水稻瘤矮病毒部分基因组片段克隆及序列分析

结果与分析--同源克隆
1. S2片段扩增及酶切
1 2 3M4 5 6M7
8M
1.5kb 0.9kb
1.1kb
PCR扩增及重组克隆子的酶切分析
M, λDNA cleaved with HindⅢ/EcoRⅠ ；1，S2ab段扩增产物； 2~3，S2ab段重组克隆子的双酶切；4，S2cd段扩增产物；5~6， S2cd段重组克隆子的双酶切；7，S2ef段扩增产物；8，S2ef 段重组克隆子的双酶切。
其他试验材料
材料与方法（二） 方法
CF-11纤维素柱 RT-PCR 单引物扩增技术 分析软件
材料与方法（三）
克隆策略
5’
3’
Sab
Sef
Scd
覆盖RGDV基因组S2和S3片段全长的RT-PCR扩增策略
材料与方法（四）
单引物扩增技术路线
结果与分析--提取纯化
RGDV-dsRNA的电泳 A:1%琼脂糖凝胶 B:10%的SDS-PAGE 1、6、7 RDV基因组；2~5 RGDV基因组
结果与分析--同源克隆
2.全序列分析
3514bp,与RGDV-T核苷酸长度相等，同源性为 97.1%; 有一个长的ORF，由第14位核苷酸开始 延伸至3460位核苷酸，编码一个由1148个氨基 酸残基组成的多肽，分子质量约127kDa，与 RGDV-T氨基酸同源性为98.7% 。
结果与分析--同源克隆
1. S3片段扩增及酶切
12 3M4 5 6M7 8 9
1.1kb 0.75kb
1.5kb
PCR扩增及重组克隆子的酶切分析
M, λDNA cleaved with HindⅢ/EcoRⅠ ； 1，S3ab段扩增产物；2~3， S3ab酶切重组质粒；4，S3cd段扩增产物；5~6, S3cd酶切重组质粒；7， S3ef段扩增产物；8~9，S3ef酶切重组质粒。
传毒介体及传毒特性
研究概况--传统生物学
病毒粒体
呈三重对称的二十面 体结构，直径大约 65nm--70nm。
病毒粒体在水稻和 昆虫介体中的定位
水稻: 韧皮部细胞的细胞质和液泡以 及从韧皮部细胞长出的瘤细胞中； 昆虫介体: 多种细胞的细胞质中。
研究概况--传统生物学
血清学
RGDV蛋白组分的分子量和分布
M12
3M
1.6kb
PCR扩增及重组克隆子的酶切分析
M, λDNA cleaved with HindⅢ/EcoRⅠ ； 1~2，扩增产物；3，酶切重组质粒。
结果与分析--同源克隆
2.全序列分析 1578bp，与RGDV-T核苷酸长度相等，同源 性为95.7%，一个长的ORF(21--1278)，这一 ORF编码一个由426个氨基酸残基组成的多 肽，分子质量约47kDa。与RGDV-T核苷酸长度相等，同源性为98.1%。 一个长的ORF(26—997)，编码一个由323个氨基酸残基组成 的多肽，分子质量约35.6kDa，与RGDV-T氨基酸同源性为 98.5% 。
3.编码蛋白的功能分析
RGDV Pns9 与Borrelia依赖ATP的Clp蛋白水解酶同源性比较
结果与分析--系统进化
1. 外层衣壳蛋白系统发育分析
基于侵染植物的呼肠孤病毒的外层衣壳蛋白所作的系统进化树
结果与分析--系统进化
2. RGDV-Pns10系统发育分析
基于RGDV-Pns10等植物呼肠孤病毒属成员的同源蛋白所作的系统发育进化树
结果与分析--系统进化
3. RGDV-Pns11系统发育分析
讨论
2.基因组末端序列和反向重复序列
所有测定的植物呼肠孤病毒基因组片段中都存在 属特异性的末端保守序列和反向重复序列，在基 因组片段包装时，前者充当区别病毒和宿主基因 组的信号，后者充当挑拣每条病毒自身基因组片 段的信号。
讨论
3.保守结构域
由Pns11同源蛋白组成的蛋白家族具有共同 的保守域，其功能尚不清楚。但是，这一 家族与抗菌素整合酶家族（Phage integrase family）还具有一部分相同的保守结构域， 具有该保守结构域的抗菌素整合酶家族成 员具有核酸结合活性。
3. 外层衣壳蛋白保守结构域分析
RGDV、WTV和RDV外层衣壳蛋白末端氨基酸比较
结果与分析--同源克隆
1. S9片段扩增及酶切
M1 2
M3 45
1.2kb
PCR扩增及重组克隆子的酶切分析 M, λDNA cleaved with HindⅢ/EcoRⅠ ；1，空孔； 2，扩增产物；3~4，酶切重组质粒；5，空载体。
分布
1980年首次泰国发现，随后马来西亚、日本、韩国 和中国的广东、广西也有报道。福建的云霄、诏安 已有零星分布。
研究概况--传统生物学
危害
广东省信宜市发病率一般在1%-5%，重者30%以 上，水稻严重减产。重病田减产4500公斤/公顷， 甚至失收。
症状
