仪器分析 18高效液相色谱法 图文
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仪器分析高效液相色谱PPT课件
广义地讲，除柱色谱外，薄层色谱（液—固色谱）和纸色谱（液—液 色谱）也属于LC。
狭义的LC指柱色谱。按分离机理，柱色谱法可分为液—固吸附色谱、 液—液分配色谱、键合相色谱、离子色谱等。
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2020/4/22
4
6.1.1液—固吸附色谱法
液---固吸附色谱是以固体吸附剂作为固定相，吸附剂通常是些多 孔的固体颗粒物质（如硅胶、氧化铝等），在它们的表面存在吸附中 心。液固色谱实质是根据物质在固定相上的吸附作用不同来进行分离 的。 1．分离原理
.
2020/4/22
8
液液分配色谱
正相色谱法
1.极性固定相 聚乙二醇、氨基与腈基键合相 2.相对非极性流动相 正已烷、环已烷 3.极性调节剂 乙醇、四氢呋喃、三氯甲烷 4.分离中等极性和极性较强化合物. 酚类、胺类、羰基类及氨基酸类 5.组分流出顺序 极性小先洗出
(3)气相色谱一般都在较高温度下进行的，而高效液相色谱法则经常可 在室温条件下工作。P296
从色谱分析的发展来看，HPLC比GC更为有用、更具发展前途
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2020/4/22
2
3.HPLC的特点
1、样品不必气化 2、分离温度低 3、选择性好 4、样品回收容易 5、分离效果好 塔板数达到104 ~105/m 6、采用高压输液泵，高效微粒固定相和高灵敏度检测器 7、仪器设备费用昂贵，操作严格。
是流动相尽可能不与固定相互溶，而且流动相与固定相的极性差别越 显著越好。
根据所使用的流动相和固定相的极性程度，将其分为正相分配色谱 和反相分配色谱。
如果采用流动相的极性小于固定相的极性，称为正相分配色谱， 它适用于极性化合物的分离。其流出顺序是极性小的先流出，极性大 的后流出。
如果采用流动相的极性大于固定相的极性，称为反相分配色谱，它 适用于非极性化合物的分离，其流出顺序与正相色谱恰好相反。
狭义的LC指柱色谱。按分离机理，柱色谱法可分为液—固吸附色谱、 液—液分配色谱、键合相色谱、离子色谱等。
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6.1.1液—固吸附色谱法
液---固吸附色谱是以固体吸附剂作为固定相，吸附剂通常是些多 孔的固体颗粒物质（如硅胶、氧化铝等），在它们的表面存在吸附中 心。液固色谱实质是根据物质在固定相上的吸附作用不同来进行分离 的。 1．分离原理
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液液分配色谱
正相色谱法
1.极性固定相 聚乙二醇、氨基与腈基键合相 2.相对非极性流动相 正已烷、环已烷 3.极性调节剂 乙醇、四氢呋喃、三氯甲烷 4.分离中等极性和极性较强化合物. 酚类、胺类、羰基类及氨基酸类 5.组分流出顺序 极性小先洗出
(3)气相色谱一般都在较高温度下进行的，而高效液相色谱法则经常可 在室温条件下工作。P296
从色谱分析的发展来看，HPLC比GC更为有用、更具发展前途
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3.HPLC的特点
1、样品不必气化 2、分离温度低 3、选择性好 4、样品回收容易 5、分离效果好 塔板数达到104 ~105/m 6、采用高压输液泵，高效微粒固定相和高灵敏度检测器 7、仪器设备费用昂贵，操作严格。
是流动相尽可能不与固定相互溶，而且流动相与固定相的极性差别越 显著越好。
根据所使用的流动相和固定相的极性程度，将其分为正相分配色谱 和反相分配色谱。
如果采用流动相的极性小于固定相的极性，称为正相分配色谱， 它适用于极性化合物的分离。其流出顺序是极性小的先流出，极性大 的后流出。
如果采用流动相的极性大于固定相的极性，称为反相分配色谱，它 适用于非极性化合物的分离，其流出顺序与正相色谱恰好相反。
高效液相色谱仪ppt课件
8
高压泵应具有以下性能
流量稳定，精度在1%左右 输出压力高，通常20~30MPa，最高50 MPa 流量范围宽，一般在0.01~10mL/min范围内 能抗溶剂腐蚀 压力波动小、更换溶剂方便、容易清洗、具梯度洗脱 操作方便、容易维修
9
根据泵的操作原理不同，分为恒压泵和恒流泵
进样装置 （正面）
进样装置 （背面）
11
