寡核苷酸探针杂交温度如何确定
分子诊断单选题库(附参考答案)
分子诊断单选题库（附参考答案）一、单选题（共100题，每题1分，共100分）1、可以用来分辨16SrRNA基因不能鉴别的非常接近的菌种和种内菌株的是A、23SrRNA基因B、16S-23S rRNA基因C、18S rRNA基因D、65000抗原基因E、penA基因正确答案：B2、Northern印迹杂交可以用于A、快速确定是否存在目的基因B、不仅可以检测DNA样品中是否某一特定的基因，而且还可以获得基因片段的大小及酶切位点分布的信息C、用于基因定位分析D、检测靶分子是RNAE、用于阳性菌落的筛选正确答案：D3、DTT可以断开蛋白质分子间氨基酸残基形成A、酯键B、离子键C、二硫键D、氢键E、疏水键正确答案：C4、不适宜于直接作为第一代测序技术的DNA模板是A、双链DNA片段和PCR产物B、单链DNA片段C、克隆于质粒载体的DNA片段D、克隆于真核载体的DNA片段E、提取的染色质DNA正确答案：E5、关于核酸探针的描述下列不正确的是A、可以是DNAB、可以是RNAC、可用放射性标志物D、可用非放射性标志物E、必须是单链核酸正确答案：E6、下列说法错误的是A、用于RNA检测的样本短期可保存在'－20℃B、用于PCR检测的样本可用肝素作为抗凝剂C、如使用血清标本进行检测应尽快分离血清D、外周血单个核细胞可从抗凝全血制备E、用于核酸提取的痰液标本应加入1mol/LNaOH初步处理正确答案：B7、影响DNA分离纯化效果的是A、材料新鲜，低温保存B、加核酸酶抑制剂C、剧烈振荡D、除净蛋白质E、除净多糖正确答案：C8、cAMP对转录的调控作用是通过A、cAMP转变为CAPB、CAP转变为 cAMPC、形成cAMP-CAP复合物D、葡萄糖分解活跃，使cAMP增加，促进乳糖利用来扩充能源E、cAMP是激素作用的第二信使，与转录无关正确答案：C9、其3'羟基末端带有可化学切割部分的dNTP称”可逆终止子”(reversible terminator),使用”可逆终止子”的测序反应是A、焦磷酸测序B、边合成边测序C、化学裂解法测序D、双脱氧终止法测序E、寡连测序正确答案：B10、荧光原位杂交可以用于A、快速确定是否存在目的基因B、检测的目标是RNAC、用于基因的定位分析D、阳性菌落的筛选E、蛋白水平的检测正确答案：C11、理想质粒载体具备的条件不包括下列哪项A、具有松弛型复制子B、单一的酶切位点C、分子量较大D、具有高的拷贝数E、具有插入失活的筛选标记正确答案：C12、血友病是一种A、染色体病B、先天畸形C、先天性代谢缺陷病D、常染色体隐性遗传病E、X连锁遗传病正确答案：E13、一般来说，设计的寡核苷酸探针的长度为A、200~300bpB、2~10bpC、100~200bpD、60~100bpE、17~50bp正确答案：E14、首个被证实和克隆的乳腺癌易感基因是A、BRCA1B、BRCA2C、c-eebB-2IHR2D、ATME、p53正确答案：A15、关于多顺反子m的描述，正确的是A、几个mRNA分子有不同的开放阅读框B、几个结构基因由不同的启动子调控转录C、一个mRNA分子有几个开放阅读框D、多个结构基因编码一类蛋白质E、一个结构基因编码多种蛋白质正确答案：C16、线粒体基因组22个tRNA可转录几种tRANA、22种B、20种C、18种D、13种E、2种正确答案：B17、可作为分子遗传标记的是A、HLAB、单拷贝序列C、高表达蛋白D、RFLPE、染色体正确答案：D18、关于增强子的叙述，正确的是A、与基因表达的时间、空间特异性无关B、只能近距离影响启动子活性的转录调控元件C、具有抑制基因转录的作用D、具有增强基因转录的作用E、它的作用有方向性正确答案：D19、下列不可以作为核酸探针使用的是A、microRNAB、单链DNAC、寡核苷酸D、mRNAE、病毒RNA正确答案：A20、下列属于核苷酸三联体重复序列发生高度重复所致的是A、珠蛋白生成障碍性贫血B、血友病C、迪谢内肌营养不良D、脆性X综合征E、镰状細胞贫血正确答案：D21、人类基因组中DNA的多态性不包括下列那种形式A、