如何自制核酸探针

如何自制核酸探针？

什么是核酸探针？

核酸探针是能与特定的靶分子发生特异性结合的一段核苷酸分子。通过在核酸探针上连接一些小分子化合物，如生物素、荧光素、地高辛等，或者放射性同位素标记核苷酸，可以达到检测靶基因序列和纯化的目的。这一过程被称为核酸杂交。其原理是碱基互补的两条核酸分子退火形成双链。

探针应用

核酸探针技术作为分子生物学中最常见的技术之一，是印记杂交，原位杂交，实时荧光PCR，microarray（微阵列）等技术不可或缺的组成部分。探针技术能定性或者检测特异性DNA/RNA序列，还可用于病原微生物和寄生虫的检测，疾病诊断等领域。

探针制备

探针标记主要分为放射性和非放射性标记法。探针制备流程如图1所示。Southern印迹、Northern印迹等需要较长的DNA探针，常使用缺口平移法和随机引物法进行标记。而这些方法对于较短的DNA（200 bp以下）来说，效率很低，常使用末端标记法。除了这三种方法，常见的还有PCR标记法。

图1. 探针制备流程。

随机引物法

随机引物法的原理是利用随机引物（random primer，即DNA 水解、分离得到的六聚脱氧核苷酸作）与单链DNA随机互补结合，在Klenow大片段酶的作用下，合成互补链，直至下一个引物。如果模板是RNA，则使用反转录酶。随机引物法可以使标记均匀跨越探针全长。相比于缺口平移法，探针的活性更高，但是产量相对较低。

图2. 随机引物法的原理。

Protocol

试剂：

[α-32P]dCTP (3000Ci/mmol), dATP,dTTP,dGTP (5 mmol/L),Klenow大片段（2U/uL），模板，随机引物，

NA终止/贮存缓冲液（50 mmol/L Tris-Cl (pH 7.5)，50 mmol/L NaCl，5 mmol/L EDTA (pH 8.0)，0.5% (m/V) SDS）

5X 随机引物缓冲液（250 mmol/L Tris (pH 8.0)，25 mmol/L MgCl2，100 mmol/L NaCl，10 mmol/L 二琉苏糖醇（DTT)，1 mol/L HEPES ( 用 4 mol/L NaOH 调至 pH 6.6），1 mol/L DTT 贮存于 -20℃，临用前用水稀释，使用后弃去稀释的 DTT。）

实验步骤：

1、在一个 0.5 mL 的微量离心管中加入溶于 30 uL 水的模板 DNA ( 25 ng ) 及 1 uL 随机脱氧核苷酸引物（约 125 ng）。

2、使用PCR或者预热的水浴锅95℃热变性10min，迅速放冰上1min。

3、4℃离心混合物10s，重新置于冰上。

4、引物和模板的混合物中加入：

dATP, dTTP, dGTP 各1 uL

5X 随机引物缓冲液 10 uL

[α-32P]dNTP 5 uL

水至 50 uL

然后加入5 uL的klenow片段。

5、轻弹混合均匀,轻甩使液体降至管底。室温反应60min。然后加入10 uL的NA终止/贮存缓冲液。

6、制备好的探针-20℃保存。或者过柱后保存。原位杂交需要过柱。

缺口平移法

缺口平移法标记探针的基本原理是：先用适当浓度的DNA酶I在DNA分子的一条链上打开缺口(nick)，缺口处形成3’羟基末端，再利用大肠杆菌DNA聚合酶I的 5’→3’方向外切酶活性，将缺口处5’端碱基依次切除。与此同时，在大肠杆菌DNA聚合酶I的催化下，以另一条DNA链为模板，以带标记得dNTP为原料，顺序将dNTP连接到切口的3’羟基上，从5，端向3’端方向重新合成一条互补链。

图3. 缺口平移法制备探针原理。

末端标记法

末端标记法可用于标记较短的探针。如图4所示，末端标记法又可以分为T4多核苷酸激酶、Klenow片段、T4 DNA聚合酶。他们各自的原理如下图所示。

-T4多核苷酸激酶

图4. 利用T4 PNK和 [γ-32P]dATP进行末端标记。

-Klenow片段

图5. 利用Klenow片段进行末端标记。

-T4 DNA聚合酶

图6. 利用T4 DNA聚合酶进行末端标记。

寡聚核苷酸探针

寡聚核苷酸多由商家定制合成，可广泛用于测序、杂交和引物外延。末端标记法适合标记合成的寡核苷酸探针。其原理是：在大肠杆菌 T4 噬菌体多聚核苷酸激酶(T4 PNK)的催化下,将标记ATP的磷酸连接到带羟基的待标记寡核苷酸 5′末端上。

PCR标记法

PCR 标记法是将标记过的dNTP添加到DNA模板溶液中,在DNA聚合酶的催化作用下,经过多次变性、退火和延伸过程的重复性循环,合成掺入标记物的DNA 片段。这种方法简便、快速、重复性好,对模板DNA的纯度要求低,可用于大量制备。

图7. PCR标记法。

探针纯化

乙醇可以出去部分未参与反应的核苷酸等物质，而Sephadex等凝胶过滤的方法可以除去几乎所有未参与反应的核苷酸。根据探针分子质量选择Sephadex G50（100bp以上）或者Sephadex G25（100bp以下）。

Protocol

1.将Sephadex G50悬浮于TE，（G25需要悬浮在T50E）,高温高压灭菌，室温保存。

2.将poly-prep柱置于架子上。将悬浮的Sephadex填充入柱子中。并用5ml TE（G25选择T50E）平衡。

3.将标记好的探针放入柱中。

4.缓慢加入400 uL TE（G25选择T50E）.并回收TE（G25为T50E）。每管200 ul，共回收6管。

5.测定各管的放射性强度。选择放射性强的为探针，优先考虑。

参考资料：

《现代分子生物学实验原理与技术》

赵美萍,张新祥,常文保.生化探针技术.大学化学,2004,19:2.