花生油酸脱氢酶基因RNAi表达载体的构建
花生油酸脱氢酶基因在酿酒酵母中的高效表达
花生油酸脱氢酶基因在酿酒酵母中的高效表达
殷冬梅;崔党群
【期刊名称】《植物生理学通讯》
【年(卷),期】2007(43)4
【摘要】将克隆的油酸脱氢酶基因(AF900663)亚克隆到大肠杆菌和酿酒酵母的穿梭表达载体pYES6/CT,从大肠杆菌中筛选到含有目的基因的重组质粒pYES/HO-A,用醋酸锂方法转化到酿酒酵母缺陷型菌株INVScI中,经半乳糖诱导后,收集菌体,用气相色谱质谱(GC-MS)仪分析转化酵母的脂肪酸色谱的结果表明,HO-A所编码的酶具有油酸脱氢酶活性,能将酵母内源性油酸转化为亚油酸,油酸脱氢酶的表达量为15.6%,高于已有的报道。
【总页数】4页(P697-700)
【关键词】花生;油酸脱氢酶基因;酿酒酵母;功能鉴定
【作者】殷冬梅;崔党群
【作者单位】河南农业大学农学院
【正文语种】中文
【中图分类】Q78
【相关文献】
1.人乙醛脱氢酶2基因在毕赤酵母中的高效表达 [J], 赵锦;赵玉凤;黄锟;雷明科;吴元欣;刘洋
2.高山被孢霉ATCC16266Δ6-脂肪酸脱氢酶基因在酿酒酵母中的表达 [J], 刘莉;
李明春;胡国武;葛军;张丽;程志晖;邢来君
3.深黄被孢霉M6-22△6-脂肪酸脱氢酶基因在酿酒酵母中的表达 [J], 刘莉;李明春;胡国武;张丽;邢来君
4.花生△12脂肪酸脱氢酶基因AhFAD2B在酿酒酵母中的表达及功能分析 [J], 张洪涛;单雷;全先庆;毕玉平;杨家森;王秀丽
5.卷枝毛霉Δ~6-脂肪酸脱氢酶基因的克隆及在酿酒酵母中的高效表达(英文) [J], 郝彦玲;王颖;朱本忠;栾春光;罗云波
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一步法快速构建长片段RNAi发夹的载体
一步法快速构建长片段RNAi发夹的载体作者：刘廷利郭冬姝姚瑶张保龙来源：《江苏农业学报》2021年第05期摘要：利用RNA干擾（RNA interference， RNAi）技术可以进行基因功能研究以及作物遗传改良，但常规构建RNAi载体方法费时费力。
本研究报道了一种基于 USER 酶一步法快速构建RNAi发夹结构的载体2301/RNAi/OS及其应用方法，操作简便，省时省力。
与已报道的利用酶切连接、Gateway兼容的同源重组或PCR直接连接等构建RNAi载体相比，该载体不需要酶切片段，片段扩增完成后即可与制备好的线性化载体进行反应，缩短操作流程和时间，提高成功率;该载体对插入片段的酶切位点和长度没有要求，理论上任何位置和长度的片段均可进入2301/RNAi/OS载体中，尤其是长片段RNAi的构建。
本试验以本氏烟（ Nicotiana benthamiana ） PDS （ Phytoene desaturase ）基因为例，利用农杆菌介导的瞬时表达体系验证了该RNAi能够在植物体内有效地实现基因沉默。
该载体以新霉素磷酸转移酶基因（ NPTII ）作为筛选标记基因，可以利用卡那霉素（Kanamycin）和G418（Geneticin）等抗生素筛选转基因阳性植株，适合单子叶和双子叶植物的遗传转化。
关键词： RNA干扰（RNAi）; USER 酶; 一步法; 载体构建; 基因沉默中图分类号： Q782 文献标识码： A 文章编号： 1000-4440（2021）05-1131-06A one-step method for rapid construction of long-fragment RNA interference vectorLIU Ting-li， GUO Dong-shu， YAO Yao， ZHANG Bao-long（Excellence and Innovation Center， Jiangsu Academy of Agricultural Sciences， Nanjing 210014， China）Abstract： RNA