原代细胞生长情况及形态特征观察.
小鼠脾脏细胞原代培养及观察计数实验报告-山东大学
⼩⿏脾脏细胞原代培养及观察计数实验报告-⼭东⼤学⼩⿏脾脏细胞原代培养及观察计数【实验⽬的】1.学习掌握细胞培养的基本原理以及具体⽅法，并对⼩⿏脾细胞进⾏原代培养；2.掌握⽆菌操作的具体过程及⽆菌操作台的使⽤；3.学习掌握染⾊法鉴别细胞的⽣死状态的原理及⽅法；4.学习使⽤⾎球计数板对细胞总数及活细胞数进⾏计数；【实验原理】1.细胞培养细胞培养指的是在⽆菌条件下，把动、植物细胞从组织中取出，在体外模拟体的⽣理环境，使离体的细胞在体外⽣长和繁殖，并且维持其结构和功能的⼀种培养技术。
动物细胞培养可分为原代培养和传代培养。
从供体获得组织细胞，在⽆菌条件下，⽤胰蛋⽩酶消化或机械分散等⽅法，将动物组织分散成单个细胞开始⾸次培养长出单层细胞的⽅法称为细胞的原代培养。
当培养的动物细胞⽣长增殖达到⼀定密度，形成致密的单层细胞时，⽤胰蛋⽩酶将细胞消化分散成单细胞，从⼀个容器中以1：2或其他⽐例转移到另⼀个容器中扩⼤培养的⽅法，称为细胞的传代培养。
传代培养的累计次数就是细胞的培养代数。
⾼等⽣物是由多细胞构成的整体，在整体条件下要研究单个细胞或某⼀群细胞在体的功能活动是⼗分困难的。
但如果把活细胞拿到体外培养、增殖并进⾏观察和研究，则要⽅便和简单得多。
被培养的动物细胞是⾮常好的实验对象和实验研究材料，对体外培养的活细胞进⾏研究可以帮助⼈类揭开⽣、⽼、病、死的规律，探索优⽣、抗衰⽼和防治各种疾病的途径和机制，也可以⼈为地诱导和改变细胞的遗传性状和特性，使其向有利于⼈类健康长寿的⽅向发展。
因此动物细胞体外培养技术是研究细胞分⼦机制⾮常重要的实验⼿段，被⼴泛应⽤于医学、⽣物技术、基因⼯程等研究领域。
细胞培养的意义:具有其他⽣物技术⽆可⽐拟的优点；培养条件易改变和控制，便于单因⼦分析；便于⼈们直接对细胞结构、细胞⽣长及发育等过程的观察；在⽣物学的各个领域（如分⼦⽣物学、细胞⽣物学、遗传学、免疫学、肿瘤学及病毒学等）已被⼴泛应⽤。
细胞培养的局限性：在脱离机体复杂环境下，细胞培养条件与躯体环境有⼀定距离；观察到的结果有时难以正确反映机体的状况；细胞培养得到的产物少。
大鼠睾丸间质祖细胞的原代培养及生长状况观察
Ｈｅｅ Ｍ ｄｃｌ ｏｒａ，０ ０ Ｖ ｌ ２ＪｎＮ ． ｂ ｉ ｅｉａ Ｊｕｎｌ２ １ ， ｏ ３ ａ ｏ ２
１５ ８
・
论 著 ・
Байду номын сангаас
大 鼠睾 丸 间质 祖 细胞 的原 代 培养 及 生 长 状 况 观 察
张红娟 邵 莉进 陈新磊 米梅艳
心机 ， 瑞士 Ｓ ｒｚｍ 型 内分 泌定 量测 定仪。 ｅ ｙ ｅＩ ｏ １３ 睾丸间质祖细胞 的培养 ． 取生后 ｌ ７～１ Ｓ ８ｄ的 Ｄ乳 大 鼠，
质 网及脂滴 。培养 ６ｄ 后细 胞汇合 ，ＢＨ Ｄ染色 ， ３．Ｓ 睾丸 间质祖
细胞纯 度达 ９ ％以上。 ０
２２ 培养 睾丸间质祖细胞最佳移植 时间的确定 ．
化情况。结果 体外分 离培 养 Ｐ Ｃ， ｄ内生长状态 良好 ， ４～６天时细胞增 殖最快 ， ６天后 ， Ｌ ７ 第 第 细胞 纯度 达 ９ ％ 以上。睾酮分泌量在培 养２ 最 高，６ 后 明显下 降， ５ ０ ４ ｈ ９ ｈ 第 天后趋 于平稳 。结论 经分 离培养可获
得纯度高 、 增值 活性 强的 Ｐ ｃ Ｌ 。培养 ４～ ６ｄ的细胞适 于移植 。
根据不 同培
养 时间 ３ ． Ｓ Ｂ Ｈ Ｄ酶组织化学染色 阳性细 胞统计 结果 ， 可知睾 丸 间质祖 细胞 在接 种 ２ ４ ｈ后 ， 度 保持 在 ６ ． ％ 以上 ， ４ ｄ 纯 ８２ ３— 后， 增值迅速 ， 分裂相多见 ， 核 ５～７ｄ后细胞 汇合 ， 呈现 “ 网” 拉
