项目三 经典色谱法
《色谱分析法》PPT课件
调整保留时间tR’：组分的保留时间与死时间之差值， 即组分在固定相中滞留的时间
tR' tR tm
或t
' R
tR
t0
保留体积VR：从进样开始到组分出现浓度极大点时 所消耗的流动相的体积
16(
t
' R
)2
W
5.54( tR' )2 W1 2
H eff L / neff
讨论：neff 和H eff 扣除了死时间，更能真实的反映柱效 k ，neff n理
小结
塔板理论的贡献：从热力学角度Hale Waihona Puke 提出了评价柱效高低的n和H的计算式
塔板数 n是色谱柱的特征参数。当色谱柱长度一定时，
2. 纵向扩散项（分子扩散项）：B/u
产生原因： 峰在固定相中被流动相推动向前、展开 →两边浓度差
纵向扩散系数 B 2 Dg
— 弯曲因子（ 1） 填充柱 1 空心毛细管柱 1
Dg — 组分在载气中的扩散系数（常数）
影响因素： B u tR ，B Dg
Dg
T
一般分类 液相色谱LC
分离方法
L-L分离
固定相
吸附在固定相表面的液体
液相-固定相 固定相表面键合的有机相
液固或吸附
离子交换
尺寸排阻
气 相 色 谱 GC （流动相为气 体）
气、液 气-键相 气-固定体
超临界流体色 谱 SFC （ 流 动 相超临界流体）
固体 离子交换树脂 聚合物中间隙 吸附在固定相表面的液体 固体表面键合的有机物 固体 固体表面键合的有机物
色谱法常见的方法
色谱法常见的方法色谱法常见的方法有：柱色谱法、薄层色谱法、气相色谱法、高效液相色谱法等。
柱色谱法是最原始的色谱方法，这种方法将固定相注入下端塞有棉花或滤纸的玻璃管中，将被样品饱和的固定相粉末摊铺在玻璃管顶端，以流动相洗脱。
常见的洗脱方式有两种，一种是自上而下依靠溶剂本身的重力洗脱，一种是自下而上依靠毛细作用洗脱。
收集分离后的纯净组分也有两种不同的方法，一种方法是在柱尾直接接受流出的溶液，另一种方法是烘干固定相后用机械方法分开各个色带，以合适的溶剂浸泡固定相提取组分分子。
柱色谱法被广泛应用于混合物的分离，包括对有机合成产物、天然提取物以及生物大分子的分离。
薄层色谱法是应用非常广泛的色谱方法，这种色谱方法将固定相图布在金属或玻璃薄板上形成薄层，用毛细管、钢笔或者其他工具将样品点染于薄板一端，之后将点样端浸入流动相中，依靠毛细作用令流动相溶剂沿薄板上行展开样品。
薄层色谱法成本低廉操作简单，被用于对样品的粗测、对有机合成反应进程的检测等用途。
气相色谱仪是机械化程度很高的色谱方法，气相色谱系统由气源、色谱柱和柱箱、检测器和记录器等部分组成。
气源负责提供色谱分析所需要的载气，即流动相，载气需要经过纯化和恒压的处理。
气相色谱的色谱柱一般直径很细长度很长，根据结构可以分为填充柱和毛细管柱两种，填充柱比较短粗，直径在5毫米左右，长度在2－4米之间，外壳材质一般为不锈钢，内部填充固定相填料；毛细管柱由玻璃或石英制成，内径不超过0.5毫米，长度在数十米到一百米之间，柱内或者填充填料或者图布液相的固定相。
柱箱是保护色谱柱和控制柱温度的装置，在气相色谱中，柱温常常会对分离效果产生很大影响，程序性温度控制常常是达到分离效果所必须的，因此柱箱扮演了非常重要的角色。
检测器是气相色谱带给色谱分析法的新装置，在经典的柱色谱和薄层色谱中，对样品的分离和检测是分别进行的，而气相色谱则实现了分离与检测的结合，随着技术的进步，气相色谱的检测器已经有超过30种不同的类型。
12、色谱法
主要用于相对分子质量高于2000的大分子 的分离
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亲和色谱法（AC）简介
• 亲和色谱是利用生物大分子和固定相表面存在 某种特异性亲和力，进行选择性分离的一种方 法。 • 它通常是在载体（无机或有机填料）表面先键 合一种具有一般反应性能的所谓间隔臂（如环 氧、联氨等）；随后，再连接上配基（酶、抗 原或激素等）。 • 这种固载化的配基将只能和具有亲和力特性吸 附的生物大分子相互作用而被保留，没有这种 作用的分子不被保留。
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三. 色谱法的基本原理