矮缩，叶背和叶鞘上长出 2×0.5mm淡黄绿色小瘤。
本项目研究的目的及意义
理论意义
1. 国外只完成RGDV-T部分基因组片段的序列测 定及功能分析，许多基因功能尚未明确；国内 RGDV的分子生物学方面还属空白。
2. RGDV界于RDV与WTV之间，且既能在寄主植物 又能在介体昆虫的组织或细胞中复制，是研究植 物呼肠孤病毒属病毒的起源与进化以及病毒—介 体—宿主之间关系的模式对象。
小结
1. 完成了RGDV-C分离物基因组S2、 S3、S8、 S9、 S10和S11片段的克隆及全序列测定；
2. 分析了RGDV-C基因组的结构特点及其编码 特性；
3. 采用一种克隆dsRNA未知基因组片段的新方 法--单引物扩增技术，并成功获得RGDV S12 的全序列；
小结
4. 首次报道了RGDV S12片段的扩增及全序列测 定。RGDV S12片段全长853bp，具有RGDV基 因组末端序列的典型特征，可能具有二个开放 阅读框，是RGDV所完成的基因序列测定中唯 一采用多顺反子编码策略的基因组片段；
结果与分析--同源克隆
1.S10片段扩增及酶切
M123
1.2kb
PCR扩增及重组克隆子的酶切分析 M, λDNA cleaved with HindⅢ/EcoRⅠ ； 1，扩增产物；2~3，酶切重组质粒；
结果与分析--同源克隆
2.全序列分析
1198bp ，与RGDV-T的全序列长度相等，同源性为96.2%， 含有一个长的ORF(22-982)，编码一个由320个氨基酸残 基组成的多肽，分子质量约36kDa，与RGDV-T氨基酸同 源性为98.5%.
结果与分析--同源克隆
1. S11片段扩增及酶切
1 2 3M
1.2kb
PCR扩增及重组克隆子的酶切分析
M, λDNA cleaved with HindⅢ/EcoRⅠ ；1，酶切 重组质粒；2，扩增产物；3, 空载体。
结果与分析--同源克隆
2.全序列分析
全长共有1167bp，比RGDV-T缺失了4个碱基,其中3个发 生在编码区内并且导致了1个氨基酸的缺失(aa 211处Leu)， ORF为29－1065，编码355个氨基酸。核苷酸同源性为 94.3%，氨基酸同源性为96.6%。
本项目研究的目的及意义
现实意义
病区发病重，有进一步蔓延趋势，对南方稻区 具有潜在危害，因此有必要对其基因组结构及 功能进行研究。
材料与方法（一）
材料
RGDV中国广东信宜分离物（RGDV-C）采自 广东省信宜市感病的水稻（2002年9月），采 集的病株种植于防虫网室，病叶保存在-70℃冰 箱中
讨论
4. 系统进化
RGDV在属内以外层衣壳蛋白和两种非结构蛋 白进行系统发育分析时所得出的结论并不一致， 甚至相互矛盾。如果结合致瘤特性、末端保守 序列和细胞病理学的证据，则以外层衣壳蛋白 所作的系统发育分析更能反映其亲缘关系；如 果结合寄主和传毒介体特性，则以 Pns11所作 的系统发育分析为好。
5. 系统发育结合致瘤特性、末端保守序列和细胞 病理学证据分析表明RGDV与WTV比RGDV与 RDV具有更近的亲缘关系。
研究概况--传统生物学
分类地位
水稻瘤矮病毒（Rice gall dwarf virus, RGDV）属于 呼肠孤病毒科植物呼肠孤病毒属的成员之一。与三 叶草伤瘤病毒（Wound tumor virus, WTV）、水稻矮 缩病毒（Rice dwarf virus, RDV）和水稻簇矮病毒 (Rice bunchy stunt virus, RBSV)同属一类病毒。
M3 45
0.85kb
PCR扩增及重组克隆子的酶切分析
M, λDNA cleaved with HindⅢ/EcoRⅠ ； 1~2，扩增产物；3~5，单酶切重组质粒。
结果与分析--新基因扩增
2.全序列分析
RGDV S12片段 cDNA 全长序列
结果与分析--新基因扩增
3. 编码特性
RGDV S12片段的基因组织结构
研究概况--传统生物学
发病规律及防治措施
主要为害晚稻，尤以杂优稻受害重；早稻 受害较轻，是晚稻的主要侵染源。晚稻播 种后从秧针期开始即受侵染，早播早植比 迟播迟植发病重，9叶龄后感染的不发病。
控制初侵染源和杀灭传毒介体。
研究概况--分子生物学
基因组包含12条线形超螺
旋双链RNA片段，总分子 S2
3.氨基酸序列与保守结构域分析
36kDa蛋白，RDV S9片段编码的Pns9蛋白, WTV S11片 段编码的P9具相同的保守域。 RDV S9片段编码的Pns9 蛋白为非结构蛋白,因此可以推断RGDV S10片段编码 的36kDa蛋白，甚至WTV S11片段编码的P9蛋白为非 结构蛋白，不排除结构蛋白和非结构蛋白之间可以相 互转换的可能性。
结果与分析--同源克隆