gstpulldown的原理以及具体操作流程
经典：蛋白质相互作用技术研究的几种技术
bait
proteinX
cDNAforX
DNAb in d in g d o m a in transfection tran s fo rm e d
yeast
X
yeast plasmid expression vector
predator
unknow
tis s u e
b a it
predator
X
Y
does X bind with a protein?
to tal m R N A re v e rs etra n s c rip ta s e
cDNA y e a s t p l a s m i d e x p r e s s i o n v e c t o r
transfection
activation domain
三、免疫共沉淀原理
• 免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）是以抗体和抗原 之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经 典方法。是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用 的有效方法。
• 当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多 蛋白质－蛋白质间的相互作用被保留了下来。当用预先固 化在argarose beads上的蛋白质A的抗体免疫沉淀A蛋白， 那么与A蛋白在体内结合的蛋白质B也能一起沉淀下来。 再通过蛋白变性分离，对B蛋白进行检测，进而证明两者 间的相互作用。
二、谷胱苷肽-S-转移酶沉淀试验 (GST-pull down）原理
GST-融合蛋白 + 谷胱甘肽-琼脂糖球珠 X GST
Y 细胞裂解物
4℃下孵育2h tube
X GST Y
GST pull down实验流程
GSTpulldown技术检测HEK293T细胞Daam1的活性_李卫星
在众多涉及信号通路调控机制的研究中，相关信号分子的活化或失活是其信号通路发挥调控作用的关键所在，因此确定信号分子是否活化是该类研究首先要考虑的问题。
本课题组所研究的蓬乱蛋白相关形态形成活化因子-1（Dishevelled-associated activator of morphogenesis-1，Daam1），是形成素（formin ）蛋白家族成员之一，在人体各类组织中广泛表达［1］。
Daam1是Wnt ／PCP 信号通路的关键分子之一，它和下游Rho 蛋白结合并调节其活性，进而参与细胞骨架重排及胚胎发育等众多生理过程［2－4］。
在细胞未受到刺激时，Daam1在胞浆中以“自身抑制”的形式存在，抑制的机制是其氨基端和羧基端的结构域结合，从而使蛋白折叠成环化状态［5］，而当其环化结构被打开时，Daam1便可激活下游信号通路［6］。
由此可见，非环化结构即为Daam1的活性形式［5－7］。
目前，因为尚没有商品化的试剂盒可用于检测活化的Daam1，因此建立GST pulldown 技术检测HEK293T 细胞Daam1的活性李卫星，杜军1，朱一超1*（泰州职业技术学院医学技术学院，江苏泰州225300；1南京医科大学生理学系，江苏南京210029）［摘要］目的：运用GST pulldown 技术建立真核细胞中Daam1活性检测的可靠方法。
方法：构建GST-RhoA 的原核表达载体，并使其在大肠杆菌BL21菌株中大量表达。
用GST pulldown 和Western blot 技术分别检测HEK293T 细胞中活化的Daam1及Daam1蛋白的表达。
结果：在成功构建了GST-RhoA 的原核表达载体，并使其在原核细胞中大量表达融合蛋白GST-RhoA 后，用GST pulldown 和Western blot 技术证实HEK293T 细胞中有活化的Daam1和Daam1总蛋白的表达。
结论：本工作所建立的GST pulldown 技术可以检测HEK293T 细胞中Daam1的活性，从而为进一步深入研究Daam1在真核细胞中的功能提供了技术保障。
(分子生物学本科生课件)GST-pulldown
Incubation, 40C, 2h Centrifugation,40C
Precleared cell lysate + glutathione agarose beads + GST
fusion probe protein
optional
To confirm suspected interactions between the probe protein and a known proteins.
antibodies to the target protein, or: 1) the 35S-labeled in vitro translated protein, or the target protein can be tagged with
protein with a mutated interaction domain, 4) To test for binding between the putative protein and GST.