interference （RNAi） technology can be used for gene function research and crop genetic improvement， but the conventional construction method of RNAi vector is time-consuming and laborious. In this research， we provide a one-step method for rapid construction of long-fragment RNAi vector using uracil-specific excision reagent （ USER ） enzyme. The methodis simple， time-saving and labor-saving. Compared with the reported RNAi vectors constructed by restriction enzyme ligation method， Gateway compatible homologous recombination method and PCR direct ligation method， this vector dose not need enzyme digestion fragments. After the fragment amplification is completed， it can react with the prepared lineurized vector. Therefore，the operation process and time are shortened， and the success rate is improved. This vector has no requirements for the restriction site and length of the inserted fragment. Using neomycin phosphotransferase （ NPTII ） as selective marker gene in this vector， kanamycin and geneticin （G418） can be used to screen transgenic positive plants. It is suitable for genetic transformation of dicot and monocot plants.Key words： RNA interference（RNAi）; USER enzyme; one-step method; vector construction; gene silencingFire等发现双链RNA （dsRNA）可引发线虫体内的基因沉默，并将这一现象命名为RNA 干扰（RNAi）。
高效率构建包含内含子的hpRNAi植物载体
高效率构建包含内含子的hpRNAi植物载体高效率构建包含内含子的hpRNAi植物载体摘要在植物基因功能分析中广泛使用的双链RNA干扰（RNAi），是一种高效率的系统，对于制作发夹RNA（hpRNA）结构有一个很大的需求量。
在这里，我们描述了一种新的限制性连接方法，提供了包含内含子的hpRNA（ihpRNA）载体的一种简单而高效的建设。
该系统以优势型IIS的限制性内切酶BsaI和我们新的植物RNAi载体pRNAi-GG（GG）以GG克隆为基础。
这种方法需要有感兴趣的基因的BsaI 识别序列侧翼只有一个单一的PCR产物，然后可以克隆到pRNAi-GG 上在正方向和反方向同时形成ihpRNA的构造。
在这个过程中，在一个管与一个限制性连接步骤完成后，产生的重组ihpRNA具有高效率和零背景。