限制性片段长度多态性B、微卫星和小卫星多态性C、单核苷酸多态性D、非限制性片段长度多态性E、拷贝数多态性正确答案：D22、遗传病的最基本特征是A、遗传物质发生了改变B、患儿发病的家族性C、染色体畸变D、酶的缺陷E、先天性正确答案：A23、第三代DNA测序技术可能使用A、毛细管凝胶电泳B、PCR技术C、芯片技术D、荧光标记技术E、非光学显微镜成像正确答案：E24、碱基修饰剂导致DNA损伤的机制是A、与DNA正常碱基结构类似B、直接插入到DNA碱基对中C、造成DNA两条链错位D、能引起碱基的脱氨基E、可取代正常碱基掺入DNA链中正确答案：D25、结核分技杆菌的基因组特征是A、单链DNAB、双链DNAC、单正链DNAD、单正链RNA双聚体E、单负链RNA正确答案：B26、最常用的DNA探针标记方法是A、随机引物标记B、切口平移标记C、3'-末端标记D、5'-末端标记E、PCR法正确答案：A27、下列哪种蛋白质染色方法会出现“雪崩效应”A、银染色B、SYPRO OrangeC、考马斯亮蓝染色D、胶体考马斯亮蓝染色E、SYPRO Ruby正确答案：A28、下列不能用于核酸转移作固相支持物的是A、NC膜B、尼龙膜C、化学活性膜D、滤纸E、PVC膜正确答案：E29、目前被DNA自动化测序技术广泛应用的酶是A、大肠杆菌DNA聚合酶ⅠB、Klenow片段C、测序酶D、耐热DNA聚合酶E、限制性内切核酸酶正确答案：D30、数字PCR技术是一种A、单分子绝对定量的技术B、单分子相对定量的技术C、多分子绝对定量的技术D、多分子相对定量的技术E、以上都不是正确答案：A31、DNA探针的长度通常是A、1000～2000个碱基B、500～1000个碱基C、400～500个碱基D、100～400个碱基E、＜100个碱基正确答案：C32、基因多态性连锁分析中，第一、二、三代遗传标记分别是A、RFLP、SSCP、STRB、RFLP、SNP、STRC、RFLP, STR、 SNPD、VNTR、SCCP、SNPE、VNTR、STR、RFLP正确答案：C33、基因诊断对下列哪些疾病最具有确切的临床诊断意义A、单基因遗传病B、畸形C、肿瘤D、多基因遗传病E、染色体疾病正确答案：A34、关于微卫星的说法正确的是A、通常由9〜10个核苷酸组成B、是一类低度多态性的遗传标记C、是一种简单串联排列的RNA序列D、微卫星序列定位于基因的启动子、编码区、内含子及其外显子交界区E、通过改变RNA结构或与特异性蛋白结合而发挥作用正确答案：D35、HIV核酸类型是A、单链DNAB、双链DNAC、单正链DNAD、单正链RNA双聚体E、单负链RNA正确答案：D36、用于病毒基因突变检测的技术是A、荧光定量PCR技术B、PCR-RFLP技术C、PCR微卫星检测技术D、原位杂交技术E、cDNA表达芯片技术正确答案：B37、新一代测序技术中的边合成测序和焦磷酸测序均需要A、DNA聚合酶(DNA polymerase)B、ATP硫酸化酶(ATP sulfurylase)C、荧光素酶(luciferase)D、三磷酸腺苷双磷酸酶(apyrase)E、DNA连接酶(DNA ligase)正确答案：A38、以下为荧光染料技术的优点，不正确的是A、适合任何一个反应体系B、荧光信号量与PCR反应产物量成正比，可以实时监测C、荧光信号的检测在每一次循环延伸后，简单方便D、不需要进行凝胶分离等第二次处理PCR产物，避免污染E、特异性高正确答案：E39、重组DNA技术的基本步骤不包括A、选B、分C、转D、接E、表达正确答案：E40、下列位置关系叙述正确的是A、启动子不会位于转录起始点下游B、增强子位于结构基因内部C、TATA盒位于转录起始点下游D、转录调控序列位于结构基因之外E、翻译起始密码子位于转录起始点下游正确答案：E41、人类基因组计划的大部分工作草图绘制工作通过该载体完成A、M13mp质粒B、细菌质粒C、载体有酵母人工染色体(YAC)D、细菌人工染色体(BAC)E、穿梭质粒正确答案：C42、第一代DNA测序技术的核心技术是A、Sanger的双脱氧链终止法B、Maxam和Gilbert的化学降解法C、荧光标记技术D、PCR技术E、DNA自动分析技术正确答案：A43、基因芯片技术的本质就是A、聚合酶链反应技术B、酶切技术C、蛋白质分子杂交技术D、基因重组技术E、核酸分子杂交技术正确答案：E44、硝酸纤维素膜的缺点不包括A、轻微电渗作用B、易蒸发C、吸水性差D、脆性大E、标本用量少正确答案：B45、焦磷酸测序技术不使用的酶是A、DNA聚合酶(DNA