免疫组织化学直接法和间接法优缺点总结
免疫组化实验原理
Ig的基本结构与性质
• 每条Ig单体皆有2条相同的重链和2条相同
的轻链构成，链间以二硫键连接。在多肽 链的N端因氨基酸序列不同而有2个可变区， 它们是结构相同的2个Fab片段，因此一个 Ab单体分子有2个Ag结合部位（双价）；在 C端氨基酸序列稳定为恒定区，即Fc片段， 是第二抗体的结合部位或受体结合部位。
• 在做免疫组化及染色之前，一般先做
常规HE染色，以评估组织切片的质量
及组织细胞的成分，避免因切片问题
引起免疫组化的阴性结果。
免疫组化技术的应用
• 确定细胞类型 • 辨认细胞产物 • 了解分化程度 • 鉴定病变性质 • 发现微小转移灶 • 探讨肿瘤起源或分化表型 • 确定肿瘤分期 • 指导预后和治疗 • 辅助疾病诊断和分类 • 寻找感染病因
组织抗原 抗体
标记物
1 荧光 2酶 3 亲和技术 4 金标
标记抗体
免疫组化反应原理
＋ 组织抗原
标记抗体
标记的抗原抗体复合物
抗原（Antigen）
• 概念：进入机体后刺激机体免疫系统产生抗体,并
能和相应的抗体发生特异性结合的物质。
蛋白质,多肽,酶,激素,细菌多糖,类脂质等
• 特性： • 免疫原性—引起机体产生抗体或致敏淋巴细胞 • 反应原性—与相应的抗产生的，只针对一 个抗原决定族，故所有抗体在分子结构上是完全一 样的，因此是最纯的抗体。
• 优点：高度稳定性，高度特异性 • 缺点：成本较高，敏感性较PcAb稍低
两种免疫组化反应方法
直接法
二抗
PcAb
一抗
McAb
间接法
间接法
• 先将组织或细胞中的某些化学物质提取出
缺点：灵敏度低，所需抗体量大（不经济） 应用：基本不用！
Ge 免疫组织化学染色技术
Mallory三色染色法：染料试剂：苯胺蓝、橘黄G、酸性复红、重铬酸钾、磷钨酸、醋酸免疫组织化学的主要染色方法第一篇概述免疫组织化学染色法：免疫组织化学染色法是指在抗体上结合萤光或可呈色的化学物质，利用免疫学原理中抗原和抗体间专一性的结合反应，检测细胞或组织中是否有目标抗原的存在，此方式不只可以用来测知抗原的表现量也可观察抗原所表现的位置。
只要是能够让抗体结合的物质，也就是具有抗原性的物质包括蛋白质、核酸、多糖、病原体等都可侦测。
染色注意事项：/detail-68.html一、直接法二、间接法三、未标记抗体法抗体和酶、荧光素结合后，或多或少的降低了抗体与抗原的结合能力。
有酶桥法和PAP法，但前者弊端较多。
PAP法（Peroxidase Antiperoxidase. PAP)PAP复合物（二分子抗体，三分子酶），体积小，稳定，穿透性好特点：较间接法敏感20~100倍，较前几种方法非特异性染色轻。
四、ABC 法（Avidin-Biotin-Complex Method）Avidin——卵白素，有四个亚单位，每个亚单位有138个氨基酸，分子两68kD。
一个卵白素分子能与4个分子的生物素结合，基本上不可逆，比抗原抗体结合力大1000000倍，只有在pH1.5的条件下才能将其分离。
Biotin——生物素，一分子的抗体可结合150个生物素分子，和多种酶结合后，不影响催化活性。
四、LAB法（Labeled Avidin-Biotin）特点：1.敏感性较PAP法提高20~40倍；2.非特异性染色几乎没有；3.可用于IHC，核酸杂交等五、免疫组织化学染色方法的选择原则五个“S”原则1.Specificity 特异性间叶组织，上皮组织恶性肿瘤，多克隆抗角蛋白抗体，特异性广鳞状上皮或腺上皮，单克隆抗角蛋白抗体，特异性高；2.Sensitivity 敏感性敏感性高，特异性下降，假阳性增加；敏感性低，特异性高，假阴性增加；3.Simplicity 简便性选用方法愈简便愈好；4.Safety 安全性5.Save (time and money)第二篇：免疫组织化学主要方法举例步骤取材：主要来源于活检标本、手术切除标本及尸体解剖标本。