图中a为进样阀处于“装样load”位置的情况，此时流动相直接进入色谱柱，
样品注入口与样品环连接，用微量进样针将一定体积的样品溶液从样品 注入口注入，装于样品管内。当将扳手扳至“进样inject”位时，进样阀的 流路发生了改变，流动相通过样品管，将注入的样品带入色谱柱进行分析。
的出峰顺序相反。
30
2. 流动相类别
按流动相组成成分：单组分和多组分；
按极性分：极性、弱极性、非极性； 按使用方式分：固定组成淋洗和梯度淋洗。 常用溶剂： 正己烷、四氢呋喃、乙酸乙酯、乙醇、 甲 醇、异丙醇、乙腈、水。 采用二元或多元组合溶剂作为流动相可以灵活调节流动 相的极性或增加选择性，以改进分离或调整出峰时间。
氰基(CN)的键合相填料。由于硅胶表面的硅羟基(SiOH)或其他极性基 团极性较强，因此，分离的次序是依据样品中各组分的极性大小，即 极性较弱的组份最先被冲洗出色谱柱；正相色谱使用的流动相极性相 对比固定相低，如正已烷、氯仿 、二氯甲烷等。
反相柱：固定相通常是以硅胶为基质，表面键合有极性相对较弱官能团的
键合相。反向色谱所使用的流动相极性较强，通常为水、缓冲液与甲 醇，乙腈等的混合物。样品流出色谱柱的顺序是极性较强的组分最先被 冲洗出，而极性弱的组分会在色谱柱上有更强的保留。常用的反向填 料有:C18(ODS)、C8(MOS)、C4(Butyl)、C6H5(Phenyl)等。
高压泵应具有以下性能
流量稳定，精度在1%左右 输出压力高，通常20~30MPa，最高50 MPa 流量范围宽，一般在0.01~10mL/min范围内 能抗溶剂腐蚀 压力波动小、更换溶剂方便、容易清洗、具梯度洗脱 操作方便、容易维修
9
根据泵的操作原理不同，分为恒压泵和恒流泵
进样装置 （正面）
进样装置 （背面）
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图中a为进样阀处于“装样load”位置的情况，此时流动相直接进入色谱柱，
样品注入口与样品环连接，用微量进样针将一定体积的样品溶液从样品 注入口注入，装于样品管内。当将扳手扳至“进样inject”位时，进样阀的 流路发生了改变，流动相通过样品管，将注入的样品带入色谱柱进行分析。
的出峰顺序相反。
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2. 流动相类别
按流动相组成成分：单组分和多组分；
按极性分：极性、弱极性、非极性； 按使用方式分：固定组成淋洗和梯度淋洗。 常用溶剂： 正己烷、四氢呋喃、乙酸乙酯、乙醇、 甲 醇、异丙醇、乙腈、水。 采用二元或多元组合溶剂作为流动相可以灵活调节流动 相的极性或增加选择性，以改进分离或调整出峰时间。
氰基(CN)的键合相填料。由于硅胶表面的硅羟基(SiOH)或其他极性基 团极性较强，因此，分离的次序是依据样品中各组分的极性大小，即 极性较弱的组份最先被冲洗出色谱柱；正相色谱使用的流动相极性相 对比固定相低，如正已烷、氯仿 、二氯甲烷等。
反相柱：固定相通常是以硅胶为基质，表面键合有极性相对较弱官能团的
键合相。反向色谱所使用的流动相极性较强，通常为水、缓冲液与甲 醇，乙腈等的混合物。样品流出色谱柱的顺序是极性较强的组分最先被 冲洗出，而极性弱的组分会在色谱柱上有更强的保留。常用的反向填 料有:C18(ODS)、C8(MOS)、C4(Butyl)、C6H5(Phenyl)等。
高效液相色谱法 PPT课件
①固定相：非极性键合相 如十八烷基硅烷（C18，ODS）、辛烷基（C8）
键合硅胶 ②流动相：水为基础溶剂，加入一定量与水混溶的极 性调整剂
常用甲醇－水、乙腈－水等 应用：最广。非极性至中等极性的组分，（还有 有机酸、碱及盐等极性组分）
1. 保留机制:
疏溶剂理论 （solvophobic theory）
（二）紫外检测器(ultraviolet detector)
1.检测原理： 朗伯－比尔 (Lambert-Beer) 定律，响应信号 （吸光度）与浓度成正比A=εCl
2.特点： 灵敏度较高（10-6—10-9 g/ml），噪音低，线性 范围宽，稳定性好，适于梯度洗脱，不破坏样品， 应用广（分析、制备）。
三.与气相色谱法相比
气相试样
液相试样 气相流动相 液相流动相 气相柱温 液相柱温
气体、 容易转
气体、 常用氢气 液体、 、氮气
可用的
高柱温
溶剂较多
常温
变为气
固体
体的液
体
第一节 高效液相色谱法的主 要类型和原理
一、主要类型
四类基本类型色谱法 分配色谱法（partition chromatography） 吸附色谱法（adsorption chromatography） 离子交换色谱法（IEC） 空间排阻色谱法（SEC）