polymerase)B、DNA连接酶(DNA ligase)C、ATP硫酸化酶(ATP sulfurylase)D、荧光素酶(luciferase)E、三磷酸腺苷双磷酸酶(Apyrase)正确答案：B46、双向电泳的样品制备目的不包括的是A、去除蛋白质杂质B、变性C、氧化D、还原E、溶解正确答案：B47、某基因位点正常时表达为精氨酸，突变后为组氨酸，这种突变方式为A、错义突变B、无义突变C、移码突变D、同义突变E、动态突变正确答案：A48、肽质量指纹图谱常与哪一种质谱技术联合应用A、TOFB、ESIC、ESI-MSD、MALDIE、FAB正确答案：D49、下面关于mtDNA基因突变的说法不正确的是A、同一细胞内所有的mtDNA会发生同样的变异B、同一细胞内的mtDNA会发生不同的变异.C、mtDNA—般很难发生改变，一但mtDNA基因突变就会导致疾病的发生D、点突变是mtDNA碱基突变的主要形式E、mtDNA拷贝数目会发生改变，也属于mtDNA基因突变正确答案：C50、核酸分子杂交的基础是A、磷酸化B、碱基互补配对C、配体受体结合D、抗原抗体结合E、甲基化正确答案：B51、受精卵中的线粒体A、几乎全部来自精子B、几乎全部来自卵子C、精子与卵子各提供1/2D、不会来自卵子E、大部分来自精子正确答案：B52、原核生物基因组中没有A、操纵子B、外显子C、内含子D、转录因子E、插入序列正确答案：C53、荧光定量PCR检测核酸量的时间段在A、非指数期B、PCR反应的最初阶段C、PCR反应最后的时间段D、指数期的起始阶段E、指数期的终末阶段正确答案：D54、在重组DNA技术领域，DNA克隆主要是指A、建立单克隆抗体B、建立多克隆抗体C、构建重组DNA分子D、无性繁殖DNAE、有性繁殖DNA正确答案：D55、下列哪种病毒在复制过程中可产生RNA-DNA杂交体A、HPVB、HIVC、HBVD、HCVE、流感病毒正确答案：B56、下面对mtDNA中D环区（D-loop)的描述正确的是A、是结构基因，编码13个蛋白多肽B、编码22个tRNAC、编码2种rRNA，即12SrRNA和16SrRNAD、参与调控线粒体的复制和转录E、可折叠成茎环结构正确答案：D57、编码HIV包膜gpl20的基因是A、gag基因B、pol基因C、env基因D、E6基因E、LTR正确答案：C58、基因芯片技术的主要步骤不包括A、杂交反应B、样品制备C、芯片的设计与制备D、酶切分析E、信号检测正确答案：D59、对于关核苷酸探针，杂交温度一般低于其Tm值A、30~40℃B、10~15℃C、20~30℃D、15~30℃E、5℃正确答案：E60、以质粒为载体，将外源基因导入受体菌的过程称A、转位B、转染C、感染D、转导E、转化正确答案：E61、聚合酶链反应可表示为A、PECB、PERC、PDRD、BCRE、PCR正确答案：E62、PCR反应必需的成分是A、BSAB、DTTC、Tween20D、明胶E、Mg2+正确答案：E63、关于Ct值的描述，不正确的是A、Ct值是荧光定量PCR获得的最初数据资料B、Ct代表了反应达到预定设置的阈值时的循环次数C、Ct与反应模板的初始模板量成正比D、Ct越小代表其模板核酸拷贝数越多E、Ct值处于扩增曲线和荧光本底基线的交叉点正确答案：C64、生物芯片根据芯片上固定的探针种类不同可分为几种，其中不包括A、测序芯片B、蛋白质芯片C、细胞芯片D、组织芯片E、DNA芯片正确答案：A65、重复序列通常只有1〜6bp，重复10〜60次并呈高度多态性的DNA序列称为A、小卫星DNAB、微卫星DNAC、cDNAD、高度重复顺序DNAE、单拷贝顺序DNA正确答案：A66、未知突变的检测，下列最准确的方法是A