Method
Preclearing the cell lysate--- Incubation, 40C, 2h Centrifugation,40C
By centrifugation, collect the GST fusion probe protein and any associated molecules;
The complexes are washed and can be eluted from the beads with excess free glutathione or boiled directly in SDS-PAGE buffer;
GST
(glutathione-sepharose beads) 35S-labled cell lysate
GST pulldown手册—翻译
普洛麦格公司GST pull-down 试剂盒手册-步骤部分翻译第一部分：TNT® T7 Quick 转录/翻译反应制备捕获蛋白技术1.V8871共4个试剂中取3个试剂，从-70℃保存环境中拿出解冻，RQ1 DNase第一次使用后可放置在-20℃保存。
→TNT® T7 Quick Master Mix 手温溶解或在冰上溶解，其他样品室温溶解或冰上放置。
2.按下表加样，获得捕获蛋白，30℃孵育60-90min。
Components Reaction Volume（不用35S蛋氨酸）TNT® T7 Quick Master Mix 40ulMethionine，1mM 1ulPlasmid DNA template（s）0.5ug/ml 2ulNuclease-Free Water to 50ul第二部分：GST融合蛋白固定到Magne GST TM颗粒上的相关技术实验组：1ml GST-融合蛋白细菌培养物对照组：1ml GST蛋白细菌培养物→→低表达蛋白需要加大样品量当然，Magne GST TM颗粒本身也可以作为阴性对照。
◆细菌裂解步骤1.从1ml左右菌液中收获细菌→加入Magne GST TM细胞裂解液之前先冻融细菌可增加某些菌种的裂解效果，如BL 21菌种，方法可选用：-20℃冷冻15-20min或干冰冷冻5-10min。
2.室温中，在每个菌液中加入Magne GST TM细胞裂解液200ul，吹打并重悬浮菌液。
3.加入RQ1无RNA酶DNA酶2ul。
（可省略）→该步骤可增加GST-融合蛋白纯度并降低蛋白粘度，若加入5ul可明显降低粘度，但是也可以省略该步骤。
4.25℃放置在平面摇床上，缓慢振荡，孵育20-30min。
◆Magne GST TM颗粒平衡步骤1. 上下颠倒Magne GST TM颗粒使其重悬浮成均匀液体。
2. 取1.5mlEP管，加入已充分重悬浮的Magne GST TM颗粒20ul →在诱捕捕获蛋白时不要让Magne GST TM颗粒放置过久，会因沉淀而降低结合效率。
Pull down与免疫共沉淀实验
重要。
该方法比较简便，避免了使用同位素等危险物质，在蛋白质相互作用研究中有很广泛的应用。
除了GST以外，类似的融合蛋白很多，如与葡萄球菌蛋白A融合的“诱饵”蛋白可以通过固定有IgG的色谱柱进行纯化；与寡聚组氨酸肽段融合的“诱饵”蛋白可以通过结合Ni2+ 的色谱柱进行纯化；与二氢叶酸还原酶融合的“诱饵”蛋白可以通过固定有氨甲蝶呤的色谱柱进行纯化等等。
Pull down实验一般用于体外转录或翻译体系，如酵母双杂交系统中检测蛋白质之间的相互作用。
但并不能真实的反应蛋白质之间的相互作用，因为在体内它们不一定空间上有碰到，所以并不意味着在生理条件下一定结合。
免疫共沉淀技术的基本原理是：在非变性条件下裂解细胞，蛋白质之间的相互作用还可以保持。