3. 分配系数K
分配色谱的分离是基于样品组分在固定相和流动相之间反复多次的分 配过程，而吸附色谱的分离是基于反复多次的吸附-脱附过程。这种分离过 程经常用样品分子在两相间的分配来描述，而描述这种分配的参数称为分 配系数K。 分配色谱是指在一定温度和压力下，组分在固定相和流动相之间分配 达平衡时的浓度之比值，即
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原
理
• 在生物体内，许多大分子具有与某些相 对应的专一分子可逆结合的特性。例如 抗原和抗体、酶和底物及辅酶、激素和 受体、RNA和其互补的DNA等，都具有 这种特性。 • 生物分子之间这种特异的结合能力称为 亲和力，根据生物分子间亲和吸附和解 离的原理，建立起来的色谱法称亲色谱 法。
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亲和色谱法应用范围
• 色谱法是一种分离方法. • 色谱分离总涉及两相. • 色谱分离的基础是物质在两相中分配系数的差 异. • 色谱分离是通过两相做相对移动.组分在两相 之间的分配反复多次进行,使混合物中各组分 之间的差异不断累积而实现的.
几个概念
• 色谱柱：进行色谱分离用的细长管。 • 固定相：管内保持固定、起分离作用的填充物。 • 流动相：流经固定相的空隙或表面的冲洗剂。
色谱分析法
第八节 离子色谱法
一、离子色谱法原理 二、离子色谱连续抑 制装置 三、离子色谱的应用
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离子色谱仪
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一、离子色谱法原理
(Ion Chromatography,简称IC)
以无机、特别是无机阴离子混合物为主要分析对象, 在 七十年代出现、八十年代迅速发展。 传统离子交换色谱存在着两个难于解决的问题： (1) 需要高浓度淋洗液洗脱且洗脱时间很长； (2) 洗脱后的组分缺乏灵敏、快速的再线检测方法。
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离子色谱连续抑制装置图
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三、离子色谱的应用
阴离子分析: 双柱；薄壳型阴离子交换树脂分离柱(3×250mm), 流动相：0.003mol·L-1 NaHCO3 / 0.0024 mol·L-1 Na2CO3， 流量138 mL/hr。
七种阴离子在20分钟内基本上得到完全分离，各组分 含量在3～50 ppm。
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离子色谱具有以下优点：
（1）分析速度快
可在数分钟内完成一 个试样的分析； （2）分离能力高
在适宜的条件下，可使 常见的各种阴离子混合物 分离；例：使用双柱法， 在十几分钟内，可使七种 阴离子完全分离。
（3）分离混合阴离子的最有效方法
（4）仪器流路采用全塑件，玻璃柱，耐腐蚀
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请选择内容：
第一节 色谱法概述
第二节 气相色谱仪
第三节 色谱理论基础
第四节 气相色谱操作条件选择
第五节 色谱定性、定量方法
第六节 毛细管色谱
第七节 液相色谱法
第八节 离子色谱法
第九节 高效毛细管电泳
最新3第三章色谱分析法-3-1
色谱分析法
色谱分析法概述 气相色谱的固定相 气相色谱仪器 色谱的理论基础 气相色谱分离条件的选择 色谱定性、定量分析方法
➢ 色谱法简单分类
气相色谱法 (GC)
填充柱气相色谱法 毛细管柱气相色谱法
液相色谱法 (LC)
柱色谱法
经典液相柱色谱法
高效液相色谱法 (HPLC)
度好。适宜分离非极性或弱极性组分的试样。 缺点是表面存有活性吸附中心点。
白色担体：煅烧前原料中加入了少量助溶剂（碳酸钠）。
颗 粒疏松，孔径较大。表面积较小，机械强度 较差。但吸附性显著减小，适宜分离极性组分 的试样。