、PCRB、序列测定C、核酸杂交D、RFLPE、ASO正确答案：B67、DHPLC技术检测异质突变，阳性结果应该出现A、单峰B、双峰C、三峰D、无峰E、多峰正确答案：B68、细胞周期检查点激酶1基因定位于哪个染色体上A、染色体lp32B、染色体12q24C、染色体llq24D、染色体2q32E、染色体9p21正确答案：C69、DNA提取中不能有效的去除蛋白质的是A、酚/氯仿抽提B、SDSC、高盐洗涤D、蛋白酶KE、RNase正确答案：E70、真核生物基因表达调控的关键环节是①染色质活化②转录起始③转录后加工④翻译起始⑤翻译后加工A、②+③B、①+②+④C、②D、①+②+③E、②①+②正确答案：C71、某人提取DNA后将DNA溶液稀释10倍，然后经紫外分光光度计检测结果为A260=0.56A280=0.31,比色皿光径1cm,该DNA样品的浓度为A、180μg/mlB、150μg/mlC、224μg/mlD、250μg/mlE、280μg/ml正确答案：E72、大部分Ⅱ类限制性核酸内切酶识别序列的特点是A、超螺旋结构B、α螺旋结构C、串联重复序列D、锌指结构E、回文结构正确答案：E73、原核生物基因组结构特点不应包括A、含插入序列B、具有操纵子结构C、含有重复顺序D、断裂基因E、转录产物为多顺反子正确答案：D74、某个体体细胞中染色体数目为49，称为A、四倍体B、三倍体C、亚二倍体D、超三倍体E、超二倍体正确答案：C75、用于基因定位分析的是A、Northern印迹杂交B、点/狭缝杂交C、Southern印迹杂交D、菌落杂交E、原位杂交正确答案：E76、下列哪种不属于真核生物基因的顺式作用元件A、沉默子B、衰减子C、激素反应元件D、启动子E、增强子正确答案：B77、HIV最易发生变异的部位是A、包膜蛋白B、逆转录酶C、核衣壳蛋白D、刺突蛋白E、内膜蛋白正确答案：D78、操纵子结构不存在于A、病毒基因组中B、真核生物基因组中C、原核生物基因组中D、细菌基因组中E、大肠杆菌基因组中正确答案：B79、关于RNA探针的描述下列不正确的是A、可用于随机引物标记B、特异性高C、灵敏度高D、可用非同位素标记法标记E、不易降解正确答案：E80、关于核酸探针的描述下列不正确定的是A、可以是DNAB、可以是RNAC、可用放射性标志物D、可用非放射性标记E、必须是单链核酸正确答案：E81、巢式PCR错误的是A、是对靶DNA进行二次扩增B、第二次扩增所用的模板为第一次扩增的产物C、巢式PCR可提高反应的灵敏度和特异性D、常用于靶基因的质和(或)量较低时E、第二对引物在把序列上的位置应设计在第一对引物的外侧正确答案：E82、下列方法中不能分辨野生型和突变型基因的是A、PCR-SSCPB、变性梯度凝胶电泳C、溶解曲线分析D、逆转录PCRE、RFLP正确答案：D83、用于确诊HIV感染的是A、ELISA检测p24抗原B、IFA检查P24抗体C、ELISA检测gp120抗原D、Westem检测P24抗原及gp120抗原E、RIA检测gp120抗原正确答案：D84、可以快速确定是否存在目的基因的方法是A、Southern印迹杂交B、Northern印迹杂交C、原位杂交D、点/狭缝杂交E、菌落杂交正确答案：D85、Alu家族属于A、可变数目串联重复序列B、短串联重复序列C、短散在核元件D、长散在核元件E、DNA转座子正确答案：C86、Western印迹过程中若转移>20KD的蛋白质时应采用何种硝酸纤维素膜A、0.25μmB、0.35μmC、0.45μmD、0.55μmE、0.6μm正确答案：C87、以下不需要对引物或探针预先标记的实时定量PCR方法是A、TaqMan水解探针技术B、探针杂交技术C、分子信标技术D、SYBR Green