我们证明与pRNAi-GG载体向量生成的ihpRNA结构的效用有效沉默各种单独的内源和外源标志物基因以及同时沉默这两个基因。
此方法提供了植物功能基因组学的大规模分析的新颖的和高效率的平台。
介绍在双链RNA被发现作为一体的能触发RNA干扰（RNAi）之后[1]，RNA干扰也成为一个基因功能[2-4]分析的最强大的工具。
发夹RNA（hpRNA）结构通常用于通过RNA干扰[5]的机制来诱导靶基因的degra-dation。
在植物中，含有发夹RNA的内含子（ihpRNA）配有一个内含子作为间隔序列表示出了最高基因沉默效率[6]。
因此，ihpRNA结构已被广泛用于植物中的基因沉默。
与在植物中基因序列的爆炸性释放和基因组序列，高效率和成本制作ihpRNA结构系统需求量很大。
为了便于ihpRNA结构的产生，几种方法已经被报道。
传统的连接酶的载体如pHANNIBAL和pKANNIBAL首次使用生成ihpRNA结构[6]。
该方法需要几轮限制和连接，并且因此，比较乏味和耗时。
有一种可替代地方法，GATEWAY 克隆系统为基础的RNAi载体如pHELLSGATE系列和PIPK系列已被广泛用于产生ihpRNA结构[7-9]。
一种植物RNAi表达载体及其构建方法和应用[发明专利]
![一种植物RNAi表达载体及其构建方法和应用[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/11afbd317f1922791788e898.png)
专利名称：一种植物RNAi表达载体及其构建方法和应用专利类型：发明专利
发明人：李成伟,廖立冰,于德水,张菊,张怡,徐克东,刘坤,谭光轩,陈璨,何勇,付贝贝
申请号：CN201810046195.1
申请日：20180117
公开号：CN108342409A
公开日：
20180731
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种植物RNAi表达载体及其构建方法和应用。
本发明以商业化的植物表达载体pCambia2301和pHANNIBIAL为基础，构建了含有CaMV35S启动子、内含子、OCS终止子、两个方向相反的Gateway盒子的植物RNAi表达载体，该载体可利用Gateway技术进行植物目的基因沉默载体的构建；本发明还建立了所述植物RNAi表达载体的构建方法，以及利用融合PCR进行一步Gateway反应构建含有目的基因RNAi沉默载体的应用。
申请人：周口师范学院
地址：466001 河南省周口市川汇区文昌路东段周口师范学院
国籍：CN
代理机构：郑州大通专利商标代理有限公司
代理人：陈勇
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黄曲霉漆酶基因HIGS载体的构建及对花生的转化
黄曲霉漆酶基因HIGS载体的构建及对花生的转化作者：孙全喜王云云王秀贞唐月异吴琪张青云曹广英王传堂来源：《山东农业科学》2015年第10期摘要：黄曲霉毒素污染严重影响着花生食品安全。
通过常规育种的方式培育抗黄曲霉花生新品种进展缓慢，效果也难如人意。
HTGS（Host-Induoed Gene Silencing，寄主诱导的转基因沉默）技术是一种新兴的RNA干扰技术，为培育抗病植物提供了可能。
但该技术在花生上的应用尚未见报道。
为创造抗黄曲霉花生新品系，本研究利用该技术构建了两个黄曲霉漆酶基因（Lac1和Lac2）的HIGS载体，并试图将其转化到易感黄曲霉的花生品种粤油20中，获得了转Lac1基因的PCR阳性种子。
根据HIGS的原理，黄曲霉侵染后，转基因花生中产生的dsRNA将抑制黄曲霉漆酶基因表达，从而使转基因花生对黄曲霉产生抗性。
基于该原理，下一步将对转基因种子是否抗黄曲霉侵染进行鉴定。
本研究为利用HTGS技术探索黄曲霉漆酶基因与黄曲霉致病性的关系奠定了基础，为培育抗黄曲霉花生品种提供了一条新思路。
