核酸分子探针
第十二章 核酸探针检测技术
现代食品检测技术第二部分第12章核酸探针检测技术赵杰文邹小波江苏大学食品与生物工程学院第十二章核酸探针检测技术1 核酸探针的种类及其制备方法2 探针标记物与标记方法3 探针杂交与信号检测4 核酸探针在食品微生物检测中的应用1核酸探针的种类及其制备方法一、基因组DNA探针二、cDNA探针三、RNA探针四、寡核苷酸探针一、基因组DNA探针这类探针多采用分子克隆或PCR技术从基因文库筛选或扩增方法制备。
二、cDNA探针cDNA探针是以RNA为模板，在反转录酶的作用下合成的互补DNA，因此它不含有内含子及其他非编码序列，是一种较理想的核酸探针。
三、RNA探针mRNA作为核酸分子杂交的探针是较为理想四、寡核苷酸探针用人工合成的寡聚核苷酸片段作为分子杂交的探针，其优点是可根据需要随心所欲地合成相应的序列，避免了天然核酸探针中存在的高度重复序列所带来的不利影响2 探针标记物与标记方法一、核酸探针标记物种类及其特点二、探针标记方法三、探针的纯化四、探针标记效率的评估一、核酸探针标记物种类及其特点 标记探针的目的是为了跟踪探针的去向，确定探针是否与相应的基因组DNA杂交一、核酸探针标记物种类及其特点 一种理想的探针标记物，应具备以下几种特性：1、高度灵敏性；；2、标记物与核酸探针分子的结合；；3、应不影响探针分子的主要理化特性；4、当用酶促方法进行标记时，应对酶促活性(Km值)无较大的影响；5、检测方法除要求高度灵敏性外，还应具有高度特异性二、探针标记方法（一）探针的放射性核素标记法（二）探针的非放射性标记法（一）探针的放射性核素标记法1．缺口平移法2．随机引物法3．单链DNA探针的标记4．cDNA探针的标记5．寡核苷酸探针的标记缺口平移法（二）探针的非放射性标记法1．PCR标记法2．体外转录标记RNA探针PCR标记法体外转录标记RNA探针三、探针的纯化（一）凝胶过滤柱层析法（二）反相柱层析法（三）乙醇沉淀法四、探针标记效率的评估通过测定标记产物的量来估计每一次标记反应的效率，这可以准确了解杂交液中应加探针的量。
分子信标：新型核酸分子探针要点
分子信标：新型核酸分子探针摘要：分子信标是基于荧光共振能量传递原理设计的一种发夹型寡聚核酸分子荧光探针，能够与待测核酸序列分子相互作用发生结构变化产生不同强度的荧光信号及电化学信号等，具有高灵敏度、高选择性、适于活体检测等优点。
本文介绍了分子信标的作用原理，不同的分子信标类型以及应用，最后对前景作出了预测。
关键词：分子信标荧光探针灵敏度选择性活体检测引言：从20世纪60年代初至今，分子信标（Molecular beacon,MB）已被广泛地应用于生物、药物、化学等多个领域【1,2,3,4】。
近年来，MB特别是基于DNA结构的MB，已成为一种重要工具，用于核酸的复制、重组、翻译和表达的研究【5,7,12】。
为了满足后基因组时代的发展需求，人们通过各种分子工程策略，发展了许多敏锐性更高、选择性更优的MB。
自从1996年Tyagi和Krame【6】首次建立了分子信标探针，由于其独特的性质和多功能性，如操作简单、灵敏度高、特异性强等。
在它出色地完成了液相靶标测定(实时PCR测定)任务之后，人们又将其应用于核酸实时定量测定、活体分析、化学与生物传感、疾病基因检测与诊断等研究中【8,9,10,11】。
又由于易于对其进行修饰和改性，在这十来年的发展中，人们在经典分子信标模型的基础上，设计出了许多新型的分子信标，如无茎分子信标，用PNA【13】链代替ssDNA形成的PNA分子信标，以及LNA分子信标等。
这些新型的分子信标是为了满足不同的需要而设计的，特异性更强，稳定性更好，为许多新的研究领域提供了一个平台。
为了满足基因组学和蛋白质组学的发展，对分子信标的固定化也成了必然的发展趋势，自从谭蔚泓【14】首次将分子信标固定在硅胶上以来，固定化分子信标也迅速发展起来。
尤其是后来设计的将分子信标固定在金表面【15,16】，利用金的强摩尔消光系数进行淬灭，简化了分子信标的设计，更加方便对其进行操作，大大促进了基因微阵列技术的发展。
3043-现代药理学实验方法与技术简介
第一章现代药理学实验方法与技术简介第一节分子生物学试验方法与技术分子生物技术在药理学实验中应用较为广泛，包括核酸分子探针的标记、核酸分子杂交、多聚酶链反应、蛋白印迹杂交技术、cDNA文库、随机分子库技术、外核基因在真核细胞中的表达、转基因动物、人类基因治疗等。