I荧光染料技术E、数字PCR技术正确答案：D88、Southern印迹杂交的描述正确的是A、用于基因定位分析B、检测靶分子是RNAC、不仅可以检测DNA样品中是否存在某一特定的基因，而且还可以获得基因片段的大小及酶切位点分布的信息D、用于阳性菌落的定位分析E、用于蛋白质水平的检测正确答案：C89、下列哪种克隆载体为容纳大片段外源DNA的首选载体?A、质粒B、粘粒C、酵母人工染色体D、λ噬菌体E、M13噬菌体正确答案：C90、下列有关蛋白质提取和分离的说法，错误的是A、采用透析法是蛋白质与其他小分子化合物分离开来B、离心沉淀法通过控制离心速率使分子大小、密度的蛋白质分离C、蛋白质在电场中与其自身所带的电荷相同的电极方向移动D、透析法分离蛋白质的原理是利用蛋白质不能通过半透膜的特性E、在蛋白质溶液中加入大量中性盐可使蛋白质沉淀析出正确答案：C91、原核生物与DNA结合并阻止转录进行的蛋白质称为A、正调控蛋白B、阻遏物C、诱导物D、反式作用因子E、分解代谢基因激活蛋白正确答案：B92、关于管家基因叙述错误的是A、在生物个体的几乎各生长阶段持续表达B、在生物个体的几乎所有细胞中持续表达C、在生物个体全生命过程的几乎所有细胞中表达D、在生物个体的某一生长阶段持续表达E、在一个物种的几乎所有个体中持续表达正确答案：D93、关于单基因遗传病的叙述，正确的是A、可进行定性诊断和定量诊断B、在群体中发病率高C、受多对等位基因控制D、原发性高血压是单基因遗传病E、发病机制都已阐明正确答案：A94、有关微卫星的描述正确的是A、散在重复序列的一种B、10~100bp组成的重复单位C、主要存在于着丝粒区域，通常不被转录D、形式为（CA)n/(TG)n、(AG)n、(CAG)n等E、又称为可变数目串联重复序列(VNTR)正确答案：D95、DHPLC检测要求样品片段大小范围A、＜200bpB、200~500bpC、＜500bpD、300~600bpE、100~300bp正确答案：B96、第二代测序技术最主要技术特征是A、对单分子DNA进行非PCR的测序B、针对SNP进行非PCR的测序C、高通量和并行PCR测序D、直接分析SNPE、直接进行个体基因组测序和SNP研究正确答案：C97、HIV结构具有CD4分子受体的部位是A、衣壳B、包膜C、内膜D、刺突E、核酸正确答案：D98、PCR的变性温度一般为A、72℃B、55℃左右C、75-80℃D、94-95℃E、25℃正确答案：D99、有关SNP位点的描述，不正确的是A、生物芯片技术可提高SNP位点检测正确性B、单个SNP位点信息量大，具广泛的应用前景C、在整个基因组中大概有300万个SNP位点D、被称为第三代DNA遗传标点E、SNP位点是单个核苷酸的变异正确答案：A100、最容易降解的核酸探针是A、cDNA探针B、dsDNA探针C、ssDNA探针D、gDNA探针E、RNA正确答案：E。
寡核苷酸探针制备
寡核苷酸探针制备
寡核苷酸探针制备需要以下步骤：
1. 设计寡核苷酸序列：根据目标DNA分子的序列设计寡核苷酸探针序列，使其能够与目标序列互补配对。
2. 合成寡核苷酸探针：合成寡核苷酸探针的方法有磷酸二酯化学合成、固相合成和酶法合成等。
其中固相合成是最常用的方法，可通过商业化学公司购买。
3. 标记寡核苷酸探针：标记方法有放射性标记、化学标记和生物素标记等。
其中化学标记和生物素标记可在商业化学公司购买。
4. 纯化寡核苷酸探针：使用凝胶电泳或高效液相色谱等方法将寡核苷酸探针从杂质中纯化。
5. 确定寡核苷酸探针浓度：使用分光光度计或比色法等方法测定寡核苷酸探针的浓度。
6. 评估寡核苷酸探针的效能：使用聚合酶链式反应（PCR）或原位杂交等方法测试寡核苷酸探针的特异性和敏感性。
7. 存储寡核苷酸探针：将寡核苷酸探针保存在低温干燥的环境中，避免受到光、氧化和水解等影响。
NorthernBlot注意事项
NorthernBlot注意事项DIG检测试剂盒疑难问题及解决⽅案⼀、灵敏度低或信号弱的问题及解决⽅案？1.探针标记效率低：2.膜的问题：使⽤阳性尼龙膜3.杂交：增加标记探针的浓度，或减少洗涤时的严谨性4.曝光时间：增加曝光时间；使⽤⾼灵敏度的专⽤化学发光的Lumi-Film胶⽚，其他像Kodak XAR也可。