（二）流动相的强度和选择性
1.溶剂的极性（强度） 正相色谱：溶剂极性越强，洗脱能力越强 反相色谱：极性弱的溶剂洗脱能力强 2.溶剂的选择性
不同种类的溶剂，分子间的作用力不同，故 选择性不同
混合溶剂（二元或多元流动相）
以反相色谱流动相的选择为例：
反相色谱常用溶剂的强度因子
水
甲醇
乙腈
键合硅胶 ②流动相：水为基础溶剂，加入一定量与水混溶的极 性调整剂
常用甲醇－水、乙腈－水等 应用：最广。非极性至中等极性的组分，（还有 有机酸、碱及盐等极性组分）
1. 保留机制:
疏溶剂理论 （solvophobic theory）
（二）紫外检测器(ultraviolet detector)
1.检测原理： 朗伯－比尔 (Lambert-Beer) 定律，响应信号 （吸光度）与浓度成正比A=εCl
2.特点： 灵敏度较高（10-6—10-9 g/ml），噪音低，线性 范围宽，稳定性好，适于梯度洗脱，不破坏样品， 应用广（分析、制备）。
三.与气相色谱法相比
气相试样
液相试样 气相流动相 液相流动相 气相柱温 液相柱温
气体、 容易转
气体、 常用氢气 液体、 、氮气
可用的
高柱温
溶剂较多
常温
变为气
固体
体的液
体
第一节 高效液相色谱法的主 要类型和原理
一、主要类型
四类基本类型色谱法 分配色谱法（partition chromatography） 吸附色谱法（adsorption chromatography） 离子交换色谱法（IEC） 空间排阻色谱法（SEC）
（二）流动相的强度和选择性
1.溶剂的极性（强度） 正相色谱：溶剂极性越强，洗脱能力越强 反相色谱：极性弱的溶剂洗脱能力强 2.溶剂的选择性
不同种类的溶剂，分子间的作用力不同，故 选择性不同
混合溶剂（二元或多元流动相）
以反相色谱流动相的选择为例：
反相色谱常用溶剂的强度因子
水
甲醇
乙腈
高效液相色谱-HPLCppt课件.ppt
色谱法的分类
按固定相的形态分:
平面色谱 o 纸色谱
o 薄层色谱
柱色谱
▪篮球比赛是根据运动队在规定的比赛 时间里 得分多 少来决 定胜负 的，因 此，篮 球比赛 的计时 计分系 统是一 种得分 类型的 系统
色谱法的分类示意图
▪篮球比赛是根据运动队在规定的比赛 时间里 得分多 少来决 定胜负 的，因 此，篮 球比赛 的计时 计分系 统是一 种得分 类型的 系统
▪ 高压梯度洗脱（高压混合，高压进柱，2个 泵。）
▪篮球比赛是根据运动队在规定的比赛 时间里 得分多 少来决 定胜负 的，因 此，篮 球比赛 的计时 计分系 统是一 种得分 类型的 系统
▪安捷伦泵：小视频 ▪色谱学堂：泵
▪篮球比赛是根据运动队在规定的比赛 时间里 得分多 少来决 定胜负 的，因 此，篮 球比赛 的计时 计分系 统是一 种得分 类型的 系统
色谱法原理及分类
什么是色谱法 色谱法溯源 Tswett（茨维特)的实验 色谱法原理 色谱法的分类
▪篮球比赛是根据运动队在规定的比赛 时间里 得分多 少来决 定胜负 的，因 此，篮 球比赛 的计时 计分系 统是一 种得分 类型的 系统
什么是色谱法
色谱法是一种现代的分离分析方法 1906年正式命名(见诸文献) 20世纪30年代开始广泛研究和应用 高效液相色谱法的广泛应用始于20世纪70年代
1. 紫外—可见光度检测器：
①固定波长：254nm ， 低压汞 灯。
② 可 调 波 长 ： 190 ～ 800mm ， 钨灯，氘灯。
UV
③光电二极管矩阵检测器： 190～700nm。
接色谱柱 石英窗 光电倍增管
废液
▪篮球比赛是根据运动队在规定的比赛 时间里 得分多 少来决 定胜负 的，因 此，篮 球比赛 的计时 计分系 统是一 种得分 类型的 系统
高效液相色谱分析ppt课件
liquid-solid adsorption chromatograph
三、离子交换色谱
ion-exchange chromatograph
五、离子对色谱
ion-pair chromatograph
四、离子色谱
ion chromatograph
六、排阻色谱
size- exclusion chromatograph
用100μm的大颗粒，表面涂渍固定液，性能不佳已不多见； 现采用10μm以下的小颗粒，化学键合制备柱填料；
（2）表面多孔型担体 （薄壳型微珠担体） 30～40μm的玻璃微球，
表面附着一层厚度为1 ～ 2μm的多孔硅胶。
表面积小，柱容量底；
2019/9/23
（3）化学键合固定相
化学键合固定相: 目前应用最广、性能最佳的固定相； a. 硅氧碳键型： ≡Si—O—C b. 硅氧硅碳键型：≡Si—O—Si — C