在细胞裂解液中加入抗兴趣蛋白的抗体，孵育后再加入与抗体特异结合的结合于Agarose微珠上的金黄色葡萄球菌蛋白A（SPA），若细胞中有与兴趣蛋白结合的目的蛋白，就可以形成这样的一种复合物：目的蛋白-兴趣蛋白-抗兴趣蛋白抗体-SPA/Agarose，因为SPA/Agarose比较大，这样复合物在离心时就被分离出来。
经蛋白上样缓冲液变性煮沸，复合物四组分又被分开。
然后经WB试验，用抗体检测目的蛋白是什么，是否为预测蛋白。
这种方法得到的目的蛋白是在细胞内天然与兴趣蛋白结合的，符合体内实际情况，得到的蛋白可信度高。
免疫共沉淀既可以用于检测已知的两个蛋白质在体内的相互作用，也可以找出未知的蛋白质相互作用，不管是两者的哪个，其原则都是一样的，都需要用特异性的抗体与其中的一种蛋白质结合，之后通过蛋白质A或蛋白质G-琼脂糖微珠将复合物沉淀下来，然后用WB鉴定。
免疫共沉淀中设置正确的对照非常重要，因为该方法可能出现假阳性的概率比较高，设置的对照包括：在对照组中使用对照抗体，以缺失目的蛋白的细胞系作为阴性对照等等。
但这种方法也有两个缺陷：一是两种蛋白质的结合可能不是直接结合，而可能有第三者在中间起桥梁作用；二是必须在实验前预测目的蛋白是什么，以选择最后检测的抗体，所以，若预测不正确，实验就得不到结果，方法本身具有冒险性。
蛋白检测-GST-pulldown
主题：GST-pulldown概述：GST pull-down实验是一个行之有效的验证酵母双杂交系统的体外试验技术，近年来越来越受到广大学者的青睐。
其基本原理是将靶蛋白-GST（Glutathione-S-transferase谷胱苷肽巯基转移酶）融合蛋白亲和固化在谷胱甘肽亲和树脂上,作为与目的蛋白亲和的支撑物，充当一种“诱饵蛋白”，目的蛋白溶液过柱，可从中捕获与之相互作用的“捕获蛋白”(目的蛋白)，洗脱结合物后通过SDS-PAGE电泳分析，从而证实两种蛋白间的相互作用或筛选相应的目的蛋白，“诱饵蛋白”和“捕获蛋白”均可通过细胞裂解物、纯化蛋白、表达系统以及体外转录翻译系统等方法获得。
目的：体外检测蛋白质与蛋白质之间相互作用，用于验证两个已知蛋白的相互作用，或者筛选与已知蛋白相互作用的未知蛋白。
原理：利用重组技术将探针蛋白与GST（Glutathione S transferase）融合，融合蛋白通过GST与固相化在载体上的GTH（Glutathione）亲和结合。
因此，当与融合蛋白有相互作用的蛋白通过层析柱时或与此固相复合物混合时就可被吸附而分离。
步骤：１.Glutathione琼脂糖珠预处理；２.GST融合蛋白挂柱：取适GST-融合蛋白与已经处理过的beads置于管中，4℃，摇床孵育过夜；３.孵育过夜的蛋白质与beads的混合液于4℃，离心,上清收集，观察融合蛋白是否饱和地挂在beads上；４.把转染目的基因的细胞裂解在细胞裂解液里（含蛋白酶抑制剂），最大转速4℃离心，收集上清液；５.将细胞裂解液上清加入beads；６.加上SDS上样缓冲液；７.SDS-PAGE，Western Blot或者质谱仪分析。
流程图：。
GSTPullDown（以Rac1活性检测为例）（原创）
GSTPullDown（以Rac1活性检测为例）（原创）1、⽤GST-PAK-CRIB融合蛋⽩载体转化BL21感受态细菌，37℃培养过夜，12-16h之后出现菌
落；
2、挑取阳性单克隆，接种到含有抗⽣素的LB液体培养基中，在37℃恒温摇床中剧烈振摇⾄菌
液OD600值在0.4-0.6之间时，加⼊IPTG 0.1mmol/L诱导，继续孵育3-4h，离⼼，收集菌体（可
以-70℃保存备⽤）；
3、加⼊2 ml细菌裂解液（含蛋⽩酶抑制剂），重新悬浮菌体，冰上振荡15 min；
4、12000 rpm离⼼10 min，取上清；
5、向上清中加⼊100 µl的含有⾕胱⽢肽的琼脂糖磁珠（⽤之前需⽤washing buffer洗涤3
次），4℃旋转混合⾄少30min，再⽤washing buffer洗3次；