关键词：花生；黄曲霉；漆酶基因；寄主诱导的转基因沉默（HIGS）；遗传转化中图分类号：S565.203.53文献标识号：A文章编号：1001-4942（2015）10-0008-05花生是世界重要的油料作物和经济作物，特别在广大发展中国家，是重要的食用蛋白源和食用植物油源。
我国是世界花生生产和消费大国，也是花生贸易大国。
然而，花生易受黄曲霉菌侵染而产生黄曲霉毒素，严重影响着花生的食品安全。
黄曲霉侵染花生时，会诱导花生产生抗病反应，释放植保素（Phytoalexins）。
花生不同品种中植保素的积累被认为与抗病性有关。
花生中的植保素主要是芪类化合物（Stilbenoids），此类化合物大部分具有抗真菌活性。
而黄曲霉漆酶（Laccase）能够降解芪类化合物，漆酶活性高低与黄曲霉致病性强弱有直接关系。
漆酶是一种含铜多酚氧化酶，广泛存在于植物、高等真菌和一些细菌分泌物中。
花生_12_脂肪酸去饱和酶基因RNAi表达载体的构建
收稿日期:2006-01-12基金项目:国家转基因专项(J Y 04-B -01)作者简介:陈占宽(1946-),男,河南南乐人,副研究员,主要从事植物基因工程研究工作;张新友为通讯作者。
花生Δ122脂肪酸去饱和酶基因RNAi 表达载体的构建陈占宽1,张新友2,苗利娟1,黄冰艳1,汤丰收2,张忠信2(11河南省农业科学院生物技术研究所,河南省农作物新品种重点实验室,河南郑州 450002;21河南省农业科学院棉花油料作物研究所,河南郑州 450002) 摘要:利用RNAi 原理构建花生Δ12-脂肪酸去饱和酶基因的hpRNA 表达载体,以抑制该基因的表达,获得高油酸/亚油酸比值的花生种质。
根据花生Δ12-脂肪酸去饱和酶基因序列(G enBank :AF248739)设计引物,以豫花4号花生品种DNA 为模板,克隆了该基因的启动子及长度约500bp 的外显子片段,在此基础上构建完成由自身启动子引导的花生Δ12-脂肪酸去饱和酶基因的反向重复片段RNAi 载体pC AM BI A1301-A fad12Ri 。
关键词:花生;Δ12-脂肪酸去饱和酶;RNA 干扰;发夹RNA ;载体构建中图分类号:S56512 文献标识码:A 文章编号:1000-7091(2006)04-0009-04RNAi Plasmid Construction of Delta 2122fatty Acid DesaturaseG ene from PeanutCHE N Zhan 2kuan 1,ZHANG X in 2y ou 2,MI AO Li 2juan 1,HUANG Bing 2yan 1,T ANG Feng 2shou 2,ZHANG Zhong 2xin 2(1.Biotechnology Research Institute ,Henan Academy of Agricultural Sciences ,Henan K ey Laboratory for Crop Im provement ,Zhengzhou 450002,China ;21C otton and Oil Crops Research Institute ,Henan Academy of Agricultural Sciences ,Zhengzhou 450002,China )Abstract :An RNAi plasmid is constructed to inhibit the expression of delta 212-fatty desaturase gene in peanut ,in order to down regulate the biosynthesis of linoleic acid and obtain transgenic lines with high oleic acid /linoleic acid ra 2ti o 1The primers were designed based on the sequence of delta 2122fatty