现将更为常用的技术介绍如下：一、核酸分子探针的标记标记核酸分子探针（nucleic acid probe）是进行核杂交的基础，根据核酸分子探针的来源及性质进行选择，选择的基本原则是具有高度的特异性，探针选择直接影响杂交结果的分析。
根据检测对象和目的不同，，可选择不同的探针种类及标记方法。
㈠探针种类1．基因组DNA探针是克隆化的各种基因片断，也是最常用的核酸探针，探针应尽可能选用基因编码（外显子），避免使用内含子及其它非编码序列。
2．cDNA探针与mRNA互补的DNA链称cDNA，是一种较为理想的核酸探针，特异性较高。
3．RNA探针RNA与RNA或DNA杂交体的探针稳定性，特异性高。
4．寡核苷酸探针人工合成寡核苷酸片段做探针，可根据需要合成相应序列。
㈡标记物常用的探针标记物有两类：放射性同位素和非放射性同位素。
标记物的检测具有高度灵敏性和特异性。
标记和探针结合不影响杂交的特异性和稳定性。
其中放射性同位素是应用最多的探针标记物，但易造成放射性污染，多数同位素的半衰期短，不能长期存放。
常用的放射性同位素有32P¸3P¸35S，有时也用14C,125I或131I。
二、核酸分子杂交（nucleic acid hybridiazation ）是指具有一定同源序列的两条核酸单链在一定的条件下，按碱基互补配对原则形成异质双链的过程。
核酸分子杂交是分子生物学领域应用最广泛的技术，灵敏度高、特异性强，主要用于特异DNA或RNA的定性定量检测。
三、聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）是一种体外酶促扩增特异DNA片段的方法。
如何自制核酸探针
如何自制核酸探针？什么是核酸探针？核酸探针是能与特定的靶分子发生特异性结合的一段核苷酸分子。
通过在核酸探针上连接一些小分子化合物，如生物素、荧光素、地高辛等，或者放射性同位素标记核苷酸，可以达到检测靶基因序列和纯化的目的。
这一过程被称为核酸杂交。
其原理是碱基互补的两条核酸分子退火形成双链。
探针应用核酸探针技术作为分子生物学中最常见的技术之一，是印记杂交，原位杂交，实时荧光PCR，microarray（微阵列）等技术不可或缺的组成部分。
探针技术能定性或者检测特异性DNA/RNA序列，还可用于病原微生物和寄生虫的检测，疾病诊断等领域。
探针制备探针标记主要分为放射性和非放射性标记法。
探针制备流程如图1所示。
Southern印迹、Northern印迹等需要较长的DNA探针，常使用缺口平移法和随机引物法进行标记。
而这些方法对于较短的DNA（200 bp以下）来说，效率很低，常使用末端标记法。
除了这三种方法，常见的还有PCR标记法。
图1. 探针制备流程。
随机引物法随机引物法的原理是利用随机引物（random primer，即DNA 水解、分离得到的六聚脱氧核苷酸作）与单链DNA随机互补结合，在Klenow大片段酶的作用下，合成互补链，直至下一个引物。
如果模板是RNA，则使用反转录酶。
随机引物法可以使标记均匀跨越探针全长。
相比于缺口平移法，探针的活性更高，但是产量相对较低。
图2. 随机引物法的原理。
Protocol试剂：[α-32P]dCTP (3000Ci/mmol), dATP,dTTP,dGTP (5 mmol/L),Klenow大片段（2U/uL），模板，随机引物，NA终止/贮存缓冲液（50 mmol/L Tris-Cl (pH 7.5)，50 mmol/L NaCl，5 mmol/L EDTA (pH 8.0)，0.5% (m/V) SDS）5X 随机引物缓冲液（250 mmol/L Tris (pH 8.0)，25 mmol/L MgCl2，100 mmol/L NaCl，10 mmol/L 二琉苏糖醇（DTT)，1 mol/L HEPES ( 用 4 mol/L NaOH 调至 pH 6.6），1 mol/L DTT 贮存于 -20℃，临用前用水稀释，使用后弃去稀释的 DTT。
核酸探针的名词解释
核酸探针的名词解释
嘿，咱今天就来聊聊核酸探针这玩意儿！你知道吗，核酸探针就像
是一个超级侦探，专门去寻找特定的核酸序列。
