TaqDNA 聚合酶B、cDNA 探针C、4 种 dNTPD、合适的缓冲液体系E、模板 DNA正确答案：B22、阴性质控品失控的原因不包括A、扩增产物污染B、标本交叉污染C、放射性污染D、基因组 DNA 或质粒的污染E、试剂污染正确答案：C23、第三代测序技术的最主要特征：A、对单分子 DNA 进行非 PCR 的测序B、对 SNP 进行非 PCR 的测序C、高通量和并行 PCR 测序D、直接分析 SNPE、直接进行个体基因组测序和 SNP 研究正确答案：A24、下列方法中能同时检测几种疟原虫混合感染的是A、竞争 PCRB、巢式 PCRC、多重 PCRD、普通 PCRE、PCR-RFLP正确答案：C25、目前，个体识别和亲子鉴定主要依靠A、STR 基因座技术B、PCR-SSOC、蛋白质凝胶电泳技术D、PCR-SSCPE、细胞混合培养技术正确答案：A26、分离纯化核酸的原则是 ( )A、保证一定浓度B、保持一级结构完整并保证纯度C、保持二级结构完整并保证纯度D、保持空间结构完整E、保证纯度与浓度正确答案：B27、未来基因诊断的主要发展方向是A、胎盘着床前诊断B、母体外周血中胎儿细胞分析技术C、对常见病进行分子诊断D、对多发病进行分子诊断E、以上都是正确答案：E28、关于人工合成的寡核苷酸探针，下列描述不正确的是A、特异性高B、可依赖氨基酸序列推测其序列C、分子量小D、可用于相似基因顺序差异性分析E、可用末端转移酶进行5’端标记正确答案：E29、SDS 是一种阴离子表面活性剂，其可断开蛋白质分子内和分子间的( )A、氢键B、离子键C、二硫键D、酯键E、疏水键正确答案：A30、基因芯片技术的本质是 ( ) ：A、核酸分子杂交B、蛋白质分子杂交技术C、连接酶链反应D、DNA 重组技术E、酶切技术正确答案：A31、关于点样法进行 DNA 芯片制备不正确的是A、直接在芯片上用四种核苷酸合成所需探针的 DNA 芯片制备技术B、通过高速点样机直接点样C、多用于大片段 DNA 探针的芯片制备D、成本低E、速度快正确答案：A32、DNA 自动化测序技术一般用不到的技术是A、Sanger 的双脱氧链终止法B、Maxam 和 Gilbert 的化学降解法C、荧光标记技术D、PCR 技术E、电泳技术正确答案：B33、关于肿瘤分子诊断的说法正确的是A、肿瘤分子诊断就是利用分子生物学原理和技术建立的肿瘤诊断方法B、肿瘤的分子诊断中根据目的、对象、类型的不同要采取相似的诊断策略与方法C、肿瘤分子诊断的研究成果仅用于临床肿瘤的诊断D、肿瘤分子诊断的核心是基于细胞水平的分子诊断技术E、肿瘤分子诊断的含义主要表现在虽然检测对象众多，但大多数标志物是特异性的肿瘤标志物正确答案：A34、实时荧光 PCR 中，GC 含量在 20%~80% (45%~55%最佳) ，单链引物的最适长度为A、35~50bpB、15~20bpC、55~70bpD、5~20bpE、70~90bp正确答案：B35、线粒体病分子生物学检验标志物不包括A、点突变位点B、重复序列C、SNP 位点D、缺失或插入片段E、线粒体单体型正确答案：B36、线粒体基因组编码几种rRNAA、22 种B、20 种C、18 种D、3 种E、2 种正确答案：E37、基因诊断间接方法不包括A、基于 SNP 的单倍型分析B、Southern blotC、基于 STR 的微卫星分析D、PCR-RFLPE、RFLP 连锁分析正确答案：B38、下列方法中不属于 RNA 诊断的是A、Northern blotB、RNA 斑点杂交C、基因芯片D、mRNA 差异显示 PCR 技术E、逆转录 PCR正确答案：C39、在对病原体检测中，一次性获得信息量最大的技术是 ( )A、ELISAB、荧光定量 PCR 技术C、PCR-RFLP 技术D、原位杂交技术E、基因芯片技术正确答案：E40、生物芯片根据芯片上固定的探针种类不同可分为几种，不包括：A、DNA 芯片B、蛋白质芯片C、细胞芯片D、组织芯片E、测序芯片正确答案：E41、以下不需要对引物或探针预先标记的实时定量 