6、从培养的细胞中提取全蛋⽩，取蛋⽩200µg，与上述琼脂糖磁珠混合，⽤washing buffer 补
⾜300 µl，4℃旋转孵育⾄少1 h，⽤于沉淀细胞中的⽬的蛋⽩，（注：此步反应的温度和孵育时
间均需根据不同的的蛋⽩进⾏优化，孵育的最后阶段进⾏略微的涡旋震荡能够去掉⾮特异性结
合的蛋⽩，降低背景）；
7、⼩⼼移去上清，⽤400 µl washing buffer 洗3-5次，第⼀次可室温孵育5 min，并在孵育过程
中偶尔进⾏混匀；
8、向琼脂糖磁珠中加⼊30 µl 2×SDS-PAGE加样缓冲液，沸⽔浴5 min，直接加样进⾏SDS-
PAGE蛋⽩电泳；
9、以下实验操作同westernblotting（见前天实验流程）。
GSTpulldown试验方法
GSTpulldown试验方法12.GST蛋白的表达和纯化12.1 GST蛋白的表达（1) 将表达GST融合蛋白的质粒转入BL21大肠杆菌菌株中。
（2) 挑单克隆于3ml LA(LB+Amp)培养基中，37℃摇菌过夜，获得种子液。
（3) 将种子液稀释于50ml2XYTA(YTG+Amp)培养基中，使起始OD600为0.1。
（4) 28℃,220rpm摇菌培养2小时。
（5) 加入50μl 100mM IPTG,16～27℃摇菌培养1～8小时。
（6) 收菌，将菌液倒入大离心管，2管/50ml菌液，4℃ 5krpmx5min离心，弃上清。
（7) 加入10ml PBS/管，重悬细胞,5krpm离心5min，弃上清。
（8) 加入2ml PBS/管，重悬细胞。
转移至5ml离心管。
（9) 超声破壁破壁前，在细胞悬液中加20μl 10mg/ml PMSF,80μl蛋白酶抑制剂(100x)。
破壁参数：Frequency:100～200w 60s，pause 20s run 40s,5cycles破至菌体由浑浊变为澄清。
加100μl 20% TritonX－100，冰上放置30min。
（10) 将裂解液分入1.5ml离心管中，4℃离心12krpm×10min，取上清。
（11) 吸取少量上清，加入蛋白电泳上样缓冲液，在沸水中煮3min。
离心（12krpm,1min），取上清作SDS-PAGE电泳，检测表达情况。
12.2 准备50%GST Sepharose 4Bslurry（1) 将原75%Glutathione Sepharose 4B的slurry弹至混匀。
（2) 取677μl原液/管，3krpm离心5min，弃上清。
（3) 加500μl PBS，颠倒混匀，3krpm离心5min，弃上清。
反复5次。
（4) 加500μl PBS，颠倒混匀，配成50%Glutathione Sepharose 4B备用。
12.3 GST融合蛋白的纯化（1) 在新鲜制备的细胞裂解液上清中加入20μl 50%Glutathione Sepharose 4B，4℃，摇床上摇，反应30min～60min。
生物分子类实验室常用实验技术原理汇总
一、GST pull-down实验基本原理:将靶蛋白-GST融合蛋白亲和固化在谷胱甘肽亲和树脂上,作为与目的蛋白亲和的支撑物,充当一种“诱饵蛋白”,目的蛋白溶液过柱,可从中捕获与之相互作用的“捕获蛋白”(目的蛋白),洗脱结合物后通过SDS-PAGE电泳分析,从而证实两种蛋白间的相互作用或筛选相应的目的蛋白,“诱饵蛋白”和“捕获蛋白”均可通过细胞裂解物、纯化的蛋白、表达系统以及体外转录翻译系统等方法获得。
此方法简单易行,操作方便。
注：GST即谷胱甘肽巯基转移酶(glutathione S-transferase)二、足印法（Footprinting）足印法（Footprinting）是一种用来测定DNA-蛋白质专一性结合的方法，用于检测目的DNA 序列与特定蛋白质的结合，也可展示蛋白质因子同特定DNA片段之间的结合。