【 要】 目的 建 立一种 睾丸间质祖细胞 的纯化培 养方法 ， 摘 为细胞 移植 治疗 男性腺 功 能低 下提 供 实 验参考。方法 分 离、 培养 ｓ Ｄ大鼠睾丸 间质祖 细胞（ ｒ ｅｉｒ ｅｄ ｅ ，Ｌ ） 采 用酶 组 织化 学染 色鉴 ｐｏ ｎ ｏ Ｌｙｉ ｃｌ Ｐ Ｃ ， ｇ ｔ ｇ ｌ 定， ＨＥ染 色及 电镜技 术观察形 态， ｒ 磁分 离均相酶联免疫 （ 酶免） 酮定量 测定法观察 其体 外生长分 ＭＴ 、 磁 睾
细胞原代培养细胞生物学实验报告
细胞生物学实验报告细胞原代培养姓名：学号：班级：专业：同组成员：一、实验原理细胞培养是生物学和医学研究中最常用的手段之一，可分为原代培养和传代培养两种。
原代培养是直接从生物体获取组织或器官的一部分进行培养。
由于培养的细胞刚刚从活体组织分离出来，故更接近于生物体内的生活状态。
这一方法可为研究生物体细胞的生长、代谢、繁殖提供有力的手段。
同时也为以后传代培养创造条件。
原代培养的方法：1、组织块法在平皿中用弯头剪把组织尽量剪碎，每个组织块小于1mm3大小。
用Hanks 液洗涤2—3次，自然沉淀。
用吸管吸去上清液。
将组织块贴于培养瓶进行培养。
2、酶消化法将1mm3大小的组织块放入1个三角瓶内加入10—30ml的%的胰蛋白酶。
370C磁棒搅拌消化20－30分钟。
然后终止消化。
用几层无菌纱布过滤。
取过滤液，离心800rpm 5—10分钟收集细胞。
弃上清，加入带有双抗的培养基，放入培养瓶培养。
取材注意事项：取材要注意新鲜和保鲜。
取材应严格无菌。
取材和原代细胞制作时，要用锋利的器械，如手术刀或剃须刀片切碎组织，尽可能减少对细胞的机械损伤。
要仔细去除所取材料上的血液（血块）、脂肪、坏死组织及结缔组织，切碎组织时应避免组织干燥，可在含少量培养液的器皿中进行。
取材应注意组织类型、分化程度、年龄等，一般来讲，胚胎组织较成熟个体组织容易培养，分化低的较分化高的组织容易生长，肿瘤组织较正常组织容易培养。
二、实验目的1、理解细胞原代培养原理2、熟悉细胞原代培养方法与过程3、了解细胞原代培养的应用4、独立进行细胞原代培养操作三、实验材料手术小直剪刀、眼科直镊子、眼科弯镊子、玻璃平皿、培养瓶、试管、移液管、巴斯德吸管、废液缸、75%酒精棉球、酒精灯。
动物：9-12日龄的鸡胚蛋四、实验步骤1、购买9-12日龄鸡胚蛋。
放入孵化箱中孵养待用。
2、取鸡胚蛋一枚放入超净工作台中，用酒精棉球擦拭鸡蛋壳后，气室处擦拭两遍，用镊子小心去除气室部分的蛋壳。
神经元原代培养实验报告
一、实验背景神经元是神经系统中最基本的结构和功能单位，研究神经元生物学特性对于理解神经系统疾病和开发新的治疗方法具有重要意义。
神经元原代培养是研究神经元生物学特性的重要方法之一，它能够模拟体内神经元的生长和发育过程，为神经元生物学研究提供了一种有效的手段。
二、实验目的1. 掌握神经元原代培养的方法和步骤。
2. 观察神经元原代培养过程中的形态学变化。
3. 分析神经元原代培养过程中细胞生长、增殖和分化情况。
三、实验材料1. 实验动物：E17-18d孕大鼠或E14-16d孕小鼠。
2. 试剂：含10%胎牛血清的DMEM培养基、神经元维持培养基(NeurobasalB27谷氨酰胺）、胰蛋白酶、抗神经丝抗体、荧光染料等。
3. 仪器：细胞培养箱、倒置显微镜、离心机、移液器等。
四、实验方法1. 取E17-18d孕大鼠或E14-16d孕小鼠大脑皮质，用胰蛋白酶消化，制成细胞悬液。