PCR 方法是A、TaqMan 水解探针技术B、探针杂交技术C、分子信标技术D、SYBR Green Ⅰ荧光染料技术E、数字 PCR 技术正确答案：D42、关于带正电荷尼龙膜的描述下列不正确的是A、可结合 DNAB、可结合 RNAC、对盐浓度要求不高D、核酸可通过 UV 交联共价结合E、本底较低正确答案：E43、可作为分子遗传标记的是A、HLAB、单拷贝序列C、高表达蛋白D、RFLPE、染色体正确答案：D44、下列关于人类遗传病的叙述不正确的是A、人类遗传病包括单基因遗传病、多基因遗传病和染色体异常遗传病B、21-三体综合症患者体细胞中染色体数目为 47 条C、单基因病是指受一个基因控制的疾病D、遗传性疾病既可以直接诊断，也可以间接诊断E、人类遗传病是指由于遗传物质改变而引起的疾病正确答案：C45、乙型肝炎病毒的核酸类型是 ( )A、双股 DNAB、负股 DNAC、正股 DNAD、单股 DNAE、DNA-RNA 二聚体正确答案：A46、目前白血病的发病机制的研究主要集中的领域不包括A、融合基因与白血病B、遗传学疾病及白血病发病的后天因素C、基因多态性与白血病D、白血病复发的后天因素E、白血病发病的先天因素正确答案：D47、镰状细胞贫血患者，代替其血红蛋白β链 N 端第六个氨基酸残基谷氨酸的是A、苯丙氨酸B、缬氨酸C、酪氨酸D、丙氨酸E、丝氨酸正确答案：B48、多重 PCR 的描述中正确的是：A、同一个模板，多种不同的引物B、相同的引物，多种不同的模板C、多个模板，多种引物D、引物的Tm 值、反应时间和温度、反应缓冲液等尽量不一致以区分不同产物E、同一反应内各扩增产物片段的大小应尽可能相同或接近正确答案：A49、GeneXpert 全自动结核杆菌检测技术现可进行哪种药物的耐药检测A、乙胺丁醇B、吡嗪酰胺C、异烟肼D、链霉素E、利福平正确答案：E50、目前确认与人类肿瘤发生有关的RNA 病毒是A、人乳头状瘤病毒B、乙型肝炎病毒C、EB 病毒D、人类疱疹病毒-8E、丙型肝炎病毒正确答案：E51、编码 HIV 衣壳蛋白的是A、tat 基因B、gag 基因C、env 基因D、vif 基因E、pol 基因正确答案：B52、下列不属于 SNP 检测技术特点的是 ( )A、遗传稳定性B、富有代表性C、密度低D、密度高E、易实现分析的自动化正确答案：C53、下列哪些技术不适用于鉴定菌种亲缘性：A、随机扩增DNA 多态性分析B、连接酶链反应C、PCR-RFLPD、多位点测序分型E、DNA 测序技术正确答案：B54、珠蛋白基因的碱基由G 突变为 C 时，造成的突变称为A、密码子缺失或插入B、单个碱基置换C、融合基因D、移码突变E、片段缺失正确答案：B55、HCV 基因分型的“金标准”是( )A、基因分型检测芯片B、测序分析法C、实时荧光 PCRD、基因型特异性引物扩增法E、RFLP正确答案：B56、核酸探针不可用什么标记A、放射性核素标记B、抗体标记C、生物素标记D、荧光标记E、地高辛标记正确答案：B57、第二代测序技术最主要技术特征是A、对单分子 DNA 进行非 PCR 的测序B、针对 SNP 进行非 PCR 的测序C、高通量和并行 PCR 测序D、直接分析 SNPE、直接进行个体基因组测序和 SNP 研究正确答案：C58、关于 Ct 值的描述，不正确的是A、Ct值是荧光定量 PCR 获得的最初数据资料B、Ct代表了反应达到预定设置的阈值时的循环次数C、Ct 与反应模板的初始模板量成正比D、Ct越小代表其模板核酸拷贝数越多E、Ct值处于扩增曲线和荧光本底基线的交叉点正确答案：C59、提取 DNA 的原则除外A、保证核酸一级结构完整性B、保留所有核酸分子C、核酸样本中不应存在有机溶剂和过高浓度的金属离子D、蛋白质、多糖和脂类分子的污染应降低到最低程度E、排除 RNA 分子的污染与干扰正确答案：B60、硝酸纤维素和PVDF 膜结合蛋白主要靠( )A、疏水作用B、氢键作用C、离子键作用D、盐键作用E、酯键作用正确答案：A61、以 