其原理为：DNA 和蛋白质结合后，DNA与蛋白的结合区域不能被DNase（脱氧核糖核酸酶）分解，在对目的DNA序列进行检测时便出现了一段无DNA序列的空白区(即蛋白质结合区)，从而了解与蛋白质结合部位的核苷酸数目及其核苷酸序列。
三、染色质免疫共沉淀技术（Chromatin Immunoprecipitation，ChIP）染色质免疫共沉淀技术（Chromatin Immunoprecipitation，ChIP）是研究体内蛋白质与DNA 相互作用的有力工具，利用该技术不仅可以检测体内反式因子与DNA的动态作用，还可以用来研究组蛋白的各种共价修饰以及转录因子与基因表达的关系。
染色质免疫沉淀技术的原理是：在生理状态下把细胞内的DNA与蛋白质交联在一起，通过超声或酶处理将染色质切为小片段后，利用抗原抗体的特异性识别反应，将与目的蛋白相结合的DNA片段沉淀下来。
染色质免疫沉淀技术一般包括细胞固定，染色质断裂，染色质免疫沉淀，交联反应的逆转，DNA的纯化及鉴定。
四、基因芯片（又称 DNA 芯片、生物芯片）技术基因芯片指将大量探针分子固定于支持物上后与标记的样品分子进行杂交，通过检测每个探针分子的杂交信号强度进而获取样品分子的数量和序列信息。
pull-down方法步骤汇总
pull-down⽅法步骤汇总GST-Pull down:1) 利⽤纯化好的蛋⽩进⾏GST-Pull down 实验操作。
2) 实验设置2 个组合，第⼀个是实验组(90 µl BP-His +90 µl BRM(689-952aa)-GST)，第⼆个是负对照组(90 µl BP-His + 10 µl GST)，分别在1.5 ml 的离⼼管中混合均匀。
3) 加⼊1 ml binding buffer，充分混合均匀，冰箱内30 rpm 旋转⾄少2h。
4) 加⼊30 µl GST-Bind TM Resin，冰箱内30 rpm 旋转⾄少2 h。
，100 g 离⼼ 2 min，弃去上清。
6) 加⼊1 ml binding buffer，冰箱内30 rpm 旋转5 min 进⾏洗涤，然后，100 g 离⼼ 2 min，弃去上清。
重复 5 次。
7) 加⼊40 µl 5×SDS-PAGE loading buffer，煮沸5 min，12000 g，离⼼30 sec，吸取上清点样进⾏SDS-PAGE 电泳。
8) 12 %的SDS-PAGE 胶，120 V 电泳90 min。
9) 转膜，使⽤PVDF 膜，使⽤前⽤甲醇浸泡10 min，350 mA 电流转膜2h。
10) ⽤5 %的脱脂⽜奶封闭膜，60 rpm，1 h。
11) 加⼊⼀抗(20 ml 5 %的脱脂⽜奶+5 µl anti-His)，60 rpm，1 h。
12) 倒掉⼀抗，加⼊10 ml western blotting wash buffer，60 rpm，10 min，重复3 次。
13) 加⼊⼆抗(20 ml 5 %的脱脂⽜奶+5 µl Goat anti- mouse IgG(H+L) HRP conjugate)，60 rpm，1 h。
14) 倒掉⼆抗，加⼊10 ml western blotting wash buffer，60 rpm，10 min，重复3 次。
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实验目的：体外检测蛋白质与蛋白质之间相互作用。
用于验证两个已知蛋白的相互作用，或者筛选与已知蛋白相互作用的未知蛋白。
实验原理：利用重组技术将探针蛋白与GST（Glutathione S transferase）融合，融合蛋白通过GST与固相化在载体上的GTH（Glutathione）亲和结合。
因此，当与融合蛋白有相互作用的蛋白通过层析柱时或与此固相复合物混合时就可被吸附而分离.