2. 将细胞悬液接种于培养皿中，置于37℃、5%CO2的培养箱中培养。
3. 每天观察细胞生长情况，记录细胞形态学变化。
4. 培养第3天，进行细胞计数，观察细胞生长速率。
5. 培养第5天，进行免疫荧光染色，观察神经元纯度。
6. 培养第10天，进行神经元分化实验，观察神经元功能。
五、实验结果1. 细胞形态学观察：神经元原代培养过程中，细胞从圆形逐渐转变为梭形，并逐渐出现突起，形态逐渐成熟。
2. 细胞生长速率：培养第3天，细胞生长速率为（2-4）×10^4个/皿；培养第5天，细胞生长速率为（4-8）×10^4个/皿。
3. 神经元纯度：免疫荧光染色结果显示，神经元纯度达到90%以上。
4. 神经元分化实验：神经元分化实验结果显示，神经元在培养过程中逐渐分化为不同类型的神经元，如运动神经元、感觉神经元等。
六、实验讨论1. 神经元原代培养过程中，细胞形态学变化与体内神经元生长和发育过程相似，为研究神经元生物学特性提供了有力手段。
2. 细胞生长速率受多种因素影响，如培养基、温度、CO2浓度等。
细胞系实验报告
实验名称：细胞系建立与鉴定实验时间：2023年X月X日实验地点：实验室一、实验目的1. 掌握细胞系的建立方法。
2. 了解细胞系的鉴定方法。
3. 观察细胞系在不同培养条件下的生长情况。
二、实验原理细胞系是指经过体外培养后，能够在一定条件下无限增殖的细胞群体。
细胞系的建立通常从原代细胞开始，通过多次传代培养，使其在体外条件下保持稳定生长。
细胞系的鉴定主要包括细胞形态、染色体数目、细胞周期、细胞表面标志物等方面。
三、实验材料1. 原代细胞：小鼠胚胎成纤维细胞。
2. 细胞培养液：DMEM培养基、胎牛血清、青霉素、链霉素。
3. 试剂：胰蛋白酶、DNA染色剂、细胞周期检测试剂、细胞表面标志物抗体。
4. 仪器：细胞培养箱、显微镜、离心机、移液器、酶标仪等。
四、实验方法1. 原代细胞培养（1）取小鼠胚胎组织，剪成1mm³大小的组织块，用胰蛋白酶消化，制成细胞悬液。
（2）将细胞悬液接种于培养皿中，放入细胞培养箱中培养。
（3）每日观察细胞生长情况，待细胞融合至80%时，用胰蛋白酶消化传代。
2. 细胞系建立（1）将原代细胞传代培养，观察细胞生长情况。
（2）当细胞生长稳定后，收集细胞，进行细胞系鉴定。
3. 细胞系鉴定（1）细胞形态观察：在显微镜下观察细胞形态，记录细胞大小、形状、密度等特征。
（2）染色体数目检测：将细胞进行DNA染色，制作染色体涂片，观察染色体数目。
（3）细胞周期检测：将细胞进行细胞周期检测试剂染色，观察细胞周期分布。
（4）细胞表面标志物检测：将细胞进行细胞表面标志物抗体染色，观察细胞表面标志物表达情况。
五、实验结果1. 细胞形态：细胞呈长梭形，细胞核较大，细胞密度较高。
2. 染色体数目：细胞染色体数目为2n=40。
3. 细胞周期：细胞周期分布为G1期、S期、G2期、M期，比例约为1:1:1:1。
4. 细胞表面标志物：细胞表面表达CD29、CD44等标志物。
六、实验讨论1. 细胞系建立过程中，应注意无菌操作，避免污染。
原代细胞培养实验报告单
一、实验目的1. 熟悉并掌握哺乳动物细胞原代培养的基本操作流程。
2. 学习细胞消化、细胞计数、营养液的配制及酸碱度的调节。
3. 了解无菌操作的重要性，学会分辨死活细胞，掌握细胞计数。
二、实验原理细胞培养是生物学和医学研究的重要手段之一，可分为原代培养和传代培养。
原代培养是指从生物体中取出某种组织或细胞，在人工培养条件下使其生存、生长、繁殖或传代的过程。
细胞培养技术的最大优点是使我们得以直接观察活细胞，并在有控制的环境条件下进行实验，避免了体内实验时的许多复杂因素。