mRNA 为模板合成 cDNA 的酶是A、DNA 酶B、Taq DNA 聚合酶C、限制性内切酶D、RNA 酶E、逆转录酶正确答案：E62、HIV 核酸类型是：A、单链 DNAB、双链 DNAC、单正链 RNAD、单正链 RNA 双聚体E、单负链 RNA正确答案：D63、采用了所谓酶联级联测序技术的测序方法是A、边合成边测序B、化学降解法测序C、双脱氧终止法测序D、焦磷酸测序E、寡连测序正确答案：D64、线粒体基因突变不包括A、mtDNA 拷贝数的变异B、碱基突变C、插入D、缺失E、重复序列增多或减少正确答案：E65、HIV 核酸类型是A、单链 DNAB、双链 DNAC、单正链 RNAD、单正链 RNA 双聚体E、单负链 RNA正确答案：D66、研究得最早的核酸分子杂交种类是( )A、菌落杂交B、Northern 杂交C、Southern 杂交D、液相杂交E、原位杂交正确答案：D67、PCR 中的脱氧核苷三磷酸不包括A、dATPB、dTTPC、dCTPD、dGTPE、dUTP正确答案：E68、PCR 反应的基本过程不包括A、预变性B、退火C、淬火D、变性E、延伸正确答案：C69、表达谱芯片A、是在 DNA 水平研究基因之间的表达关系B、是在 mRNA 水平研究基因之间的表达关系C、是在蛋白质水平研究基因之间的表达关系D、不能用于疾病机制的研究E、不能指导个体化治疗正确答案：B70、杂交时的温度与错配率有关，错配率每增加 1%，则 Tm 值下降A、1~1.5℃B、3~3.5℃C、0.5℃D、4~4.5℃E、2~2.5℃正确答案：A71、关于荧光原位杂交技术叙述不正确的是( )A、用荧光素标记探针B、用放射性核素标记探针C、无需经过核酸的提取D、可以用于遗传病的产前诊断E、可以用于基因定位正确答案：B72、以下不是在移植配型中常用的分子生物学检测技术是A、核酸分子杂交技术B、PCR 技术C、基因芯片技术D、免疫组化技术E、基因测序技术正确答案：D73、大多数质粒在自然状态下是( )A、线性双链 DNAB、线性单链 DNAC、线性单链 RNAD、环状双链 DNAE、环状单链 DNA正确答案：D74、珠蛋白生成障碍性贫血的主要原因是A、珠蛋白基因突变导致氨基酸序列改变B、血红蛋白破坏加速C、出现异常血红蛋白 SD、铁代谢异常E、珠蛋白链合成速率降低正确答案：E75、关于分子信标技术的描述，不正确的是A、分子信标设计简单B、操作简便C、背景信号低D、特异性强E、灵敏度高正确答案：A76、下述序列中，在双链状态下属于完全回文结构的序列是A、AGTCCTGAB、AGTCAGTCC、AGTCGACTD、GACTCTGAE、ACTCGACT正确答案：C77、PCR 反应的基本过程不包括以下：A、预变性B、退火C、探针杂交D、变性E、延伸正确答案：C78、最容易降解的核酸探针是A、cDNA 探针B、dsDNA 探针C、ssDNA 探针D、gDNA 探针E、RNA 探针正确答案：E79、Southern 杂交通常是指( )A、DNA 与 RNA 杂交B、DNA 与 DNA 杂交C、RNA 与 RNA 杂交D、蛋白质与蛋白质杂交E、DNA 与蛋白质杂交正确答案：B80、不属于移植配型中常用的分子生物学检测技术是 ( )A、RFLP/PCR-RFLP/PCR-SSPB、PCR-SSCPC、PCR-SequencingD、PCR-SSO/基因芯片技术E、FISH正确答案：E81、不是自动 DNA 测序仪主要系统之一的是A、测序反应系统B、电泳系统C、荧光检测系统D、探针荧光标记系统E、电脑分析系统正确答案：D82、下列关于Taq DNA 聚合酶的描述，错误的是A、以 dNTPs 为原料B、催化形成3’,5’-磷酸二酯键C、使 DNA 链沿5’→3’方向延伸D、不具有3’→5’外切酶活性E、扩增的DNA 片段越长，碱基错配率越低正确答案：E83、关于 RNA 