传统离子交换色谱存在着两个难于解决的问题： (1)需要高浓度淋洗液洗脱且洗脱时间很长； (2)洗脱后的组分缺乏灵敏、快速的在线检测方法。
2019/9/23
1、离子色谱法原理
离子交换原理，与传统离子交 换的不同点： 采用交换容量非常低的特制离子 交换树脂为固定相； 细颗粒柱填料，高柱效；采用高 压输液泵； 低浓度淋洗液或本底电导抑制（在分离柱后，采用抑制柱 来消除淋洗液的高本底电导）； 可采用电导检测器，快速分离分析微量无机离子混合物； 各种抑制装置及无抑制方法的出现，发展迅速。
B2 Dm DmT
柱温T 低，流动相大B相忽略
2019/9/23
速率理论(与GC对比)
• 讨论：
• 1）流动相流速对HPLC板高的影响(与GC对比)next
三、离子交换色谱
ion-exchange chromatograph
五、离子对色谱
ion-pair chromatograph
四、离子色谱
ion chromatograph
六、排阻色谱
size- exclusion chromatograph
用100μm的大颗粒，表面涂渍固定液，性能不佳已不多见； 现采用10μm以下的小颗粒，化学键合制备柱填料；
（2）表面多孔型担体 （薄壳型微珠担体） 30～40μm的玻璃微球，
表面附着一层厚度为1 ～ 2μm的多孔硅胶。
表面积小，柱容量底；
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（3）化学键合固定相
化学键合固定相: 目前应用最广、性能最佳的固定相； a. 硅氧碳键型： ≡Si—O—C b. 硅氧硅碳键型：≡Si—O—Si — C
传统离子交换色谱存在着两个难于解决的问题： (1)需要高浓度淋洗液洗脱且洗脱时间很长； (2)洗脱后的组分缺乏灵敏、快速的在线检测方法。
2019/9/23
1、离子色谱法原理
离子交换原理，与传统离子交 换的不同点： 采用交换容量非常低的特制离子 交换树脂为固定相； 细颗粒柱填料，高柱效；采用高 压输液泵； 低浓度淋洗液或本底电导抑制（在分离柱后，采用抑制柱 来消除淋洗液的高本底电导）； 可采用电导检测器，快速分离分析微量无机离子混合物； 各种抑制装置及无抑制方法的出现，发展迅速。
B2 Dm DmT
柱温T 低，流动相大B相忽略
2019/9/23
速率理论(与GC对比)
• 讨论：
• 1）流动相流速对HPLC板高的影响(与GC对比)next
第二章高效液相色谱法31页PPT
主要部件之一，包括贮液装置、高压输液泵、过滤器、脱 气装置等 高压输液泵压力：150～350×105 Pa。 为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相（<10μm），液 体的流动相高速通过时，将产生很高的压力，因此高压、高 速是高效液相色谱的特点之一。 基本要求：
应具有压力平稳、脉冲小、流量稳 定可调、耐腐蚀等特性
又如用25cm×0.46cm的Lichrosorb－ODS(5μ) 的柱，采用梯度洗脱，可在不到0.5h内分离出尿中 104个组分.
2020/3/26
小结
综上所述，高效液相色谱法是吸取了气 相色谱与经典液相色谱的优点，具有高柱 效、高选择性、分析速度快、灵敏度高、 重复性好、应用范围广等优点。
目前高效液相色谱法已被广泛应用于分 析对生物学和医药上有重大意义的大分子 物质，例如蛋白质、核酸、氨基酸、多糖 类、植物色素、高聚物、染料及药物等物 质的分离和分析。
定量计算方法存入存储器中，需用时调出直接使用。
2020/3/26
2020/3/26
三、影响分离的因素 1. 固定相及分离柱
气相色谱中的固定液原则上都可以用于液相色 谱，其选用原则与气相色谱一样。
，分离柱的制备是一项 技术要求非常高的工作，一般很少自行制备。
最常用的检测器。
2020/3/26
光电二极管阵列检测器
光电二极管阵列检测器：1024个二极管阵列，各检测特 定波长，计算机快速处理，三维立体谱图，如图所示。
2020/3/26
（6） 数据处理系统
色谱工作站的功能：
• 色谱参数的选择和设定； • 自动化操作仪器； • 色谱数据的采集和存储，并作“实时”处理； • 对采集和存储的数据进行后处理； • 自动打印，给出一套完整的色谱分析数据和图谱。 • 同时也可把一些常用色谱参数、操作程序，及各种
应具有压力平稳、脉冲小、流量稳 定可调、耐腐蚀等特性
又如用25cm×0.46cm的Lichrosorb－ODS(5μ) 的柱，采用梯度洗脱，可在不到0.5h内分离出尿中 104个组分.