(整理)免疫组化知识
免疫组织化免疫组织化学免疫组织化学（Immunohistochemistry）又称免疫细胞化学。
它是组织化学的分支，它是用标记的特异性抗体（或抗原）对组织内抗原（或抗体）的分布进行组织和细胞原位检测技术。
1．发展简史——1941年Coons首先用荧光素标记抗体一检测肺组织内的肺炎双球菌获得成功。
60年代Nakane建立酶标抗体技术铁蛋白标记Ab技术。
——70年代Stemberger改良上述技术，建立辣根过氧化物酶——抗体过氧化物酶（PAP）技术，使免疫细胞化学得到广泛应用。
——80年代Hsu等建立了抗生物素一生素（ABC）法之后，免疫金一银染色法、半抗原标记法、免疫电镜技术相继问世。
——90年代分子杂交技术、原位杂交技术、免疫细胞化学分类方法迅速发展。
——2000年各种免疫组化技术更加成熟，使免疫组化技术成为当今生物医学中形态、功能代谢综合研究的一项有力工具。
其应用范围深达医学各个学科，是目前生命科学工作者应该掌握的基本技术之一。
2．免疫组织化学的技术分类（1）根据染色方式分成：①贴片染色；②漂浮染色。
（2）根据Ag—Ab结合方式分成：①直接法；②间接法；③多层法。
（3）按标记物的性质分成：①免疫荧光技术（免疫荧光法）；②免疫酶技术（酶标抗体法、桥法、PAD法、ABC法）；③免疫金属技术（免疫铁蛋白法、免疫金染色法、蛋白A金法）。
3．标记物（1）必要性：组织细胞内Ag—Ab结合反应一般是不可见的，若在镜下检测，则必须具有可视性标记物。
（2）常用标记物①荧光素：最常用的是异硫一氰酸荧光素（Fluoresceinisothiocyanate，FITC）荧光显微镜下呈绿色荧光四乙基罗达明（rho—damineRB200）——荧光显微镜下发橙红色荧光；②酶：辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶。
③生物素：（Biotin）④铁蛋白金等：主要应用于免疫电镜。
其他：如同位素（因涉及污染和防护难一般不用）4．应用凡是组织细胞内具有抗原性的物质，如肽类、激素、神经递质、细胞因子、受体、表面抗原等等均可用免疫组织化学方法显示，因而目前在基础与临床科研中被广泛应用。
免疫组化分类
免疫组化分类免疫组化是一种生物学方法，它主要通过特定的抗体与抗原之间的反应，来研究细胞组成成分的分布和定位。
免疫组化的方法分为直接法和间接法，这两种方法有明显的差异并各有优势和局限。
下面就详细解释一下这两种免疫组化的分类。
直接法免疫组化直接法免疫组化是一种简单有效的实验方法。
它的基本原理是通过抗原抗体反应，抗体与目标抗原直接结合，然后通过加入荧光发光物质或酶活性物质，使抗体呈现出可见的颜色或荧光，从而实现对局部抗原的定位。
此法的优点在于操作简单，只需要一个步骤就可以完成，而且结果直观明确，容易控制实验条件。
然而，它的敏感度相对较低，对抗原的检测能力有限，比较适合于大量存在的抗原检测。
间接法免疫组化与直接法相比，间接法免疫组化更加复杂，但是它的敏感度和特异性都非常高。
间接法的原理是，首先用一种抗体直接与目标抗原结合，然后加入荧光或酶标记的二抗反应，二抗会特异性地结合在一抗上，通过相应的显色反应，可以实现对抗原的定位和定量分析。
间接法的主要优点是敏感度高，可以检测到微量的抗原，并且可以对抗原进行定量分析。
由于二抗的选择性强，可以结合在多个一抗上，因此间接法的信号放大效果显著，结果较明确。
不过，间接法的操作步骤多，时间相对较长，可能会增加实验中的误差。
除了上述两种基本的方法，免疫组化还有其他的分类方法，比如根据抗体来源的不同，可以分为多克隆抗体和单克隆抗体的免疫组化，前者的特异性较差，但覆盖面广，后者的特异性强，但覆盖面窄。
还有根据抗原定位的不同，可以分为细胞表面抗原免疫组化和细胞内抗原免疫组化，区别在于加工样本的方法和使用的抗体不同。