探针的描述下列不正确的是A、可用于随机引物标记B、特异性高C、灵敏度高D、可用非同位素标记法标记E、不易降解正确答案：E84、关于mtDNA 的描述正确的是A、结构基因编码 mtDNA 复制所需的酶、调控蛋白、NADH 氧化还原酶、ATP 酶等B、重链有编码功能，轻链无编码功能C、含 22 个结构基因D、含 tRNA 基因，可转录 22 种 tRNA，以满足线粒体内蛋白质翻译的需要E、含 rRNA 基因，编码 2 种 rRNA，即 12SrRNA 和 18SrRNA正确答案：D85、要制订一个能够简洁准确的 DNA 测序方案，首先应考虑A、DNA 片段大小B、测序方法C、实验条件D、测序目的E、测序时间正确答案：E86、Alu家族属于A、可变数目串联重复序列B、短串联重复序列C、长散在核原件D、短散在核原件E、DNA 转座子正确答案：D87、寡核苷酸探针的最大的优势是A、杂化分子稳定B、易标记C、易合成D、可以区分仅仅一个碱基差别的靶序列E、易分解正确答案：D88、细菌感染分子生物学检验的检验对象是A、测定血清中抗体抗原B、测定血清中病原体蛋白含量C、测定样本中核酸含量D、镜检病原体形态E、测定血清中蛋白酶活性正确答案：C89、肺癌的分子生物学检验的意义不包括A、可以较早的发现微小转移的癌灶B、有利于肺癌的早期诊断C、可以减轻肺癌患者化疗的不良反应D、帮助降低肺癌患者的病死率E、可以对肺癌患者的预后作出评估正确答案：C90、转录依赖扩增系统与其他 PCR 技术的区别是A、模板是 RNAB、模板是 DNAC、引物是 RNAD、模板和产物都是 RNAE、需要热循环正确答案：D91、下列病毒中，基因组可直接作为mRNA 的 3 种病毒是A、脊髓灰质炎病毒、柯萨奇病毒、流感病毒B、脊髓灰质炎病毒、AIDS 病毒、麻疹病毒C、脊髓灰质炎病毒、甲型肝炎病毒、新型肠道病毒D、脊髓灰质炎病毒、乙型肝炎病毒、轮状病毒E、脊髓灰质炎病毒、麻疹病毒、甲型肝炎病毒正确答案：C92、一种标记核酸与另一种核酸单链进行配对形成异源核酸分子的双链，这一过程称A、复杂性B、探针C、杂交D、复性E、变性正确答案：C93、荧光原位杂交的描述正确的是A、快速确定是否存在目的基因B、检测靶分子是 RNAC、用于基因定位分析D、用于阳性菌落的筛选E、用于蛋白水平的检测正确答案：C94、对于寡核苷酸探针，杂交温度一般低于其 Tm 值A、10~15℃B、20~30℃C、15~30℃D、30~40℃E、5℃正确答案：E95、最常用的 DNA 探针标记方法是A、随机引物标记B、切口平移标记C、3’-末端标记D、5’-末端标记E、PCR 法正确答案：A96、结核杆菌的分子生物学检验临床意义中不包括A、疗效评价B、早期诊断C、耐药检测D、快速诊断E、鉴别诊断正确答案：B97、决定 PCR 反应特异性的是A、模板B、dNTPC、引物D、缓冲液E、Taq DNA 聚合酶正确答案：C98、关于核酸探针的描述下列不正确的是A、可以是 DNAB、可以是 RNAC、可用放射性标记D、可用非放射性标记E、必须是单链核酸正确答案：E99、关于单基因遗传病的叙述，正确的是A、原发性高血压是单基因遗传病B、发病机制都已阐明C、可进行定性诊断和定量诊断D、在群体中发病率高E、受多对等位基因控制正确答案：C100、引起镰状细胞贫血的珠蛋白基因突变类型是A、错义突变B、终止密码突变C、整码突变D、无义突变E、移码突变正确答案：A。
核酸探针
核酸杂交：不同来源的两条核酸单链由
于具有互补序列，在一起复性时，互补 序列配对，形成杂化分子。
+ +
14
15
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二、影响杂交的因素 1. 核酸分子的浓度和长度 2. 温度：比Tm低25℃~30℃较适宜
3. 离子强度：离子强度↑→杂交反应率↑
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4. 杂交液中的甲酰胺