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小结
综上所述，高效液相色谱法是吸取了气 相色谱与经典液相色谱的优点，具有高柱 效、高选择性、分析速度快、灵敏度高、 重复性好、应用范围广等优点。
目前高效液相色谱法已被广泛应用于分 析对生物学和医药上有重大意义的大分子 物质，例如蛋白质、核酸、氨基酸、多糖 类、植物色素、高聚物、染料及药物等物 质的分离和分析。
定量计算方法存入存储器中，需用时调出直接使用。
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三、影响分离的因素 1. 固定相及分离柱
气相色谱中的固定液原则上都可以用于液相色 谱，其选用原则与气相色谱一样。
，分离柱的制备是一项 技术要求非常高的工作，一般很少自行制备。
最常用的检测器。
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光电二极管阵列检测器
光电二极管阵列检测器：1024个二极管阵列，各检测特 定波长，计算机快速处理，三维立体谱图，如图所示。
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（6） 数据处理系统
色谱工作站的功能：
• 色谱参数的选择和设定； • 自动化操作仪器； • 色谱数据的采集和存储，并作“实时”处理； • 对采集和存储的数据进行后处理； • 自动打印，给出一套完整的色谱分析数据和图谱。 • 同时也可把一些常用色谱参数、操作程序，及各种
仪器分析课件第十八章色谱法导论
色谱分离过程的两大特点： 第一、不同组分在通过色谱柱时移动的速度不等（差速迁 移），它提供了实现分离的可能性。 第二、各组分分子沿柱子进行扩散分布，即分子分布离散。 色谱基本理论是从微观分子运动和宏观分布平衡探讨提高分 离迁移和降低离散迁移。 色谱基本理论是从热力学和动力学两方面讨论色谱分离问题。
9
伸舌峰： 当As小于1时，色谱峰是前半部分信号增加慢，
后半部分信号减小快。因为伸舌峰主要是固定相不能给 溶质提供足够数量合适的作用位置，使一部分溶质超过 了峰的中心，即产生了超载，所以也称超载峰。
17
色谱流出曲线的意义
色谱峰数=样品中单组份的最少个数； 色谱保留值——定性依据； 色谱峰高或面积——定量依据； 色谱保留值或区域宽度——色谱柱分离效能评价指标； 色谱峰间距——固定相或流动相选择是否合适的依据。
★应用范围广
(1)色谱分析广泛应用于极为复杂的混合物成分分析； (2)液相色谱法，在糖类、氨基酸、农药、染料、贵金属、有机金属化合物 等方面得到了广泛的应用。 (3)色谱分离是一种有效的提纯物质技术，用于制备分离，得到高纯样品。 (4)色谱—质谱联用仪已成为研究分子结构的重要手段。
8
色谱分离原理
色谱分离是基于样品中各组分在两相间平衡分配的差异。
（一）保留值的定义
1、保留时间 t R（retention time）
2、死时间 tM（dead time）
3、调整保留时间 t R（adjusted retention time）
4、保留体积 VR
5、死体积 VM
6、调整保留体积 VR
19
1、保留时间 t R 2、死时间 t M
从进样开始到色谱峰最大值出现时所需要的时间，称为保留时间。
9
伸舌峰： 当As小于1时，色谱峰是前半部分信号增加慢，
后半部分信号减小快。因为伸舌峰主要是固定相不能给 溶质提供足够数量合适的作用位置，使一部分溶质超过 了峰的中心，即产生了超载，所以也称超载峰。
17
色谱流出曲线的意义
色谱峰数=样品中单组份的最少个数； 色谱保留值——定性依据； 色谱峰高或面积——定量依据； 色谱保留值或区域宽度——色谱柱分离效能评价指标； 色谱峰间距——固定相或流动相选择是否合适的依据。
★应用范围广
(1)色谱分析广泛应用于极为复杂的混合物成分分析； (2)液相色谱法，在糖类、氨基酸、农药、染料、贵金属、有机金属化合物 等方面得到了广泛的应用。 (3)色谱分离是一种有效的提纯物质技术，用于制备分离，得到高纯样品。 (4)色谱—质谱联用仪已成为研究分子结构的重要手段。
8
色谱分离原理
色谱分离是基于样品中各组分在两相间平衡分配的差异。
（一）保留值的定义
1、保留时间 t R（retention time）
2、死时间 tM（dead time）
3、调整保留时间 t R（adjusted retention time）
4、保留体积 VR
5、死体积 VM
6、调整保留体积 VR
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1、保留时间 t R 2、死时间 t M
从进样开始到色谱峰最大值出现时所需要的时间，称为保留时间。
仪器分析― 高效液相色谱法PPT课件
填充的固定相颗粒直径多在150~200m范围内。即使这样，
流速仍然很低(<1mL/min)，分析时间仍然很长！ 当加压增加流速(真空或空气泵)时，尽管分析时间减少，
但柱塔板高度Hmin也相应增加了！或者说柱效下降了。
4
• 为了解决分析时间及柱效问题，人们认识 到：最为有效地增加柱效的唯一方法是减 小填充物的粒径（3~10 m ）！
HPLC仪器包括： 1. 高压输液装置; 2. 进样系统; 3. 分离系统; 4. 检测系统; 5. 此 外 还 配 有 梯 度淋洗、自动进样 和数据处理装置。