总结免疫组化是一种强大的研究方法，根据不同的需要，我们可以选择不同类型的免疫组化。
直接法主要用于简单快速的实验，而间接法则用于敏感性高，需要放大信号的场合。
在实际应用中，我们还需要根据抗体的来源和抗原的定位选择合适的免疫组化方法。
免疫组化的正确使用，能够使我们的研究结果更准确，也有利于科研的发展。
免疫组织化学染色技术
汇报结束
谢谢大家! 请各位批评指正
器官或组织特异性抗原标记物
前列腺标记物： PSA， PSAP，PSMA，P504s 甲状腺标记物：TG，CT，TTF-1 甲状旁腺：PTH 黑色素细胞标记物：MB45，S100，MelanA 肺腺癌的标记物：TTF-1，SP-A和B， Napsin A 肝细胞癌标记物：Hep-1 乳腺： Mammaglobio，GCDFP15 结肠： CDX2，B-catenin 宫颈癌：P16
免疫胶体金技术
1.标记物：特殊的 金属颗粒-胶体金
2.特性：特别适用 于电镜的单标记 或多标记。也适 用于光镜研究。
电子显微镜胶体金包埋后染色
四、免疫组化技术特点：（熟悉）
3.形态、代谢和功能三结合 4.定性、定位和定量三位一体 5特异性强
原始位置的反应：细胞层面—膜、核、浆 细胞器层面
根据标记的种类不同，显色效果不同： 荧光标记-荧光素显色 酶标记-酶底物显色 胶体金技术—光镜、电镜均显色
癌可能的起源
❖较常见的临床情况：
▪ 淋巴结或其它部位不明起源的转移癌 ▪ 卵巢腺癌，怀疑为胃肠道癌转移 ▪ 膀胱腺癌，怀疑为侵犯/转移的前列腺癌或结肠癌 ▪ 有结肠癌病史的患者肺部有一孤立性结节：结肠癌转
移还是新的肺原发性肿瘤？
卵巢腺癌：原发还是肠起源
CK7 CK20 CDX-2
卵巢起源
肠起源
+
两大特性：免疫原性、免疫反应性。
外源性抗原：微生物、花粉等
抗
内源性抗原：隐蔽的自身抗原、
原 处
肿瘤相关抗原等
处
同种异型抗原：人类白细胞抗原
免疫组化小结13年
卵白素
ABC法
LSAB法
ABC法与S-P法的特点和区别点
特点 1.均为亲和细胞化学方法；
2.生物素化二抗与特异性一抗结合；
3.亲和素(Avidin)与生物素(Boitin)结合； 4.亲和素与链霉亲和素(Streptavidin)均有四个结合 位点,其中三个位点与酶(HRP和AKP)结合,一个位点与 生物素结合。
和不同点？
• 2.PAP法、ABC法、EnVision法的共同点和不同点？ • 3.免疫荧光组化法、免疫酶组化法和免疫金银组化 方法间的共同点和不同点？ • 4.PAP法、ABC法、EnVision法和IGSS法的共同点和
不同点？
• 5.S-P法与CSA法的共同点和不同点？
CSA法原理图
4.金-------免疫胶体金法 IGS法、IGSS法 5.铁-------免疫胶体铁法
组织抗原 第一抗体 过氧化物酶
直接法
组织抗原 第一抗原 第二抗体 过氧化物酶
间接法
组织抗原 第一抗体 第二抗体 第三抗体（抗酶抗体） HRP
酶桥法
组织抗原 第一抗原 第二抗体 PAP复合物 HRP
PAP法
组织抗原 第一抗原 第二抗体 PAP复合物 HRP
双PAP法
APAAP法
多聚螯和物酶法
原位免疫PCR
Sano 等（ 1992 ）率先利用基因工程 的方法表达了蛋白A与链霉亲和素的嵌合 体分子获得成功，建立了免疫PCR技术, 一种新的抗原检测系统，随后在免疫 PCR 的基础上，建立了在细胞或组织原 位 检 测 抗 原 的 原 位 免 疫 PCR （ in situ immuno-PCR）。
二、与其他技术相结合的免疫 组化方法
RCA法 PCR-免疫组化方法
免疫组化常用方法
标记生物素-抗生物素技术(Labelled Avidin-biotin technique,LAB技术)
2.差异大,注意厂家、批号
3.4C保存
Disadvantages of ABC
1.ABC的IP约为10,中性pH时带正电荷,容易与nucleus等带负电荷结构非特异结合.