甲酰胺能降低核酸杂交的Tm， 含30%—50%甲酰胺的杂交溶液温度能 降低到30—42℃。 使用甲酰胺的优点：
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1. Southern 印迹杂交 主要步骤：
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纯化的待测DNA样品 限制性内切酶酶切后（EDTA， 65℃灭活限制酶） 琼脂糖凝胶电泳分离酶切DNA片段 变性液（碱变性）
凝胶上DNA变性
Tris缓冲液 中和 高盐下
预杂交 杂交 放射自显影 结果分析
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DNA转印至NC膜
烘干、固定
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southern印迹
3
DNA的变性(denaturation)：
在某些理化因素作用下，DNA 分子内碱基对之间的氢键断裂，使 规则有序的双螺旋结构变为不规则 无序的单链线团样结构的过程。
4
5
解链温度（融解温度，Tm） (melting temperature)：
使50%的DNA发生变性时的环 境温度。 DNA的变性从开始解链到完全 解链是在一个相当窄的温度内完成 的。
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2. 特性： ①检测特异性强； ②灵敏度高； ③对酶促反应无任何影响，也不影响碱 基配对的特异性和稳定性；
④易造成放射性污染；
⑤半衰期短的同位素应用受到限制，随用 随标记，立即使用，不能长时间存放。
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3. 探针标记的方法 ①缺口平移法（nick translation） 实质：用 [α-32P]dNTP取代原来 DNA链 中不带同位素的同种核苷酸，生成的两 条链均被同位素标记。
核酸探针技术
核酸探针技术化学及生物学意义上的探针(probe)，是指与特定的靶分子发生特异性相互作用，并可被特殊的方法探知的分子。
抗体-抗原、生物素-抗生物素蛋白、生长因子-受体的相互作用都可以看作是探针与靶分子的相互作用。
核酸探针技术原理是碱基配对。
互补的两条核酸单链通过退火形成双链，这一过程称为核酸杂交。
核酸探针是指带有标记物的已知序列的核酸片段，它能和与其互补的核酸序列杂交，形成双链，所以可用于待测核酸样品中特定基因序列的检测。
每一种病原体都具有独特的核酸片段，通过分离和标记这些片段就可制备出探针，用于疾病的诊断等研究。
(一) 核酸探针的种类1.按来源及性质划分可将核酸探针分为基因组DNA探针、cDNA探针、RNA 探针和人工合成的寡核苷酸探针等几类。
作为诊断试剂，较常使用的是基因组DNA探针和cDNA探针。
其中，前者应用最为广泛，它的制备可通过酶切或聚合酶链反应(PCR)从基因组中获得特异的DNA后将其克隆到质粒或噬菌体载体中，随着质粒的复制或噬菌体的增殖而获得大量高纯度的DNA探针。
将RNA进行反转录，所获得的产物即为cDNA。
cDNA探针适用于RNA病毒的检测。
cDNA探针序列也可克隆到质粒或噬菌体中，以便大量制备。
将信息RNA(mRNA)标记也可作为核酸分子杂交的探针。
但由于来源极不方便，且RNA极易被环境中大量存在的核酸酶所降解，操作不便，因此应用较少。
用人工合成的寡聚核苷酸片段做为核酸杂交探针应用十分广泛，可根据需要随心所欲合成相应的序列，可合成仅有几十个bp的探针序列，对于检测点突变和小段碱基的缺失或插入尤为适用2.按标记物划分有放射性标记探针和非放射性标记探针两大类。
放射性标记探针用放射性同位素做为标记物。
放射性同位素是最早使用，也是目前应用最广泛的探针标记物。
常用的同位素有32P、3H、35S。
其中，以32P应用最普遍。