比如说吧，就好像你
在一个超级大的图书馆里找一本特定的书，核酸探针就是那个能精准
找到那本书的小能手！
它是一小段经过标记的核酸分子，这个标记就像是给它装上了一个
闪闪发光的信号灯。
然后呢，它就可以和目标核酸序列特异性地结合。
这就好比是一把钥匙开一把锁，可准了呢！
咱举个例子啊，想象一下，细胞里面的核酸就像是一群人，而核酸
探针就是那个能准确找到特定那个人的高手。
它能一下子就抓住目标，然后通过那个标记，让我们知道它找到了。
核酸探针的作用可大了去了！它可以用来检测病毒、细菌，还能在
基因诊断中发挥重要作用。
比如说，当我们怀疑身体里有某种病毒的
时候，核酸探针就能快速地找到它，告诉我们是不是真的有。
这多厉
害啊！
在科学研究中，核酸探针也是不可或缺的。
研究人员用它来探索基
因的功能，就像探险家在未知的领域寻找宝藏一样。
你说，核酸探针是不是超级神奇？它就像是一个默默无闻却又超级
厉害的小英雄，在我们看不见的地方发挥着巨大的作用。
总之，核酸探针就是那个能在核酸世界里精准定位、发挥关键作用的神奇存在！它是现代生物学和医学的重要工具，为我们解开生命的奥秘提供了有力的支持。
没有它，很多事情我们可都没法做呢！。
简述核酸分子探针的分类和标记方法
简述核酸分子探针的分类和标记方法下载提示：该文档是本店铺精心编制而成的，希望大家下载后，能够帮助大家解决实际问题。
文档下载后可定制修改，请根据实际需要进行调整和使用，谢谢！本店铺为大家提供各种类型的实用资料，如教育随笔、日记赏析、句子摘抄、古诗大全、经典美文、话题作文、工作总结、词语解析、文案摘录、其他资料等等，想了解不同资料格式和写法，敬请关注！Download tips: This document is carefully compiled by this editor. I hope that after you download it, it can help you solve practical problems. The document can be customized and modified after downloading, please adjust and use it according to actual needs, thank you! In addition, this shop provides you with various types of practical materials, such as educational essays, diary appreciation, sentence excerpts, ancient poems, classic articles, topic composition, work summary, word parsing, copy excerpts, other materials and so on, want to know different data formats and writing methods, please pay attention!核酸分子探针是一种用于检测和识别特定核酸序列的工具，它在生物学研究、医学诊断和药物开发中具有重要作用。
核酸分子探针
DNA双螺旋结构模型的提出标志现代分子生物学的诞生。
DNA分子的特点：
稳定性：脱氧核糖和磷酸交替 连接方式不变，碱基配对原则不 变，可反复变性和复性。
多样性：DNA分子碱基对的排列 顺序千变万化，一天n个碱基的 DNA分子排列方式有4n种。
特异性：基于碱基配对原则， DNA能特异性识别与其完全互补的 DNA或RNA序列。 合成和标记简单且已经自动化 和市场化。
Analytical Chemistry, 2009, 81(6): 2144-2149
G-quadruplex–aptamer as a drug delivery carrier
Angew. Chem. Int. Ed. 2011, 50, 6098 –6101
2.1 作为生物催化剂（核酶）---核酶探针
尺度和量的概念
红细胞: 6,000-9, 000nm 白细胞: 10,000nm 一般细菌: 1,000 – 10,000 nm 一般病毒: 75 – 100 nm 蛋白质： 5 – 50 nm DNA (双链宽) ： 2 nm