2.Avidin是glycoprotein,与lectins等分子通过碳水化合物连接
•通过用streptavidin(抗生蛋白链霉素)代替avidin克服上述缺陷.
3.标本:不能太厚
4.封裱剂:无自发荧光,无色透明,pH8.5-9.5,常用甘油和0.5mol/L pH9.0-9.5碳酸盐缓冲液等量混合
5.镜油:无荧光镜油,或甘油或液体石蜡
2.Enzyme-Mediated Detection
直接法(Direct)
间接法(Indirect)
基本原理
•以间接法法为例
•阳性对照：已知阳性
•阴性对照：
1.已知阴性
2.空白对照BS代替特异性抗体
3.替代对照:用同种属正常血清代替特异性抗体
4.吸收实验:先用抗原吸收一抗
5.抑制实验:先用未标记抗体,再用标记抗体
6.置换实验:用无关的特异性抗体代替一抗
Antibody Detection
• There are several different methods that can be employed to detect antibodies bound to tissue, depending upon whether the label used is enzymatic or fluorescent.
免疫组化（总结）
免疫组化免疫组织化学的概念：免疫组化是利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂(荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学。
免疫组化实验所用的组织和细胞标本：实验所用主要为组织标本和细胞标本两大类，前者包括石蜡切片（病理大片和组织芯片）和冰冻切片，后者包括组织印片、细胞爬片和细胞涂片。
其中石蜡切片是制作组织标本最常用、最基本的方法，对于组织形态保存好，且能作连续切片，有利于各种染色对照观察；还能长期存档，供回顾性研究；石蜡切片制作过程对组织内抗原暴露有一定的影响，但可进行抗原修复，是免疫组化中首选的组织标本制作方法抗原修复——原因：常规的石蜡切片标本均用甲醛固定，结果使得：-抗原性物质形成醛键、羧甲键而被封闭了部分抗原决定簇；-蛋白之间发生交联而使抗原决定簇隐蔽。
*要求：在染色时，需要先进行抗原修复或暴露，即将固定时分子之间所形成的交联破坏，而恢复抗原的原有空间形态。
进行抗原暴露和修复的原则：1、寻找抗体说明的有关信息2、如无信息可先不经处理做免疫组化3、如染色结果呈阴性或阳性结果不理想，可用酶消化4、如还不理想用高温办法处理5、如再不理想可用酶和高温相结合处理6、如仍然是阴性结果，可能该抗体质量有问题。
常用的抗原修复方法：微波修复法，高压加热法，酶消化法，水煮加热法1．柠檬酸缓冲液高温高压抗原修复法（1）适用范围：适用于大量中性福尔马林固定、石蜡包埋组织切片的抗原修复，其效果优于微波修复法和直接煮沸修复法。
（2）仪器设备：普通家用压力锅、电炉、不锈钢或耐高温塑料切片架。
（3）试剂：0.01M 柠檬酸型缓冲液，pH6.0。
（3）操作步骤：①常规组织切片经二甲苯脱蜡、梯度酒精水化至水，待用；②取一定量0.01M柠檬酸盐缓冲液pH6.0（800～1000ml）于压力锅中，加热直至沸腾；将脱蜡水化后的组织切片置于不锈钢或耐高温塑料切片架上，放入已沸腾的缓冲液中，盖上锅盖，扣上压力阀，继续加热至喷气，开始计时1－2分钟后，压力锅离开热源，冷却至室温（稍冷后，可在自来水龙头下加速冷却），取出切片，先用蒸馏水冲洗两次，之后用PBS（pH7.2－7.4）冲洗两次，每次3分钟。
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免疫组织化学直接法和间接法优缺点总结
免疫组织化学是一种用于检测细胞或组织中特定抗原或抗体的技术手段。
其主要应用于病理学诊断、生物医学研究和临床治疗等领域。
在
免疫组织化学中，直接法和间接法是两种常用的技术路线，在具体应
用时各自具有一些优点和缺点。
本文将针对这两种方法进行系统总结，以期为免疫组织化学技术的选择提供一定的参考依据。
一、直接法