放射性标记的优点是灵敏度高，可以检测到Pg级；缺点是易造成放射性污染，同位素半衰期短、不稳定、成本高等。
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四、探针标记物的选择 理想的标记物： ①具有高度的灵敏性 ②与探针结合后，不影响杂交及探针的主 要理化特性 ③检测方法高灵敏性、高特异性，假阳性率 低，环境污染少，价格低廉；
④若用酶促方法标记，应对Km影响不大
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（一）常用的放射性标记物
1. 常用探记探针的同位素：
32P、3H、35S、14C、125I、131I
30
31
②随机引物法（random priming）
人工合成的6~8个核苷酸长的各种不同排列 顺序的混合物，它们可以随机地互补到 DNA探针的某一处，作为引物，在Klenow 片段作用下，合成与探针DNA互补的DNA 链，当在反应液中加入[α-32P]dATP时，即 可形成放射性同位素标记的DNA探针，但 探针DNA序列是长短不等的。
11
1. 常用的变性方法： ① 热变性
② 酸碱变性
③ 化学试剂变性
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2. 影响复性的因素 ① 序列简单的分子复性快，如poly(dT)和poly(dA) 识别快 ② DNA片段愈大，扩散速度愈低，复性慢 ③ 离子强度↑→有利于复性 ④ DNA浓度↑→复性↑ Tm值的估算 ① <20bp Tm=4（G+C）+2（A+T） ② >20bp Tm=69.3+0.41(G+C)% ③ Tm=81.5℃+16.6lgM+0.41（G+C）% -500/n-0.61×（甲酰胺%）
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4. 寡核苷酸探针 优点：①可根据需要合成相应序列； ②探针短,序列复杂性低,分子量小， 因此杂交时间短; ③长 度只有10—50bp，该识别序 列内1个碱基的变化可明显降低杂 交Tm值。 ④可大量合成，价格低，能够用酶 学或 化学方法进行非放射性标记。
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三、探针设计原则：
①长度：10~50bp ②碱基成分:G+C含量为40%~60% ③探针分子内无互补序列。 ④避免同一碱基重复出现。 ⑤ 一旦选定某一序列后，尚需与已知的各种基因 序列进行同源性比较，与非靶区域的同源性不应 超过70%或有连续8个或更多的碱基同源。
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核酸杂交：不同来源的两条核酸单链由
于具有互补序列，在一起复性时，互补 序列配对，形成杂化分子。
+ +
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二、影响杂交的因素 1. 核酸分子的浓度和长度 2. 温度：比Tm低25℃~30℃较适宜
3. 离子强度：离子强度↑→杂交反应率↑
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4. 杂交液中的甲酰胺
甲酰胺能降低核酸杂交的Tm， 含30%—50%甲酰胺的杂交溶液温度能 降低到30—42℃。 使用甲酰胺的优点：
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2. 特性： ①检测特异性强； ②灵敏度高； ③对酶促反应无任何影响，也不影响碱 基配对的特异性和稳定性；
④易造成放射性污染；
⑤半衰期短的同位素应用受到限制，随用 随标记，立即使用，不能长时间存放。