谋求灵敏、准确地在分子层面，以致在活体内，将生物分子的成分、结构、相互作用 等信息转变为易于检测的光、电等信号变化。
6. 临床应用等
1.1 Watson-Crick碱基互补配对—分子信标
目标 DNA
分子信标是个呈发夹结构、设计十分巧妙的短链 DNA 分子。由于它特殊的结构，自 从1996年被首次合成出来以后，它已经被非常广泛地应用于PCR定量、基因分型、基 因芯片、活细胞内mRNA分析以及蛋白质（酶）研究等领域。
•靶分子
•Designer DNA/RNA •ATP 核酸适配体
小分子ATP aptamer Aptamer辅助的量子点自组装用于ATP的荧光传感
核酸探针技术及应用
核酸探针技术及应用基因检测技术的发展，使对某些疾病的诊断达到了特异性强、敏感性高及简便快速的目的。
近年来各种血清学方法发展很快，但血清学方法主要是测抗体，是间接的证据随着分子生物学的发展，应用DNA—DNA杂交建立了核酸探针(Probe)技术，该技术是目前基因检测最常用的方法，目前已成为诊断各种感染性疾病，恶性肿瘤，遗传病，检测抗生紊的耐药性，法医学鉴定及从分子水平上研究发病机制与流行病学规律等方面的一种重要手段。
本文主要介绍了核酸探针技术的原理，核酸分子杂交方法及核酸探针的应用等方面。
一、核酸探针技术的原理DNA 或RNA 片段能识别特定序列基因的DNA 片段，能与互补的核苷酸序列特异结合，这种用同位素非同位素标记的单链DNA片段即为核酸探针。
核酸探针技术是将双链DNA 经加热或硷处理，使硷基对间的氢链被破坏而变性，解开成两条互补的单链。
它们在一定温度和中性盐溶液条件下，又可按A—T，G—C碱基配对的原则重新组合成双链为复性。
这种重组合只是在两股DNA是互补(同源)或部分互补(部分同源)的条件下才能实现。
正是由于双链DNA的这种可解离与重组合的性质，才可用一条已知的单链DNA，用放射性同位素或其他方法标记后制备成核酸探针，与另一条固定在硝酸纤维素滤膜上的变性单链DNA进行杂交，(另一条DNA链与核酸探针是配对碱基，称为靶)再用放射自显影或其他显色技术检测，以确定有无与探针DNA (或RNA)同源或部分同源的DNA(或RNA)存在。
因为探针只与靶病原体的DNA或RNA杂交，而不与标本中存在的其他DNA 或RNA 杂交。
二、核酸探针技术的基本方法被检标本用去污剂和酶分解以去除非DNA成分或直接提取DNA，用各种方法处理DNA使其变性，把DNA双螺旋的两条链分开，单链DNA结合于固态基质上，(如滤膜)使其固定。
再加上已制备好的探针进行杂交，探针便可找出已固定的DNA中的互补序列，与之配对结合，然后洗掉未结合部分，由于探针已将放射性同位素掺入，再用x射线敏感的胶片自显影，见黑色影印者即为阳性。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
红细胞: 6,000-9, 000nm
白细胞: 10,000nm
一般细菌: 1,000 – 10,000 nm
一般病毒: 75 – 100 nm
蛋白质： 5 – 50 nm
DNA (双链宽) ： 2 nm
谋求灵敏、准确地在分子层面，以致在活体内，将生物分子的成分、结构、相互作用 等信息转变为易于检测的光、电等信号变化。
600
J. Huang, K. Wang, W. Tan, et al. Anal. Chem. 2010, 82, 10158
Cell aptamer
细胞膜蛋白触发构型变化的激活式核酸适体探针，用于肿瘤活体荧光成像。 检测原理示意图
创新性提出了“激活式核酸适体探针” 概念，该探针与传统 “always on”核酸适体 探针相比，有效降低了非特异性背景信号， 在肿瘤部位产生了更高的对比度并大大缩短 诊断时间，有望为实现肿瘤早期诊断提供一 种更为灵敏的检测方法。
分子信标的工作原理：
E: FRET效率 R: 荧光给体与受体之间的距离
无靶标存在下，茎环结构使得荧光基团和淬灭基团相互靠近，发生FRET，荧 光淬灭。加入靶序列后，分子信标环部与之互补配对形成刚性并且更稳定的 双链杂交体，使荧光基团和淬灭基团距离增大，阻止FRET发生，荧光恢复。
K. Wang, W. Tan, et al. Angew. Chem. Int. Ed. 2009, 48, 856