desaturase gene released in G enBank(AF248739),and the prom oter region and partial extron of the gene in peanut was cloned using the genomic DNA from peanut cultivar Y uhua 4as tem plate 1An RNAi plasmid pC AM BI A13012A fad12Ri was constructed which contains the cloned prom oter and inverted repeats of delta 2122fatty desaturase gene fragment 1K ey w ords :Peanut (Arachis hypogaes );Delta 2122fatty desaturase gene ;RNAi ;hpRNA ;Plasmid construction 花生是我国重要的油料作物,种植面积仅次于油菜,总产、单产及出口量居首位,但其销售价格却低于国际市场价格30%以上。
花生FAD2-RNAi载体基因AFLP标记的克隆及序列分析
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中 图 分 类 号 ：５ ５ ２ ２４ ￥ ６ ． ０ ． 文献 标 识码 ： Ａ
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花生 Ｆ ＡＤ２ＲＮＡｉ 体 基 因 ＡＦ Ｐ 一 载 Ｌ 标 记 的克 隆及 序 列 分 析
张 宁 洁 ， 国庆 熊发 前 高 ，
（． 西 大 学 ， 西 南 宁 ５０ ０ ；． 西 农 业 科 学 院 生 物 实 验 室 ， 西 南 宁 ５ ０ ０ １广 广 ３０３２广 广 ３ ０ ３）
番茄脯氨酸脱氢酶基因的克隆与RNAi植物表达载体的构建
编码 ３ ８ ０个 氨 基 酸 。测 序 结 果 与 公 布 序 列 同 源 性 １ ０ ０ ， 因此 可 以用 来 构 建 干 扰 载 体 ；通 过 酶 切 与 测 序 鉴 定 ，证 明表 达 载 体 构 建 成 功 。【 结论 】 经 特 异 性 引物 扩 增 检 测 ，证 明表 达 载 体 已转 入 农 杆 菌 ，为 进 一 步 的 研 究 该 基 因 奠
（ 北 京农 学 院 植 物科 学技术 学 院 ，北京 １ ０ ２ ２ ０ ６ ）
摘 要 ：【 目的】 克 隆 了脯 氨 酸 脱 氢 酶 Ｐ ｒ ｏ ＤＨ 基 因 的全 长 ｃ ＤＮ Ａ，构 建 了 Ｐ ｒ ｏ ＤＨ 基 因 的 ＲＮ Ａ 干 扰 植 物 表 达 载
体 ，并 转 化 到 农 杆 菌 。 【 方法】 以 “ 耐运 ２ ０ ０ ０番 茄 ” 幼 苗 为 试 材 ，根 据 Ｇｅ ｎ Ｂ ａ ｎ中公 布 的 番 茄 脯 氨 酸 脱 氢 酶 Ｐ ｒ ｏ ＤＨ 基 因的 序 列 信 息 没计 了一 对 特 异 性 引 物 ，克 隆 了 该 基 因 的 全 长 ｃ ＤＮ Ａ，分 析 基 因 序 列 选 择 正 反 向 片段 并 扩 增 ，并 通 过 酶 切 、连 接 的 方 法 构 建 了 Ｐ ｒ ｏ ＤＨ 基 因 的 Ｒ ＮＡ 干 扰 植 物 表 达 载 体 Ｐ ＢＩ １ ２ １ 一 ＰＤＨｉ ；利 用 冻 融 法 将 表 达 载 体 转 化 到 农 杆 菌 ＥＨＡ１ ０ ５中 。【 结 果 】 所 克 隆 到 的 Ｐｒ ０ ＤＨ 基 因片 段 长 ２ ０ ¨ 。 ｌ ｂ ｐ ，其 中 Ｃ Ｄ Ｓ为 １ ４ ９ １ ｂ ｐ ，
Ｊ ｏ ｕ ｒ ｎ ａ ｌ ｏ ｆ Ｂｅ ｉ ｊ ｉ ｎ ｇ Ｕｎ ｉ ｖ ｅ ｒ ｓ ｉ ｔ ｙ ｏ ｆ Ａｇ ｒ ｉ ｃ ｕ ｌ ｔ ｕ ｒ ｅ
RNAi技术原理与表达载体的构建