⼆、⾼背景解决⽅案?1.探针标记：纯化的DNA或RNA在标记前⽤⼄醇沉淀；确认探针对靶序列是特异性并跟其他载体⽆同源性；2.膜：推荐使⽤罗⽒或经过验证的膜(pall)、Ambion膜3.杂交：使⽤CDP-Star发光底物，最好将DIG探针浓度稀释到（RNA 20-50ng/ml）另外在杂交过程中不要让膜⼲燥4.检测过程：将抗DIG-AP的酶的浓度到由原来的1:20,000 减少到1:50,000，也不会减少酶检测的灵敏度。
增加洗脱和封闭的溶液的量和次数；膜上出现斑点可能是由于酶在膜上的凝集，需要将膜短暂离⼼后使⽤。
5.曝光时间：缩短曝光时间，通常为15-60s。
Ambion⽣物素化探针疑难问题解决⽅案⼀、探针类型、设计及标记⽅法（⼀）探针类型如何选择？1.单链DNA探针：对于传统的杂交缓冲液，单链探针的效果要好于双链探针，因为双链探针可与未标记的RNA结合，降低了探针与靶RNA结合的浓度，使杂交信号减少，另外双链探针之间可以退⽕，降低探针的浓度。
1)引物延伸法：质粒克隆或PCR产⽣的模板2)⾮对称扩增PCR:3)末端标记的寡核苷酸；优点:简单、经济，对于同源性较⾼的序列或对靶基因序列了解较少情况下适⽤。
通常在5’末端⽤多聚核苷酸激酶标记，但每⼀个分⼦仅有⼀个可标记的基团，⽐内部掺⼊标记的探针灵敏度更低，且杂交温度需要去摸索。
2.双链DNA探针：有⾼度特异性，能⽤于随机引物进⾏标签，快速和可靠。
缺点是;在杂交前需要变性。
3.RNA探针：质粒克隆表达或PCR产⽣的DNA模板进⾏体外转录合成RNA探针。
核酸分子杂交实施方案
核酸分子杂交实施方案核酸分子杂交是一种重要的实验技术，广泛应用于生物学、医学和生物化学领域。
它通过核酸序列的互补配对来检测、定量和分析特定的核酸分子，因此在基因克隆、基因表达调控、病毒检测等方面有着重要的应用价值。
下面将介绍核酸分子杂交的实施方案，包括实验材料准备、实验步骤和结果分析等内容。
实验材料准备。
1. 核酸探针，根据实验需要设计合适的核酸探针，通常选择20-30个碱基长度的寡核苷酸序列作为探针。
2. 核酸标记物，可以选择放射性同位素标记、酶标记或荧光标记的核酸标记物。
3. 核酸杂交缓冲液，包括盐类、缓冲剂、表面活性剂等成分，用于维持核酸的稳定性和杂交反应的进行。
4. 核酸杂交膜，选择适合的膜材料，如硝酸纤维素膜、尼龙膜等，用于固定核酸样品和进行杂交反应。
5. 核酸杂交仪器，包括恒温振荡器、放射自显影仪等设备，用于控制反应条件和检测结果。
实验步骤。
1. 核酸样品制备，从细胞、组织或体液中提取核酸样品，并进行纯化和定量处理。
2. 核酸标记，将核酸样品与核酸标记物进行反应，标记核酸样品，使其具有检测信号。
3. 核酸杂交，将标记的核酸样品与核酸探针共同加入核酸杂交缓冲液中，进行恒温振荡反应，使其发生互补配对杂交。
4. 杂交膜固定，将杂交反应产物通过滤纸吸附或紫外交联的方式固定在核酸杂交膜上。
5. 杂交膜检测，利用放射自显影仪或荧光成像系统对固定的核酸杂交膜进行检测，观察杂交信号强度和位置。
结果分析。
根据核酸杂交膜的检测结果，可以分析样品中特定核酸序列的存在与否、数量的多少以及位置的分布等信息。
通过比对标准曲线或对照样品，可以定量分析目标核酸的含量，并进行统计学处理和结果解释。
总结。
核酸分子杂交是一种重要的实验技术，通过合理的实施方案和严格的实验操作，可以获得准确、可靠的实验结果。
在实验中需要注意核酸样品的处理和标记、杂交条件的控制、杂交反应产物的固定和检测等关键步骤，以确保实验的成功进行和结果的可靠性。
原位杂交操作流程
原位杂交操作流程1、使用地高辛标记的核酸探针进行石蜡切片的RNA原位杂交第一天1)二甲苯于37°C脱蜡2次，每次15分钟；2)无水乙醇浸泡2次，每次3分钟；3)95%乙醇浸泡2次，每次3分钟；4)PBS清洗3分钟；5)2%焦碳酸二乙酯室温下浸泡10分钟；6)PBS清洗10分钟；7)加入胃蛋白酶25ul/ml,37°C孵育15分钟；8)PBS清洗2次，每次3分钟；9)0.2N的HCl孵育30分钟；10)PBS清洗2次，每次3分钟；11)0.25%无水乙酸和0.1M三乙醇胺孵育10分钟；12)PBS清洗2次，每次5分钟；13)预杂交缓冲液孵育30分钟；14)准备核酸探针混合物：使用预杂交缓冲液稀释探针，85°C加热5分钟，置于冰块中10分钟