SNP分型技术

发出荧光信号。每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，
实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。
如果探针与目标序列中存在错配碱基，就会影响其释放荧光
的强度，可以通过检测反应液中的荧光强度确定基因型
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TaqMan 技术
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HRM
HRM的主要原理是根据DNA序列的长度、GC含量以及碱基 互补性差异，应用高分辨率熔解曲线对样品进行分析，其 极高的温度均一性和温度分辨率使分辨精度可以达到对单个 碱基差异的区分。
图7 50%-95%AA模板熔解曲线图
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直接测序法
SNP分型的金标准
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其他检测方法
质谱分析 SNaPshot 连接酶检测反应（LDR）
?
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该技术应用的前提是SNP的位点必须含有该限制内切酶的识 别位点，它是SNP筛查中最经典的方法之一。
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PCR- RFLP
• 原理： • 利用限制性内切酶的酶切位点的特异性，用限制
性内切酶作用于同一DNA片断，如果存在SNP位 点，酶切片断的长度和数量则会出现差异，根据 电泳的结果就可以判断是否SNP位点。
非变性 凝胶电泳
构象不同 呈现多态 性
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单链构象多态性(SSCP)分析
1～4、7～9：野生型基因片段；5、6：两例Val384Asp携带者的样本，显示变异 的SSCP带型
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等位基因特异 PCR ( AS-PCR)
原理： 根据 SNP位点设计特异性引物。其中特异链的3′末 端与 SNP位点的碱基互补(或相同) ，另一条普通链 按常规方法进行设计。 因为特异引物在一种基因型中有扩增产物，在另一 种基因型中没有扩增产物，用凝胶电泳就能够很容 易地分辨出扩增产物的有无，从而确定基因型。
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PCR- RFLP
由于碱基的变异可能导致酶切点的消失或新的切点出现，从 而引起不同个体在用同一限制酶切时，DNA片段长度出现差 异，这种因内切酶切点变化所导致的DNA片段长度的差异， 称限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymporphism, RFLP）。
SNP分型技术简 介
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SNP概念
单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP),主要是指 在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。 SNP在人类基因组中广泛存在，平均每500～1000个碱基对中就有 1个，估计其总数可达300万个甚至更多。
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等位基因特异 PCR ( AS-PCR)
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TaqMan 技术
原理：
TaqMan 荧光探针是一种寡核苷酸探针，报告基团在探针的5’
末端，淬灭基团在3’末端。
PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探
针。PCR扩增时，探针酶切降解，报告基团和淬灭基团分离，
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包括单个碱基的转换、 颠换、插入和缺失等 转换：同型碱基之间 A-G 腺嘌呤-鸟嘌呤 T-C 胸腺嘧啶-胞嘧啶 颠换：嘌呤与嘧啶之间 A-T、A-C、C-G、G-T
插入的图片
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人体许多表型差异、对药物或疾病的易感性等等都可能 与SNP有关。
心脏病、癌症、糖尿病、精神病等复杂性疾病是遗传和 环境综合作用的结果。目前，发现这些多基因疾病微效 基因最有力的方法是对病例组和对照组等位基因频率进 行统计学比较，SNP是这种分析很好的一种标记。
这种二级结构依赖于碱基的组成，单个碱基的改变
也会影响其构象，最终会导致在凝胶上迁移速度的
改变。
经PCR扩增的目的片段在单链状态下，因其单个碱
基差异，所形成的空间构象不同，其在非变性聚丙
稀酰胺凝胶中泳动速度不一样，从而显示出带型的
差异，即多态型
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单链构象多态性法 PCR- SSCP
保持在 单链状态
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SNP分型技术
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基于电泳的检测方法
PCR-RFLP PCR-SSCP
AS-PCR
基于荧光定量PCR 的检测方法
TaqMan探针法 HRM
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直接测序法
4Biblioteka Baidu
其他检测方法
质谱分析 SNaPshot
LDR
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The HRM Analysis Workflow
1、核酸提取与均一化 2、PCR设计与优化
（引物、条件） 3、qRT-PCR 4、Sample Melt(结果检
查，HRM数据收集) 5、数据分析
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HRM
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HRM 敏感度
图6 5%-50%AA模板熔解曲线图
PCR扩增 目的片段
限制性内切酶 酶切目的片段
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电泳分离
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rs1800629
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PCR- RFLP分析
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rs1800629 RFLP 结果
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单链构象多态性法 PCR- SSCP
原理：
单链DNA在中性条件下会形成二级结构，不同的二
级结构在电泳中会出现不同的迁移率。