试剂：NaCl， KCl，Na2HPO4，KH2PO4，Triton-100，IPTG(Merck分装)，PMSF（Amersco），Cocktaier（Merck 539134），Immobilized Glutathione（PIERCE 15160）
实验操作程序：
材料及试剂
探针蛋白与GST融合的原核蛋白，裂解的细胞蛋白，或者组织蛋白提取物
细胞蛋白裂解液，洗脱液：
PBS及PBS+1%Triton-100
PBS (1L)
NaCl： 8g
KCl：
Na2HPO4：
KH2PO4：
加入800ml蒸馏水，用HCl调节溶液的pH值至，最后加蒸馏水定容至1L即可，高温高压灭菌！4℃保存备用！
PMSF(苯甲基磺酰氟) MW: 工作浓度，这里使用1mM，储存浓度100mM，将 PMSF溶于10ml 无水乙醇混匀即可！保持于-20℃或者4℃
（以下流程仅供研究已知原核蛋白A和真核过表达蛋白B相互作用）
1：原核融合蛋白A的获得
：将编码蛋白A与GST的重组质粒化转BL21(DE3)菌株
：挑取单个克隆到含有5mlLB(+100ug/mlAmp)的10ml试管里，37℃培养过夜
：将培养菌液转移到含有500ml LB(+100ug/mlAmp)的1L锥形瓶中，37℃，225rpm培养至OD600≈左右，加入适当浓度的IPTG，在适当温度下培养适当时间（诱导条件需要根据不同的蛋白做调整）.6000g，10分钟，4℃离心收集细菌，去尽上清，将菌体至于-20℃放置O/N ：室温冻融菌体，马上置于冰上，每500ml培养液加入10-20ml细菌裂解液（PBS+1%Triton-100+PMSF），吹打混匀
：冰上超声破碎，开2秒，停9秒，总40-60分钟。
至裂解液充分清凉
：11000rpm，15分钟，4℃离心分离上清， -80℃保存备用
2：真核融合蛋白B的获得
：将编码B蛋白的碱基序列克隆到编码标签蛋白（如HA,或者myc）的真核表达载体上，进行细胞转染 xq
3：48小时后，取适量融合蛋白GST-A冰上冻融
4：取50-70ulGST-Beads（Immobilized Glutathione）到EP管中，用800ul PBS+1%Triton-100润洗一次，将冻融融合蛋白GST-A与之混匀，4℃层析柜旋转结合1小时。
5：PBS+1%Triton-100洗3次，PBS洗3次。
留取20ul（ PBS+Beads）作Offer。
6：同时，裂解真核融合蛋白B，去尽培养基，用PBS(RT)洗一次，加入300ul裂解液（以6well为例，PBS+1%Triton-100+ Cocktaier），4℃放置30分钟。
7：吹打收集至管，超声破碎。
13000rpm，15分钟，4℃离心取上清。
8：BCA蛋白定量（optional）留取20ul做Offer，其余样品加入到已纯化蛋白的EP管中，用PBS补足液体到600ul左右，以便蛋白之间能充分结合！4℃旋转结合O/N9：PBS+1%Triton-100洗3次，PBS洗3次。
10：40ul 5×loading buffer溶解beads上的蛋白，煮沸3分钟，高速离心，Run –SDS PAGE 做Western Blot检测。
用HA或者myc Blot。
注意GST-pull down的对照问题。
（以A-GST和B-6*His为例）
1. 跑SDS-PAGE时点一个 input的蛋白（即B-6*His）用于做阳性对照看一下western操作过程中，试剂，操作步骤有没有问题。
2. 谷胱甘肽琼脂珠上只固定GST蛋白，input B-6*His，用于做阴性对照看一下是否GST 会与input的蛋白相互作用。