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3. 探针标记的方法 ①缺口平移法（nick translation） 实质：用 [α-32P]dNTP取代原来 DNA链 中不带同位素的同种核苷酸，生成的两 条链均被同位素标记。
6
7
增色效应：
DNA变性后对 260nm紫外光收 增加的现象。
8
DNA的复性（renaturation)：
在适当条件下，变性DNA的两条 互补链可再恢复成天然的双螺旋结 构的过程。 热变性的DNA经缓慢冷却后即可复 性，此过程称为退火(annealing)。
9
10
减色效应：
变性DNA复性后 对260nm紫外光 吸收减少的现象。
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第二节 核酸探针
一、探针的选择原则 1. 高度的特异性 2. 制备探针的难易性和检测手段的灵敏法 二、探针的种类
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1.体连接（质粒、噬菌体）
↓
克隆(PCR扩增)
↓
酶切 优点：①无性繁殖、制备方法简单；②不易降解 （与RNA比较）；③标记方法成熟。
3
DNA的变性(denaturation)：
在某些理化因素作用下，DNA 分子内碱基对之间的氢键断裂，使 规则有序的双螺旋结构变为不规则 无序的单链线团链温度（融解温度，Tm） (melting temperature)：
使50%的DNA发生变性时的环 境温度。 DNA的变性从开始解链到完全 解链是在一个相当窄的温度内完成 的。
优点：比活度高，结果稳定
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③用T4多核苷酸激酶标记DNA5ˊ末端
5ˊ-pCpGpApCpG-3ˊ 碱性磷酸酶(AKP） 5ˊ-HOCpGpApCpG-3ˊ [γ-32P]ATP T4噬菌体多核苷酸激酶（PNK）
5ˊ-32PCpGpApCpG-3ˊ
34
④Klenow片段快速标记DNA探针末端 用枯草杆菌蛋白酶切割可得两条多肽链 N— 5ˊ→3ˊ外切酶 小片段(36000)
①低温下探针更稳定； ②能更好地保留非共价结合的核酸。
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注意： ①待测核酸顺序与探针顺序同源性高 的杂交，用水溶液时取68℃，用50% 甲酰胺溶液时取40℃。 ②待测核酸顺序与探针同源性不高时， 以50% 甲酰胺溶液在35—40℃杂交。
19
5. 核酸分子的复杂性直接影响复性几率。 6. 非特异性杂交反应：在杂交前将非特异 性位点进行封闭，以减少对探针的非特异 性吸附作用。 常用封闭物： ①变性非特异DNA：鲑鱼精子DNA， 小牛胸腺DNA ②高分子化合物：Denhardt溶液 脱脂奶粉
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2. cDNA探针（complementary DNA）
通过逆转录 ↓ 双链cDNA 优点： 不含内含子及高度 重复序列但不易获得 ↓S1核酸酶切平两端 加接头 ↓限制酶 粘性末端 ↓ 载体连接 ↓ 克隆
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3. RNA探针：检测DNA和mRNA 优点：杂交效率高，稳定性高，非特异性 杂交较少,未杂交探针可用RNase 降解，减少本底的干扰。 缺点：易降解，标记方法复杂
第五章 核酸探针技术检测 食品微生物
1
核酸分子杂交（nucleic acid hybridization）
指具有互补序列的两条核酸单链在一定条 件下按碱基配对原则形成双链的过程。
不同来源的DNA或RNA单链在一定条件下 重新组成的新的双链分子——杂交分子。
2
第一节 核酸探针杂交的基本理论 一、变性与复性