细胞培养可分为原代培养和传代（继代）培养。
直接从体内获取的组织细胞进行首次培养为原代培养；当原代培养的细胞增殖达到一定密度后，则需要做再培养，即将培养的细胞分散后，从一个容器以1：2或其他比率转移到另一个或几个容器中扩大培养，为传代培养，传代培养的累积次数就是细胞的代数。
细胞培养是一种程序复杂、要求条件多而严格的实验性工作。
所有离体细胞的生长都受温度、渗透压、pH值、无机盐等因素的影响。
三、实验材料与试剂1. 实验材料：新生乳鼠肺组织2. 器材：眼科剪、眼科镊、泡器械（直径15cm）、培养皿、动物解剖用的泡沫支架、青霉素瓶、吸管、培养瓶、离心管、废液瓶、倒置显微镜、二氧化碳培养箱、电磁搅拌器3. 试剂：Hank’s液、RPMI-1640液、血清细胞培养液、安尔碘、酒精四、实验步骤1. 取新生乳鼠肺组织，用无菌手术刀将组织切成小块。
2. 将组织块放入装有Hank’s液的培养皿中，用眼科剪和眼科镊轻轻剪碎组织。
3. 将剪碎的组织块移入离心管中，加入适量胰蛋白酶，在37℃水浴中消化10分钟。
4. 将消化后的细胞悬液移入离心管中，1000 rpm离心5分钟，弃上清。
5. 用RPMI-1640液重悬细胞，调整细胞浓度至1×10^6细胞/mL。
6. 将细胞悬液接种于培养皿中，放入二氧化碳培养箱中培养。
7. 每2-3天更换一次培养液，观察细胞生长情况。
《原代细胞培养实验》课件
案例二：胰岛细胞的原代培养
要点一
总结词
要点二
详细描述
胰岛细胞是胰腺内分泌部分的主要组成部分，其原代培养 需要模拟体内环境，以保持细胞的正常生理功能。
胰岛细胞的原代培养需要使用特殊的基质和生长因子，以 促进细胞的生长和分化。同时，需要控制培养液中的葡萄 糖、胰岛素等物质的浓度，以模拟体内环境。在培养过程 中，还需要注意防止细胞凋亡和自噬等问题。
细胞生长状态
通过观察细胞形态，评估 细胞的生长状态，如贴壁 、增殖、融合等情况。
细胞排列
观察细胞在培养容器中的 排列情况，判断细胞的生 长密度和分布情况。
细胞生长曲线的绘制
01
细胞计数
在原代细胞培养的不同时间点进 行细胞计数，记录细胞的增殖情 况。
02
绘制生长曲线
03
生长曲线的分析
将不同时间点的细胞计数数据绘 制成生长曲线，分析细胞的生长 速率和生长周期。
选择适合细胞类型的基础培养 液，如MEM、DMEM等。
添加物
根据细胞类型和生长需求，添 加适量的生长因子、血清、抗
生素等。
pH值
维持适宜的pH值范围，通常 为7.2-7.4。
渗透压
保持适宜的渗透压，以避免细 胞因渗透压过高或过低而受损
。
细胞的传代与冻存
传代时机
在细胞生长达到适宜密度时进 行传代，避免细胞过度生长或
原代细胞培养的应用
原代细胞培养在药物筛选、肿瘤研究、组织工程、再生医学等领域具有广泛的应 用价值。
通过原代细胞培养可以研究细胞的生理功能、药物作用机制和毒理反应，同时也 可以用于制备组织工程材料和进行基因治疗等研究。
02
原代细胞培养实验步骤
细胞生物学实验细胞原代培养
• 2、离散细胞培养：有单细胞贴壁或分裂成片
培养观察一般项目
正在培养中的细胞应每隔一定时间观察一次。 观察的内容包括：
严重者细胞脱壁悬浮。
9．将植块置于12孔培养板的培养孔中央，每孔5块，间隔约2mm，
布局合理，粘膜面向上，轻轻按压每块植块，使其紧贴培养板的
表面；
10．沿培养孔的边缘，缓慢加入约0.5ml的完全MEM培养液，
勿使培养液与植块接触；
11．将培养板置于370 C
、
５％CO2培养箱中预孵育1小时；
12．每孔加完全MEM培养液2ml，轻拿轻放，切勿使植块飘