；15)杂交；第二天16)将玻片置于SSC中2次，每次5分钟以去除封片；17)PBS清洗3分钟；18)RNA酶A溶液中(或0.1-1ng/mlPBS中)，37°C孵育30分钟；19)PBS清洗5分钟；20)室温，2XSSC清洗10分钟；21)37°C，1XSSC清洗10分钟；22)37°C，0.5XSSC清洗10分钟；23)缓冲液A孵育10分钟；24)缓冲液A(1%正常绵羊血清和0.03%三重氢核X-100)孵育30分钟；25)加入抗地高辛抗体(1/200的上述缓冲液，来自BoehringerMannheim)，37°C孵育3小时；26)缓冲液A清洗2次，每次10分钟；27)缓冲液B清洗2次，每次5分钟；28)制成NBT/BCIP暗处保存30-60分钟，显微镜下进行观察，如果背景尚佳，显色时间可延长到16小时;29)停止缓冲液B的反应，用水进行简单的清洗；30)固红，脱水以及封片进行核的复染。
2、使用地高辛标记的寡核苷酸探针进行石蜡切片的原位DNA杂交第一天1)二甲苯于37C脱蜡2次，每次15分钟；2)无水乙醇浸泡2次，每次5分钟；3)95%乙醇浸泡2次，每次5分钟；4)PBS清洗5分钟；5)2%焦碳酸二乙酯室温下浸泡10分钟；6)PBS清洗5分钟；7)加入胃蛋白酶25ul/ml，37C孵育10分钟；8)PBS清洗2次，每次5分钟；9)0.2N的HCl孵育30分钟；10)PBS清洗2次，每次5分钟；11)0.25%无水乙酸和0.1M三乙醇胺孵育10分钟；12）PBS清洗5分钟；13）预杂交缓冲液孵育30分钟；14）准备寡核苷酸探针混合物：使用预杂交缓冲液稀释探针；15）杂交；第二天16）将玻片置于SSC中以去除封片；17）室温，2XSSC清洗10分钟；18）37°C,1XSSC清洗10分钟；19）37°C,0.5XSSC清洗10分钟；20）缓冲液A孵育10分钟；21）缓冲液A孵育30分钟；22）加入抗地高辛抗体37C孵育3小时；23）缓冲液A清洗2次，每次5分钟；24）缓冲液B清洗2次，每次5分钟；25）制成NBT/BCIP暗处保存30-60分钟，显微镜下进行观察，如果背景尚佳，显色时间可长到16小时；26）停止缓冲液B的反应，用水进行简单的清洗；27）固红，脱水以及封片进行核的复染。
核酸分子杂交的概念基本原理探针及类型
核酸分子杂交的概念、基本原理、探针及类型分子杂交的概念及基本原理主要内容：一、分子杂交的概念二、分子杂交基本原理（一）DNA变性：1、DNA变性的方法2、增色效应3、溶解曲线4、融解温度5、影响Tm值的因素。
（二）复性：退火一、分子杂交的概念：分子杂交（molecular hybridization）指具有一定同源序列的两条核酸单链（DNA或RNA），在一定条件下按碱基互补配对原则经过退火处理，形成异质双链的过程。
利用这一原理，就可以使用已知序列的单链核酸片段作为探针，去查找各种不同来源的基因组DNA分子中的同源基因或同源序列。
二、分子杂交基本原理：（一）DNA变性：DNA变性是指双螺旋之间氢键断裂，双螺旋解开，形成单链无规则线团，因而发生性质改变（如粘度下降，沉降速度增加，浮力上升，紫外吸收增加等）。
1、DNA变性的方法：1)加热；2)改变DNA溶液的pH；3)有机溶剂（如乙醇、尿素、甲酰胺及丙酰胺等）等理化因素。
2、增色效应：DNA在260nm处有最大吸收值，这一特征是由于含有碱基的缘故。
在DNA双螺旋结构模型中碱基藏于内侧，变性时由于双螺旋解开，于是碱基外露，260nm紫外吸收值因而增加，这一现象称为增色效应（hyperchromic effect）。
利用DNA变性后波长260nm处紫外吸收的变化可追踪变性过程。
3、溶解曲线：如果升高温度使DNA变性，以温度对紫外吸收作图，可得到一条曲线，称为溶解曲线。
4、融解温度：通常人们把50%DNA分子发生变性的温度称为变性温度（即熔解曲线中点对应的温度），由于这一现象和结晶的融解相类似，故又称融点或融解温度（melting temperature， Tm）。
因此Tm是指消光值上升到最大消光值一半时的温度。