其工作过程如图 8-2所示。
图8-2 HPLC仪器工作过程示意图
9
高效液相色谱法 HPLC High Performance Liquid Chromatography
选择原则。
3
8.1 概 述
高效液相色谱(HPLC)是以溶剂液体为流动相的色谱方法。 按照固定相不同可分为：液液分配色谱；吸附色谱(液固色 谱)；离子交换色谱；尺寸排阻色谱(凝胶渗透色谱)。此外， 还有亲和色谱、平板色谱(薄层色谱)等。
早期液相色谱，包括Tswett的工作，都是在直径1~5cm, 长50~500cm的玻璃柱中进行的。为保证有一定的柱流速，
• 操作温度：GC需高温；HPLC通常在室温下进行。
• 结论：从色谱分析的发展来看，HPLC比GC更为有
用、更具发展前途！
7
3. 应用 由于HPLC分离分析的高
灵敏度、定量的准确性、适 于非挥发性和热不稳定组分 的分析，因此，在工业、科 学研究，尤其是在生物学和
不溶于水 非极性
极性增加 非离子极性
16
高效液相色谱法 HPLC High Performance Liquid Chromatography
流速仍然很低(<1mL/min)，分析时间仍然很长！ 当加压增加流速(真空或空气泵)时，尽管分析时间减少，
但柱塔板高度Hmin也相应增加了！或者说柱效下降了。
4
• 为了解决分析时间及柱效问题，人们认识 到：最为有效地增加柱效的唯一方法是减 小填充物的粒径（3~10 m ）！
HPLC仪器包括： 1. 高压输液装置; 2. 进样系统; 3. 分离系统; 4. 检测系统; 5. 此 外 还 配 有 梯 度淋洗、自动进样 和数据处理装置。
其工作过程如图 8-2所示。
图8-2 HPLC仪器工作过程示意图
9
高效液相色谱法 HPLC High Performance Liquid Chromatography
选择原则。
3
8.1 概 述
高效液相色谱(HPLC)是以溶剂液体为流动相的色谱方法。 按照固定相不同可分为：液液分配色谱；吸附色谱(液固色 谱)；离子交换色谱；尺寸排阻色谱(凝胶渗透色谱)。此外， 还有亲和色谱、平板色谱(薄层色谱)等。
早期液相色谱，包括Tswett的工作，都是在直径1~5cm, 长50~500cm的玻璃柱中进行的。为保证有一定的柱流速，
• 操作温度：GC需高温；HPLC通常在室温下进行。
• 结论：从色谱分析的发展来看，HPLC比GC更为有
用、更具发展前途！
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3. 应用 由于HPLC分离分析的高
灵敏度、定量的准确性、适 于非挥发性和热不稳定组分 的分析，因此，在工业、科 学研究，尤其是在生物学和
不溶于水 非极性
极性增加 非离子极性
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高效液相色谱法 HPLC High Performance Liquid Chromatography
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①非极性键合相：主要用于反相色谱
在硅胶的表面键合上非极性的烃基，如碳十八 （ （CC118）,O、D苯S,基最等常制用得）。、辛烷基（C8）、甲基 烷基的链长度对溶质的保留、选择性和载样量 有很大的影响，链长度增加，稳定性好， k 增 大，载样量增大，分离选择性提高。
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胶束色谱法－MC micellarchromatography
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101-5
二、化学键合相色谱法
（一）化学键合相（bonded phase , BP）
1. 定义：经化学反应将官能团键合在载体表面得到 的固定相。
2. 种类：非极性、弱极性、极性
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101-7
硅胶键合相种类示意图
其他
手性层
C H2
H2 C
C H2
H2 C
Si O
Si
H2 C
C
H2 C
C
O Si
H2N
H2 H2 O
Si
H2C
H2C O
H2C
CH2
H2C CH OH
OH
HO O Si O
Si
O Si O CH2
H2C CH2
通过键合反应制备：主要为硅氧烷型键合相，是 通过硅胶和氯硅烷进行烷基化反应制得，如ODS 的键合反应如下：
R为氯时，可进一步通过硅氧烷键键合烷基
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101-9
4. 性质和特点 （1）化学键合相的性质
含碳量：代表键合量，以含碳百分数表示。
表面覆盖度：已反应的硅醇基数目占硅胶表面 硅醇基总数的比例。
流动相为气体，无毒，易处理 流动相有毒，费用较高
运行和操作容易
运行和操作比GC难一些
仪器制造难度较小
仪器制造难度大
①蒸发激光光散射检测器ELSD是灵敏度较高的通用检测器
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101-3
18.1 HPLC主要类型和原理
一、HPLC的主要类型