直接法是指在组织切片上直接检测抗原或抗体的方法。
其步骤主要包括：
1. 杀菌、固定和脱水处理
2. 抗原修复
3. 封闭剂处理
4. 抗体标记
5. 染色显示
直接法的主要优点包括：
1. 操作简便，节省时间
2. 对目标抗原或抗体的确认准确性高
3. 信号直接来源于目标物质，信号强度相对稳定
直接法的缺点包括：
1. 信号叠加或掩盖现象相对较多
2. 容易产生假阳性或假阴性结果
3. 针对不同抗体需要反复优化条件
二、间接法
间接法是指在组织切片上间接检测抗原或抗体的方法。
其步骤主要包括：
1. 杀菌、固定和脱水处理
2. 抗原修复
3. 封闭剂处理
4. 一抗处理
5. 二抗标记
6. 染色显示
间接法的主要优点包括：
1. 信号放大效应明显，检测灵敏度高
2. 信号叠加或掩盖现象相对较少
3. 可以使用多种不同抗体进行多重染色
间接法的缺点包括：
1. 操作相对复杂，耗时较长
2. 对目标抗原或抗体的确认准确性略低
3. 信号来源于间接标记物质，信号强度相对不稳定
三、综合比较
在实际应用中，直接法和间接法各自有其适用的范围。
直接法适用于对抗原或抗体的确定性检测需求较高的情况，例如对细胞表面抗原的检测；而间接法适用于对抗原或抗体的放大检测需求较高的情况，例如对低表达抗原的检测。
在选择具体方法时，应根据实际实验目的和样本特点来进行综合考量，以确保获得可靠和准确的实验结果。
免疫组织化学直接法和间接法各有其优缺点，科学家在具体选择使用时应结合实验目的，灵活运用，以达到最佳的实验效果和结果。
希望本文能为相关科研工作提供一定的参考价值。
由于免疫组织化学直接法和间接法各有其优缺点，并且在不同的实验需求下有着各自的适用范围，因此在实际科研工作中，科学家们需要根据具体情况灵活选择合适的技术路线。
除了考虑直接法和间接法的特点之外，还需要充分了解它们的工作原理和操作流程，以便正确使用和优化这两种方法。
要充分理解直接法和间接法的工作原理。
直接法是在组织切片上直接检测目标抗原或抗体，因此信号的来源直接而单一；而间接法则是利用间接标记物质来放大信号，从而提高检测灵敏度。
对于需要确定性检测的情况，直接法可以提供更可靠的结果，因为信号来源直接且单一，减少了干扰因素的可能。
而间接法在需要对抗原或抗体进行放大检测的情况下，能够更好地满足实验需求，提高检测的灵敏度。
科学家们需要熟悉直接法和间接法的操作流程，并了解各个步骤的影
响因素。
在直接法中，抗原修复的质量对结果影响较大，需要选择合
适的修复方法和条件；在间接法中，一抗和二抗的选择和配对是至关
重要的，需要根据实验需求和样本特点进行合理的选择和搭配。
对于
免疫组织化学中的封闭剂处理、染色显示等步骤也需要细致地进行优
化和调试，以确保实验的顺利进行和结果的准确可靠。
在实际操作中，科学家们还需要注意避免直接法和间接法的一些常见
问题。
在直接法中，需要特别注意信号叠加或掩盖现象，避免影响结
果的准确性；在间接法中，要注意避免信号的非特异性结合和背景的
干扰。
在选择抗体和标记物时，需要充分考虑它们的特异性和稳定性，以避免产生假阳性或假阴性结果。
另外，对于某些特殊实验需求，直接法和间接法还可以进行一些改进
和扩展。
在直接法中引入放大信号的技术，可以提高其灵敏度和准确性；在间接法中，可以引入多重染色技术，用于同时检测多种抗原或
抗体，从而扩展其应用范围。
这些改进和扩展都可以使直接法和间接
法更加灵活和实用，满足不同实验需求。
在选择和使用直接法和间接法时，科学家们还需要考虑实验的成本和
时间因素。
通常情况下，间接法相对于直接法来说，操作流程更加繁琐，因此需要更多的实验时间；由于间接法需要使用二抗来放大信号，因此其成本也相对较高。
在考虑实验的预算和时间安排时，科学家们
需要权衡利弊，选择最适合自己实验需求的方法。
免疫组织化学直接法和间接法各有其独特的优势和局限性，科学家们需要结合实际需求和样本特点，灵活选择和使用这两种方法。
还需要充分了解它们的工作原理和操作流程，并在实际操作中注意避免常见问题，可以根据需要进行改进和扩展。
相信通过对直接法和间接法的充分了解和正确使用，可以为免疫组织化学技术的应用提供更多可能性和机遇，促进相关科研工作的开展和进步。