5、影响Tm值的因素：Tm不是一个固定的数值，它与很多因素有关：1) 部因素：pH、离子强度。
随着溶剂内离子强度上升，Tm值也随着增大。
2) 部因素：DNA的碱基比例、DNA的均一性；在相同条件下，DNA内G-C配对含量高，其Tm值也高。
寡核苷酸探针
探针的荧光素标记可以采用直接和间接标记的方法。 1）间接标记是采用生物素标记DNA探针，杂交之后 用藕联有荧光素亲和素或者链霉亲和素进行检测，同 时还可以利用亲和素-生物素-荧光素复合物，将荧光 信号进行放大。 2）直接标记法是将荧光素直接与探针核苷酸或磷酸 戊糖骨架共价结合。直接标记法在检测时步骤简单， 可以直接检测荧光信号。开展个体化药学服务，即采 用荧光直接标记法。
如果计算出来的荧光强度大于软件里设置的数值（通道一阶导阈值） ，软件认为这个通道的荧光数据是有效的，进而计算ST值；
如果计算的荧光强度小于设置的数值则认为是无效的数据，略过，ST 会显示成0或者-1。
如果两个通道的荧光强度均小于所设置的数值，软件显示为 “重测 ”。
一：软件分析判断数据的逻辑步骤
2：根据ST（杂交时间）差值来判断
每一个位点的参数设置都需要这个位点的三种基因型的质控提供数据支持。 首先，计算出三种基因型的St差值。假设B为杂合子St差值，A、C为两个
纯和子St差值，其中A、C必定是一正一负，假设A为正，C为负。 画一坐标轴，将A、B、C标在X轴上，计算AB以及BC的中点在X轴的数值
，分别设为AB、BC。则AB为St上限，BC为St下限。
A2（探针2）+B （模板） C2
A1B （杂交分子） A2B （杂交分子
（1）当体系中只有二个以上的模板分子B，A1和A2探针各有一条时，模板足够多，不会 发生竞争，A1与A2均可结合B。
ISHprotocol荧光原位杂交技术实验方案
地高辛标记寡核苷酸，荧光标记二抗，ISH，冰冻切片操作过程：1、多甲固定：应尽量在半个小时内完成。
（固定时间以24-36小时为宜，避免RNA降解或固定过度。
）2、切片:为获得高杂交信号，冰冻切片应切成10um-20um。
（选用16um）（切好的片子可以保存在-70度中）但是要注意，保存在-70度中的切片，拿出来以后，立即在4%的多甲中重新固定，避免在重新固定前切片恢复室温。
（重新固定10-15min）3、用0.1MPB洗切片3*5min4、切片放入100%乙醇5min，空气中干燥。
杂交液：（20ml）藏于-20度20*SSC 4ml硫酸葡聚糖 4g去离子甲酰胺 10ml将他们溶解后，加入以下物质：Poly A（10mg/ml） 0.5 mlSsDNA（10mg/ml） 0.5 mltRNA （10mg/ml） 0.5 mlDTT (1M) 2ml50*Denhardts 0.2ml上述溶液可以配置后长期贮藏与-20度中，用前预热到37度。
杂交溶液：将地高辛加入杂交液中，探针的浓度需要摸索（一般是100ng-1000ng/ml，一般是以200ng/ml为起点来摸索条件），所加的杂交液的体积看切片的大小来决定，对于2cm*2cm的组织，一般是加50ul，但是对于嗅球，可能30-40ul足够。
加好杂交液以后，用盖玻片盖上切片（注意中间不要留有任何的气泡），为防止杂交液从盖玻片中流走，注意使切片保持水平，并且注意切片不能干燥，（干燥的话杂交会有一个很高的背景）在湿盒中37度杂交18小时，这个杂交时间可以延长到40小时来提高杂交的信号，但是前提是不能让切片干燥。
杂交后处理;制备0.5*SSC和1*SSC（从20*来稀释）并且保证这两种SSC在使用的时候的温度是55度。
注意配置0.5*SSC和1*SSC中含有10mM的DTT（将1.2g的DTT加入到800ml的SSC中）杂交后，用小镊子将盖玻片轻轻移走，然后倒掉杂交液，将切片放入洗液中，在振摇水浴中按照下面的要求来洗片：快洗： 1*SSC（10mMDTT）室温2*15min：1*SSC（10mMDTT）55度2*15min 0.5*SSC(10mMDTT) 55度1*10min 0.5*SSC（10mMDTT）室温将切片一直放在最后一步的溶液中一直到下一步操作。