PNAS, 2006, 113, 11838
分子信标用于果蝇卵母 细胞内mRNA成像
PNAS, 2003, 100, 13308
• CRE-decoy aptamer 治疗乳腺癌 的效果要显著地优于tamoxifen。
• 抗VEGF aptamer (Macugen) 已 被用于老年性黄斑变性的临床治 疗。
A
Molecular Beacon
Oligo A Oligo
Hybrid
B
NTFS
Binding
Ligation
B
Fluorescence Intensity
500000 400000 300000
2.3
0.23
0.115 6.9X10-2 2.3X10-2 1.2X10-2 6.9X10-3 2.3X10-3
杂交链式反应用于DNA的比色检测 --- Watson-Crick碱基互补配对
P. Liu, X. Yang, K. Wang, et al. Anal. Chem. 2013, 85, 7689−7695
Watson-Crick碱基互补配对启发的自组装构型开关用于核酸杂交调控
L. He, X. Yang, K. Wang, et al. Chem. Commun., 2014, 50, 7803--7805
核酶（Ribozyme）是具有催化功能的RNA分子，是生物催化剂，可降解特定RNA序 列。它的发现打破了酶是蛋白质的传统观念。有一些DNA分子同样具有催化功能。 1981年由Cech等人在研究四膜虫前体rRNA拼接机制时发现，并因此获得1988年诺 贝尔化学奖。
如上图，由于DNAzyme与底物链发生分子内杂交, 荧光基团与猝灭基团相互靠近, 导致荧光猝灭. 当Pb2+存在时, DNAzyme被激活, 底物链被切断后释放出荧光基团 标记的DNA片段, 从而产生明显的荧光信号. 据此可在常温下快速检测Pb2+, 检测 下限为10 nmol/L.
2.2 与蛋白酶发生特异性相互作用---核酸片段检测（NTFS） 平台技术
（Nucleic Acid Res., 2003, 31, e148; Nucleic Acid Res., 2005, 33, e97；Analyst, 2005,130,350-357; Anal. Biochem., 2006, 353, 141-143; Biomedical Photonics Handbook, 2003, p57-1~57-23, ）
•靶分子
•核酸适配体
•ATP 核酸适配体
•Designer DNA/RNA
小分子ATP aptamer Aptamer辅助的量子点自组装用于ATP的荧光传感
J. Liu, X. Yang*, K. Wang*, et al. Anal. Chem. 2013, 85, 11121−11128
肌红蛋白 aptamer 正/反筛集成的微流控芯片用于肌红蛋白aptamer的筛选
5. 与纳米结构结合，用于肿瘤等的成像和治疗研究
6. 临床应用等
核酸分子探针的进展， 已经能在单个活细胞，甚 至单分子水平上观测分子 的行为，为细胞信号转导 的活体、实时、在线研究 提供了条件。
核酸分子探针的发展 不仅促进了检测手段的变 革，还带来了巨大的经济 和社会效益。
核酸适体用于肿瘤 细胞的识别
Q. Wang, X. Yang*, K. Wang*, et al. Anal. Chem. 2014, 86, 6572−6579
溶菌酶aptamer
将aptamer序列嵌入到分子信标的互补链，与目标识别时发生竞争反应，可以 引起构型变化，分子信标恢复发夹结构，释放信号。
5x106
Fluorescence Intensity (CPS)
4x106 3x106 2x106 1x106
0 350
400
450
500
550
Wavelength (nm)
[L ysozyme] 500 nM 200 nM 100 nM 50 nM 20 nM 10 nM 5 nM 2 nM 1 nM 0.8 nM 0.5 nM 0.2 nM 0.1 nM 0 nM
杂交链式反应用于DNA的高灵敏检测 --- Watson-Crick碱基互补配对
Fluorescence Intensity (a.u.)