RNAi表达载体构建近年来的研究表明,一些短片断的双链RNA可以通过促使特定基因的mRNA降解来高效、特异的阻断体内特定基因表达,诱使细胞表现出特定基因缺失的表型, 称为RNA干扰（RNA interference,RNAi）.siRNA（small interfering RNAs）就是这种短片断双链RNA分子,能够以序列同源互补的mRNA为靶目标,降解特定的mRNA.RNAi的发现具有划时代的意义,它不仅深入揭示了细胞内基因沉默的机制,而且它还是后基因组时代基因功能分析的有力工具,极大地促进了人类揭示生命奥秘的进程.现在越来越多的研究人员开始采用RNAi 来研究生物体的基因表达.RNAi技术可广泛应用到包括功能基因组学,药物靶点筛选,细胞信号传导通路分析,疾病治疗等等。
目前为止较为常用的5种制备siRNAs的方法包括：1.化学合成2.体外转录3.长片断dsRNAs经RNase III 类降解(e.g. Dicer, E. coli, RNase III)4.siRNA表达载体或者病毒载体在细胞中表达siRNAs5.PCR制备的siRNA表达框在细胞中表达获得高纯度的siRNA产物是进行实验的第一步,而转染的效率则是非常关键的因素。
一、基本概念1.RNAi：（RNA interference）RNA干扰内源性或外源性双链RNA(dsRNA)介导的能诱导细胞内与其序列同源的特异基因表达沉默或抑制的效应,诱使细胞表现出特定基因缺失的表型,称为RNA干扰,它也是体内抵御外在感染的一种重要保护机制.2.siRNA ：(small interfering RNAs)小干扰RNA由长dsRNA裂解而成的一种19-25nt的短片断双链RNA分子,能够以同源互补序列的RNA为靶目标降解特定的mRNA, RNAi的关键效应分子.3.shRNAs:(small hairpin RNA )小发夹RNA是设计为能够形成发夹结构的非编码小RNA分子,shRNA需通过载体导入细胞后,然后利用细胞内的酶切机制得到siRNA而最终发挥RNA干扰作用.4.Dicer：属于RNaseⅢ家族,是dsRNA的特异性核酸内切酶5.RISC：(RNA-inducing silencing complex) RNA诱导的沉默复合体,具有核酸内切、外切以及解旋酶活性二、机制目前普遍认为,共抑制、基因压制和RNAi很可能具有相同的分子机制,都是通过dsRNA的介导而特异地降解靶mRNA, 抑制相应基因的表达. 即RNAi、共抑制、quelling均属于PTGS！现已初步阐明dsRNA介导的同源性靶mRNA降解过程主要分为两步.1.第一步（起始阶段）是较长ds RNA在ATP参与下被RNaseⅢ样的特异核酸酶切割加工成21~23nt的由正义和反义链组成的小干扰RNA（small interfering RNA,siRNA）.2.第二步（效应阶段）是siRNA 在ATP参与下被RNA解旋酶解旋成单链,并由其中反义链指导形成RNA诱导的沉默复合体(RNA-induced silencing complex,RISC).siRNA双链结合一个核酶复合物从而形成所谓RNA诱导沉默复合物（RISC）。
rnai载体构建的基本流程
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第 １ 期
殷 冬 梅 等 ： 生 油 酸 脱 氢 酶 基 因 Ｒ Ａ 表 达 载 体 的 构 建 花 Ｎ ｉ
２ ５
余 国产或 进 口分析 纯试剂 购 自上海 Ｓ ｎ ｏ ａ ｇｎ公 司．
１２ Ｐ ． ＣＲ 引 物
根据 克 隆的花 生 Ｆ Ｄ Ａ ２基 因序 列 ， 设计 了位 于
设计 对应 的 片段大 小相符 （ １ ． 限制 性 内切 酶 图 ）用 Ａ ｃ，ｗ Ｉ 酶切 ｐ Ｇ １ ０ ｓＩＳ ａ 双 Ｆ Ｃ ０ ８载体 质粒 与 目的 Ｐ Ｒ Ｃ 片段 ， 酶切产 物 纯 化 后 用 Ｄ Ａ Ｌｇｔ ｎ Ｋｔ连 接 ， Ｎ ｉ ｉ ｉ ａｏ