按固定相分子聚集状态分：LLC和LSC 四种基本类型色谱法
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101-12
2、正相键合相色谱法NP-BPC
固定相：极性键合相，如氰基柱、氨基柱。 流动相：非极性或弱极性溶剂（烷烃+极性调节剂） 应用于：极性至中等极性化合物的分离； 分离机制：分配、吸附或兼而有之。 保留与分离的规律：
第18章 高效液相色谱法
High performance liquid chromatography HLC格物致知，厚德载物
概述
HPLC和经典液相色谱无本质区别
经典液相色谱
高效液相色谱
常压或减压 填料颗粒大 柱效低 分析速度慢 色谱柱只用一次 不能在线检测
高压，40～50MPa 填料颗粒小，2～50μm 柱效高,40000～60000块/m 分析速度快 色谱柱可重复多次使用 能在线检测
C N
CH3
（C8）
CH3 Si
H2
H2 C
CH3
O Si
H2 C CC
C
H2
C H2
C H2
O H2
Si
O Si
C CH2
H2 H2C CH2 H2C CH2 H2C CH2 H2C CH2 H2C CH3
H3C（C18）
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101-8
3. 制备
101-6
②弱极性键合相
一般有醚基和二羟基键合相，应用很少。
③极性键合相：一般用于正相色谱的固定相
氰基键合相：键合氰乙硅烷基{ ≡Si(CH2)2 CN}质 子接受体，分离选择性与硅胶相似，与双键化合 物可发生选择性作用。对双键异构体及含双键数 不同的环状化合物具有较好分离能力。
氨基键合相：键合氨丙硅烷基{≡Si(CH2)3 NH2}兼 有氢键接受和给予两种功能，对多官能团化合物 具有很好的分离选择性。因此，可用于分离糖类 化合物。但不适合于分离带羰基的物质。
封尾（end-capping）：在键合反应后，用三甲 基氯硅烷等进行钝化处理，减少残余硅醇基。 目的是：增加稳定性，减弱吸附性
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101-10
（2）化学键合相的特点： ① 使用过程中不流失 ② 化学稳定性好 ③ 适于梯度洗脱 ④ 载样量大
分配色谱法－partition chromatography 吸附色谱法－adsorption chromatography 离子交换色谱法－ IEC 空间排阻色谱法－SEC
除此以外，还有如下类型的现代色谱分析法
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101-4
化学键合相色谱法－ BPC（最常见类型）
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101-2
概述
气相色谱
高效液相色谱
只能分析挥发性物质（20%） 几乎可以分析各种物质
不能用于热不稳定物质的分析 可用于热不稳定物的分析
用毛细管色谱可得很高的柱效 色谱柱不能很长，柱效不
有很灵敏的检测器如ECD和较 是很高
灵敏的通用检测器FID和TCD 高灵敏的通用检测器少①
banded phase chromatography 正相BPC：
反相BPC：
离子抑制色谱法－ISC
ion supression chromatography
离子对色谱法－PIC
paired ion chromatography
亲和色谱法－AC affinity chromatography
手性色谱法－CC chiral chromatography
（3）键合相使用注意事项： ① 在规定的酸碱范围内使用：一般pH2～8，扩 展柱可达pH 2～11。否则引起硅胶溶解。 ② 不同厂家、批号的同类型色谱柱表现不尽相同。
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（二）化学键合相色谱法（BPC）
1、概述： 定义：以化学键合相为固定相的色谱法。 地位：在HPLC中占重要地位， 应用：几乎适于所有类型化合物，应用最广泛。 特点：①均一稳定； ②不易流失，使用周期长； ③柱效高； ④重现性好； ⑤键合相种类多，分离选择性高 机制：尚不明确统一 分类：正相键合相色谱，NP-BPC 反相键合相色谱，RP-BPC
在硅胶的表面键合上非极性的烃基，如碳十八 （ （CC118）,O、D苯S,基最等常制用得）。、辛烷基（C8）、甲基 烷基的链长度对溶质的保留、选择性和载样量 有很大的影响，链长度增加，稳定性好， k 增 大，载样量增大，分离选择性提高。
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胶束色谱法－MC micellarchromatography
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二、化学键合相色谱法
（一）化学键合相（bonded phase , BP）
1. 定义：经化学反应将官能团键合在载体表面得到 的固定相。
2. 种类：非极性、弱极性、极性
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硅胶键合相种类示意图
其他
手性层
C H2
H2 C