硅藻土的显微图象
填充柱气液色谱担体一览表
种类 红色
硅 硅藻土 藻 担体 土 类
担体名称
缺点：对未知物的定性比较困难 解决方法：与其它分析方法联用（质谱、
红外和电化学等类： 活性炭：有较大的比表面积，吸附性较强。 活性氧化铝：有较大的极性。适用于常温下O2、N2、
CO、CH4、C2H6、C2H4等气体的相互分离。CO2能被活 性氧化铝强烈吸附而不能用这种固定相进行分析。 硅胶：与活性氧化铝大致相同的分离性能，除能分析上 述物质外，还能分析CO2、N2O、NO、NO2等，且能够 分离臭氧。
高分子微球
非
硅
玻璃微球
藻
土
氟担体
类
适用于涂渍极性固定液分析极性物质 催化吸附性小，减小色谱峰拖尾
上海试剂厂
由苯乙烯和二乙烯苯共聚而成
上海试剂厂
经酸碱处理，比表面积 0.02 m2 / g ,可在 较高温度下使用，适宜分析高沸点物质。 由四氟乙烯聚合而成，比表面积 10.5 m2 /
g 适宜分析强极性物质和腐蚀性物质
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硅湖职业技术学院朱建民
项目三经典色谱法——薄层色谱法分离植物叶色素
一、实验目的
学习和掌握薄层色谱法分离有机化合物的基本原理和实验技术。
二、基本原理
薄层色谱法 (TLC)是把吸附剂或支持剂铺在玻璃板上，将样品点在其上，然后用溶剂展开，使样品中各个组分相互分离的方法。
这是一种简便、快速、微量的分离分析技术，其应用范围非常广泛。
根据分离原理的不同，TLC可分为吸附薄层色谱、分配薄层色谱和离子交换
薄层色谱等，本实验主要应用吸附色谱。
对于吸附薄层色谱来说,被分离物质的分子
同时受到吸附剂的吸附和溶剂的溶解作用。
由于混合
物中不同物质与吸附剂 (固定相)之间的吸附力不同
和不同物质在溶剂(流动相)中的溶解度不同，因此，
当这种吸附和溶解 (解吸)达到平衡时，不同的物质
在固定相和流动相之间便具有不同的质量分配比或
平衡常数 (K)。
随着固定相和流动相的连续不断地相
对移动,物质在固定相和流动相之间的平衡状态将会
不断地被打破和重新建立,物质也因此而随着流动相
的运动而移动。
那些与吸附剂吸附力小，在流动相中
溶解度大的物质将移动的较快,相反,那些与吸附剂
吸附力较大，在流动相中溶解度较小的物质则移动的
较慢。
这样,不同的物质便由于其移动速度的不同而
得到分离。
物质在薄层板上移动速度常用Rf值 (比移值)表示，其定义是:
影响Rf值的因素很多，如薄层的厚度，吸附剂的种类、粒度、活度 (吸附能力)，展开剂的纯度、组成及挥发性，展开方式 (上行或下行)，层析缸的形状、大小及饱和程度,外界温度等。
但是，在固定的条件下,某化合物的Rf值是一个常数。
因此，在条件完全相同的情况下，Rf值可以作为鉴定和检出该化合物的指标，就像测定熔点或其它物理常数一样。
为了获得相同的色谱条件，通常是把未知样和标准样同时滴加在同一块薄板上。
三、实验内容与步骤
植物叶色素的分离
材料绿色叶子 (青草、树叶均可)
试样植物叶的石油醚:乙醇 (2:1)提取液
薄层板硅胶G板
展开剂苯:丙酮=7:3(V/V)
显色剂自显色:卡黄素类 (橙色)、叶绿素a (蓝绿色)、叶绿素b(绿色)、叶黄素 (黄色)。
(2)操作步骤
①制板:每组洗净2块载玻片，晾干备用。
称取3-3.5g硅胶G倒入研钵中，拌匀，继续搅拌至稠度适宜的均匀糊状物，立即按平铺法铺制薄层板 (从调糊到铺好板应在 1-1.5 min内完成，否则煅烧石膏遇水迅速固化)。
平放，晾干备用。
②点样:在距薄板一端约 1.5 cm处，用铅笔轻轻划一条与底边平行的直线，并确定各样品点样位置。
然后用毛细管吸取提取液进行点样。
三个样点之间的距离约0.7 cm，薄层两边距离约0.5 cm，晾干。
③展开和显色:用上行法展开，待展开剂上升到距顶端 l cm处时取出，用小针画出溶剂前沿。
④测量Rf值，与标准样点比较，确认混合样各组分斑点的归属。
记录，并将色谱图描绘下来，附在报告中。
五、思考题
(1)薄层色谱的基本操作有哪几个关键技术？在各个操作中应注意哪些事项？
(2)单纯依据一个化合物的Rf值可否进行定性鉴定？为什么？。