连 接 产 物 热 转 化 Ｅ ｃｌ Ｄ ５ｔ 受 态 细 胞 ， 机 挑 ．ｏｉ Ｈ ｏ 感 随
进 行 酶 切 验 证 ，Ａ ｃ ，ｐ Ｉ 酶 切 用 于 检 测 反 向 重 ｓＩＳ ｅ 双 复 序 列 和 内 含 子 （ ｕ ， ｅｅ 共 计 约 １０ ０ ｂ ， Ｇ ｓ ｇｎ ） ０ ｐ 用 Ｓ ａ ，ｐ Ｉ 酶 切 用 于 检 测 反 义 链 和 内 含 子 （ ｕ ｗ ＩＳ ｅ 双 Ｇｓ ｇｎ ） 计 约 ７ ０ｂ ， 泳 结 果 显 示 ： 增 产 物 大 小 ｅｅ 共 ６ ｐ 电 扩
Ｄ Ａ Ｌｇｔ ｎＫｔ 自大 连 宝 生 物 （ ａ ａ ａ 公 司 ， Ｎ ｉ ｉ ｉ购 ａｏ ＴＫＲ ）
其 高度 特 异 、 效 而 备受 关 注 ’ ， 用 Ｒ Ａ 技 高 ｍ 应 Ｎｉ
术调控脂 肪 酸及 淀粉 代 谢 等 已有 成 功 报 道 ， 但关 于花生 油 酸脱 氢 酶 基 因 Ｒ Ａ 表 达 载 体 的 构 Ｎｉ 建 尚少见报道 ． 研究根 据 已经 克隆的花生 油酸脱 本
ｇ ｎ ｒ ｍ ｅ ｎ ｔ ｅ ｅｆｏ ｐ ａ ｕ
Ｙ Ｎ Ｄ ｎ— ｅ， Ｕ ａｇｑ ｎ Ｔ Ｉ ｕ —ｉ ， Ｉ Ｎ ｉｇｊａ Ｉ ｏ ｇｍ ｉ Ｃ Ｉ ｎ —ｕ ， Ａ ｏｑｎ Ｊ Ｇ Ｌｎ － ｎ Ｄ Ｇ Ａ ｕ （ ｅａ ｇｉ ｌ ｒ ｎｖｒ ｔ， ｈｎ ｚｏ ５ ０ ２ ｈｎ ） Ｈ ｎ ｎＡ ｒ ｕｔ ａ Ｕ ｉ ｓｙ Ｚ ｅｇｈｕ４ ０ ０ ，Ｃ ｉａ ｃ ｕｌ ｅｉ
转化人 大肠 杆菌感 受 态细胞 中 ， 取 阳性克 隆提质 挑
粒． 切鉴 定 Ｆ Ｒ 已经插 入 ｐ Ｇ １０ 酶 ２２ Ｆ Ｃ ０ ８的 重 组 质
粒命 名 为 ｐ Ｇ ／ ． 重 组 质 粒 ｐ Ｇ ／ Ｆ Ｃ １ｔ 以 ｓ Ｆ Ｃ １ｔ为 模 ｓ 板， Ｆ Ｒ 以 ２， ２为 引物进 行第 ２轮 Ｐ Ｒ扩增 ， Ｃ Ｃ Ｐ Ｒ产 物命 名 为 Ｆ Ｒ ’ 将 ｐ Ｇ ／ 和 Ｆ Ｒ 分 别 用 ２ ２ ， Ｆ Ｃ １ｔ ｓ ２ ２’ Ｓ ｅ， ａ Ｉ 行第 ２次酶 切 ， ｐＩＢ ｍＨ 进 回收 、 接 、 化 、 连 转 涂
图 ２ ＰＣＲ 西 检 电 冰 图
Ｆｉ ２ ＰＣＲ ｇ． Ａｍ ｐｌ ｃ ｔｏ ｒ ｓ ｌ ｆｔ ｉ ｌ ｌ ｎｅ ｉ ａ ｉｎ ｅ ｕ ｔｏ ｈｅ ｓｎｇｅ ｃ ｏ ｉ ｆ
Ｐ ＣＲ引 物 由 大 连 宝 生 物 公 司合 成 ．
２ ２ Ｒ Ａｉ 达 载 体 第 ２链 的 构 建 ． Ｎ 表 以重 组 质 粒 ｐ Ｇ ／ 为 模 板 ，２ Ｒ Ｆ Ｃ １ｔ ｓ Ｆ ， ２为 引 物
花 生 油 酸 脱 氢 酶 基 因 Ｒ ｉ 达 载 体 的构 建 ＮＡ 表
殷 冬梅 ，崔 党群 ， 国琴 ，姜 灵 娟 台
（ 南 农 业 大 学 ，河 南 郑 州 ４ ０ ０ ） 河 ５ ０ ２
摘 要 ： 据 克 隆 的花 生 油 酸 脱 氢 酶基 因序 列 ， 取 高度 保 守的 ２０ ｂ 根 选 ６ ｐ片段 ， 入 植 物 双 元 表 达 栽 体 ｐ Ｇ Ｉ０ 插 Ｆ ＣＯ８
Ｒ ２为 引 物 进 行 Ｐ Ｒ 扩 增 ， Ｐ Ｒ 产 物 （ ２ ２ 和 Ｃ 将 Ｃ ＦＲ ）
质粒 ｐ Ｇ １０ Ｆ Ｃ ０ ８分别 用 Ａ ｃ 和 Ｓ ａ 酶切 ， 经 过 ｓＩ ｗＩ 将
双酶 切 的 Ｆ Ｒ ２ ２和 ｐ ＧＣ１ ０ Ｆ ０ ８按 ５ １比 例 用 Ｄ ： ＮＡ
Ｌｇｔ ｎＫ ｔ ６ ℃ 连 接 过 夜 ， 日取 １ Ｌ连 接 液 ｉ ｉ ｉ１ ａｏ 次 ０
材料奠定 基础．
人体 健 康 ． 此 ， 因 提高 花 生 油 中单 不 饱 和脂 肪 酸
（ 如油酸 ） 含量 具 有 重要 意 义． 着 人们 对 高 品 质 随
植 物油 的需求 增加 ， 基 因工程 手段调节 不饱和脂 用 肪 酸含量 的研究 受到越来 越多 的关注 的应用 ． 统 的 传
板 ， Ｃ 检 菌 、 质 粒 ， 切 鉴 定 Ｆ Ｒ ’ 经 插 入 ＰＲ 提 酶 ２２ 已 ｐ Ｇ ／ 的 重 组 质 粒 命 名 为 ｐ Ｇ ／ ｎ ． Ｆ Ｃ １ｔ ｓ Ｆ Ｃ２ｄ