40
35Leabharlann 302520
15
10
5
0
350
400
450
500
550
600
650
Wavelength (nm)
J. Huang, K. Wang, W. Tan, et al. Angew. Chem. Int. Ed. 2011, 50, 401
•荷电性 •负电 •负电 •中性 •负电
•非特异性结合 •高 •高 •低 •底
•毒性 •高毒性 •低毒性 •低毒性 •无毒性
4. 核酸适配体 Aptamar----”Chemical Antibody”
Theoretically, anything we use antibodies today (for molecular recognition, molecular interaction, diagnosis, and therapeutical) can be replaced with synthetic DNA probes which can be prepared reproducibly in our labs using a DNA synthesizer.
G-quadruplex–aptamer as a drug delivery carrier
Analytical Chemistry, 2009, 81(6): 2144-2149 Angew. Chem. Int. Ed. 2011, 50, 6098 –6101
2.1 作为生物催化剂（核酶）---核酶探针
1962年，沃森、克里克和威尔 金斯获得诺贝尔生理学或医学奖
D。NA双螺旋结构模型的提出标志现代分子生物学的诞生。
DNA分子的特点：
➢ 稳定性：脱氧核糖和磷酸交替 连接方式不变，碱基配对原则不变 ，可反复变性和复性。
➢ 多样性：DNA分子碱基对的排 列顺序千变万化，一天n个碱基的 DNA分子排列方式有4n种。
150000 145000 140000
0
2.3X10-3
1.2X10-3 2.3X10-4
400
800
200000
100000
0
200
400
600
800
Time (Second)
NTFS (Nucleotide Fragment Sense)平台技术实时监测核酸的连接过程 该平台还被用于核酸磷酸化过程监测，NAD等的高灵敏检测
利用E.Coli DNA连接酶具有对NAD的高度依赖性，检测NAD+
Z. Tang, K. Wang* et al. Anal. Chem., 2011, 83, 2505
基于DNA聚合酶的链置换聚合反应用于DNA的高灵敏检测
Q. Guo, X. Yang, K. Wang, et al. Nucleic Acids Res. 2009, 37, e20.
亲和力高 特异性强
筛选周期短，成本低
靶分子种类广泛
结合条件可控 修饰灵活
分子量小，无免疫原性
稳定、易保存
•核酸适配体的定义
• 核酸适配体：由15-60个碱基组成的能特异识别 靶分子的单链DNA/RNA，识别对象包括小分子 、蛋白质、细胞等。
分子识别的基础不是碱基互补配对 折叠成特定的二级与三级结构 空间结构与靶分子构象匹配
5. 与纳米结构结合，用于肿瘤等的成像和治疗研究； 6. 临床应用等
1.1 Watson-Crick碱基互补配对—分子信标
目标 DNA
分子信标是个呈发夹结构、设计十分巧妙的短链DNA分子。由于它特殊的结构，自 从1996年被首次合成出来以后，它已经被非常广泛地应用于PCR定量、基因分型、 基因芯片、活细胞内mRNA分析以及蛋白质（酶）研究等领域。
1.2 金属-碱基对
T-Hg2+-T的结构