• 学习观察体外培养细胞的形态及生 长状况。
实验原理
• 模仿体内生长环境，使来自机体 的细胞、组织、器官能够在人工 培养条件下生存、生长、繁殖。
•
培养用主要仪器设备
1、纯水设备：纯水仪 2、干燥消毒设备：电热干燥箱、高压蒸汽消毒锅、
过滤器及0.22 m滤膜； 3、超净工作台 4、培养设备： 普通培养箱、CO2培养箱； 5、贮存设备：冰箱、液氮罐 6、观察设备：倒置显微镜 7、其他设备：天平、离心机、水浴锅等
关闭超净工作台内的紫外光灯,点燃酒精灯 (一切操作均需在酒精灯火焰下进行)
将消毒过的所用物品放入超净工作台中
植块培养法培养鸡心肌细胞步骤
一、配M199完全培养液：
M199基础培养液 90％
小牛血清
10％
青霉素 链霉素
100IU/ml 100g/ml
过滤除菌。
二、获取心脏
① 消毒鸡胚蛋：泡入70％酒精 ② 取出鸡胚，Hank’s液洗涤。 ③ 取出心脏，放入Hank’s液中。
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1
2 结果
2.1 原代细胞生长情况及形态特征观察
刚分离：细胞呈圆形，折光性强。
接种24~36 h后：几乎所有的细胞都沉积于瓶底，显微镜下可见少量红细胞悬浮在培养液中，轻晃培养瓶大部分细胞随培养液晃动，仅少部分细
胞贴壁，呈圆形。
静置培养4 d后：换液后镜下可见稀疏散在分布的贴壁细胞生长，呈大而扁平的梭形，见图1。
静置培养9 d后：贴壁细胞迅速增殖，形态渐渐均一，为长梭形，放射状排列，见较多的分裂相，见图2。
多次换液后：悬浮细胞随换液次数的增多逐渐被除去，约14 d融合达90%以上，细胞呈单一的长梭形，漩涡状排
列。
2.2 传代细胞生长情况及形态特征观察
传代后的细胞约1 h开始贴壁，三四个小时后贴壁基本完成。
贴壁细胞初期伸出伪足呈梭形、三角形或大多角形。
以后细胞形态逐渐趋于一致，以梭形为主，胞体饱满，见图3。
Figure 1 Adhered cells were big, flat and spindle-shaped after 4
days of culture (×200)
图1 培养4 d换液后贴壁细胞呈大而扁的长梭形 (×200）
Figure 2 Cells were uniform, spindle and radial after culture for 9
days（×100）
图2 培养9 d细胞形态均一，长梭形，放射状排列（×100）
Figure 3 Passage cells were spindle and fat-storing （×200）
图3 传代细胞以梭形为主，胞体饱满（×200）
2
传代后三四天生长活跃，增殖迅速，第5天即进入细胞增殖稳定期，约7 d铺满培养瓶底，细胞为单一的梭形，
排列更加有序，见图4。
2.3 骨髓间充质干细胞的鉴定 免疫组织化学染色结果显示，所培养的细胞CD44呈阳性表达，而CD34呈阴性，证
实所培养细胞为骨髓间充质干细胞，见图5。
Figure 4 Passage cells were uniformly spindle-shaped, and
arranged in order after culture for 7 days（×100）
图4 传代细胞培养7 d呈单一的梭形，排列更加有序（×
100）
Figure 5 Passage cells were positive for CD44
(Immunohistochemistry，×400)
图5 传代细胞CD44呈阳性表达（免疫组织化学染色，
×400）