C H2
H2 C
Si O
Si
H2 C
C
H2 C
C
O Si
H2N
H2 H2 O
Si
H2C
H2C O
H2C
CH2
H2C CH OH
OH
HO O Si O
Si
O Si O CH2
H2C CH2
通过键合反应制备：主要为硅氧烷型键合相，是 通过硅胶和氯硅烷进行烷基化反应制得，如ODS 的键合反应如下：
R为氯时，可进一步通过硅氧烷键键合烷基
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4. 性质和特点 （1）化学键合相的性质
含碳量：代表键合量，以含碳百分数表示。
表面覆盖度：已反应的硅醇基数目占硅胶表面 硅醇基总数的比例。
流动相为气体，无毒，易处理 流动相有毒，费用较高
运行和操作容易
运行和操作比GC难一些
仪器制造难度较小
仪器制造难度大
①蒸发激光光散射检测器ELSD是灵敏度较高的通用检测器
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18.1 HPLC主要类型和原理
一、HPLC的主要类型
按固定相分子聚集状态分：LLC和LSC 四种基本类型色谱法
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2、正相键合相色谱法NP-BPC
固定相：极性键合相，如氰基柱、氨基柱。 流动相：非极性或弱极性溶剂（烷烃+极性调节剂） 应用于：极性至中等极性化合物的分离； 分离机制：分配、吸附或兼而有之。 保留与分离的规律：
第18章 高效液相色谱法
High performance liquid chromatography HLC格物致知，厚德载物
概述
HPLC和经典液相色谱无本质区别
经典液相色谱
高效液相色谱
常压或减压 填料颗粒大 柱效低 分析速度慢 色谱柱只用一次 不能在线检测
高压，40～50MPa 填料颗粒小，2～50μm 柱效高,40000～60000块/m 分析速度快 色谱柱可重复多次使用 能在线检测
C N
CH3
（C8）
CH3 Si
H2
H2 C
CH3
O Si
H2 C CC
C
H2
C H2
C H2
O H2
Si
O Si
C CH2
H2 H2C CH2 H2C CH2 H2C CH2 H2C CH2 H2C CH3
H3C（C18）
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3. 制备
101-6
②弱极性键合相
一般有醚基和二羟基键合相，应用很少。
③极性键合相：一般用于正相色谱的固定相
氰基键合相：键合氰乙硅烷基{ ≡Si(CH2)2 CN}质 子接受体，分离选择性与硅胶相似，与双键化合 物可发生选择性作用。对双键异构体及含双键数 不同的环状化合物具有较好分离能力。
氨基键合相：键合氨丙硅烷基{≡Si(CH2)3 NH2}兼 有氢键接受和给予两种功能，对多官能团化合物 具有很好的分离选择性。因此，可用于分离糖类 化合物。但不适合于分离带羰基的物质。
封尾（end-capping）：在键合反应后，用三甲 基氯硅烷等进行钝化处理，减少残余硅醇基。 目的是：增加稳定性，减弱吸附性
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（2）化学键合相的特点： ① 使用过程中不流失 ② 化学稳定性好 ③ 适于梯度洗脱 ④ 载样量大
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除此以外，还有如下类型的现代色谱分析法
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化学键合相色谱法－ BPC（最常见类型）
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概述
气相色谱
高效液相色谱
只能分析挥发性物质（20%） 几乎可以分析各种物质
不能用于热不稳定物质的分析 可用于热不稳定物的分析
用毛细管色谱可得很高的柱效 色谱柱不能很长，柱效不
有很灵敏的检测器如ECD和较 是很高
灵敏的通用检测器FID和TCD 高灵敏的通用检测器少①
banded phase chromatography 正相BPC：
反相BPC：
离子抑制色谱法－ISC
ion supression chromatography
离子对色谱法－PIC
paired ion chromatography
亲和色谱法－AC affinity chromatography
手性色谱法－CC chiral chromatography
（3）键合相使用注意事项： ① 在规定的酸碱范围内使用：一般pH2～8，扩 展柱可达pH 2～11。否则引起硅胶溶解。 ② 不同厂家、批号的同类型色谱柱表现不尽相同。
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（二）化学键合相色谱法（BPC）
1、概述： 定义：以化学键合相为固定相的色谱法。 地位：在HPLC中占重要地位， 应用：几乎适于所有类型化合物，应用最广泛。 特点：①均一稳定； ②不易流失，使用周期长； ③柱效高； ④重现性好； ⑤键合相种类多，分离选择性高 机制：尚不明确统一 分类：正相键合相色谱，NP-BPC 反相键合相色谱，RP-BPC