与预期 相符 （ ３ ． 而证 明 了包 含有反 向重 复序 图 ）从 列 的双元表 达载 体 ｐ Ｇ ／ ｎ Ｆ Ｃ ２ ｄ已经构 建 完成 ， 体 具 构建 过程见 图 ４ ．
收 祷 日期 ：０ ９— ９—２ ２０ ０ ９
卡那 霉 素 、 霉 素、 链 氯霉 素 、 均 购 自 Ａ ｒｓｏ 其 等 ｍ ｅｃ ，
基 金项 目 ： 家 自然 科 学基 金 项 目（ ０７ ８０ ； 南 省 重 大科 技 攻 关项 目 （９ １ １１５ ０ 国 ３９ １０ ） 河 ０ ２０ １０ ０ ） 作 者简 介 ： 殷冬 梅 ，９ ２年 生 ， ， 南 方 城人 ， 教 授 ， 士 ， １７ 女 河 副 博 研究 方 向为 分 子生 物 学 与花 生 遗 传 育种
期 第 ４ ４卷 第 １
２ ０钽 ０１
河 南 农 业 大 学 学 报
Ｊ ｕ ｎ ｌｏ ｎ ｎ Ａｇｉ ｕ ｔ ｒ ｌＵｎ ｖ ｒｉｙ ｏ ｒ ａ ｆＨｅ ａ ｒｃ ｌ ａ ｉｅ ｓｔ ｕ
Ｖｏ ． Ｎｏ １ １４４ ． Ｆ ｂ． ｅ ２ ０ ０１
２月
文 章 编 号 ：０ ０—２ ４ （ ０１ ０１—０ ２ １０ ３ ０ ２ ０） ０ ４一ｏ ４
１３ 特 异 表 达 载 体 的 构 建 ．
以 包 含 花 生 Ｆ ２基 因 的 质 粒 为 模 板 ， Ｆ ＡＤ 以 ２，
进行 第 ２轮 Ｐ Ｒ 扩增 ， Ｃ Ｃ Ｐ Ｒ产 物 （ ２ ２’ 切 胶 回 ＦＲ ）
收 ． 重 组 质 粒 ｐ Ｇ ／ 和 Ｆ Ｒ 分 别 用 Ｓ ｅ ， 将 Ｆ Ｃ １ｔ ｓ ２ ２’ ｐＩ Ｂ ｍ Ｉ 行第 ２次 双酶切 ， 切产 物纯 化 后按 １ ５ ａＨ 进 酶 ： 比例 连接 ， 行热 击转 化 ， 进 挑选 阳性 克 隆提取质 粒 ，
ｏ ｌａ ｅｄ ｓ ｔ ｒ ｓ ｅ ｅ ｉ ｅ ｎ ｔ ｎ ｏ ｄ ｒｔ ｂ ａｎ ｔａ ｓ ｅ ｉ ｉ ｅ ｔ ｉｈ ｏ ｅｃ ａ ｄ ｌ ｏｅ ｃ ａ ｉ ｆｏｅ ｔ ｅ ａｕ ａ ｅｇ ｎ ｎ ｐ ａ ｕ ，ｉ ｒ ｅ ｏ ｏ ｔ ｉ ｒ ｎ ｇ ｎ ｃ ｌ ｓｗｉ ｈ ｇ ｌｉ ｎ ｉ ｌｉ ｃｄ ｎ ｈ ｎ
ｒ ｐ ａ ｆｔ ｅ ａ ｔ－ ｘ ｒ ｓ ｉｎ ｖ ｃｏ ＦＧＣ ２ｎ ｅ ｅ ｔｏ ｈ ｎ ｉｅ ｐ ｅ ｓｏ ｅ ｔ ｒｐ ／ ｄ．Ｔｈ ｅ ＲＮＡｉｔｃ ｎｉｕ ｓｕ ｅ ｏ ｉｈｉ ｔｔ ｅ ｅ ｐ ｅ ｓｏ ｅ ｈ ｑ ｅ ｗａ ｓ ｄ ｔ ｎ ｂｉ ｈ ｘ ｒｓ ｉｎ
Ａｂｓｒ ｃ ：Ａｃ ｏｄｉｇ ｔ ｈ ｅ ｕｅ ｃ ｆｏｅ ｔ ｅ ａｕ ａ ｅ ｇ ｎ ｒ ｍ ｅ ｎ ｔ ｔ ｅ ｈ ｇ ｌ ｏ ｓ ｒ ａｉｅ ｔａ ｔ ｃ ｒ ｎ ｏ ｔ ｅ ｓ ｑ ｎ ｅ ｏ ｌ ａｅ ｄ ｓ ｔ ｒ ｓ ｅ ｅ ｆｏ ｐ ａ ｕ ， ｈ ｉｈ ｙ ｃ ｎ ｅ ｖ ｔｖ ｓ ｑ ｅ ｃ ６ ｐ ｗａ ｅｅ ｔｄ ａ ｄ ｃｏ ｅ ｎ ｏ ｔ ｅ ｅ ｐｒｓ ｉｎ ｖ ｃ ｏ ， ｐ ＧＣ１ ０ ｅ ｕ ｎ ｅ ２ ０ ｂ ｓ ｓ ｌｃ ｅ ｎ ｌ ｎ ｄ ｉ ｔ ｈ ｘ ｅ ｓｏ ｅ ｔｒ Ｆ ０ ８，ｔ ｅ ｅａ ｅ ｒ ｖ ｒｅ ｏ ｇ ｎ ｒ ｔ ｅ ｅ ｓ
氢酶 Ｆ Ｄ Ａ ２基 因序 列 ｍ Ａ ０ ６ ３ 中一 段 保 守 （ Ｙ１０ ６ ）
的序列设 计引物 ， 扩增约 ２ ０ｂ ６ ｐ片段 ， 建反 向重 构
复序列双元 表 达载 体 （ Ｆ Ｃ ２ ｄ ， 进 一 步通 过 ｐＧ ／ｎ）为 农 杆菌介 导法转入 花生 品种 ， 筛选 出高油酸 的种 质
ｒｔ ． ａｉ ｏ
Ｋ ｅ ｏ ｄ ｐ ａ ｕ ； ｏｅ ｔ ｅ ａｕ ａ ｅ；ｅ ｐ ｅ ｓｏ ｅ ｔｒ ＲＮＡ ｎ ｅｆ ｒ ｎ ｅ ｙ ｗ ｒ ｓ： ｅ ｎ ｔ ｌａｅ ｄ ｓ ｔ ｒ ｓ ｘ ｒ ｓｉ ｎ ｖ ｃｏ ； ｉ ｔｒｅｅ ｃ
花 生是重要 的油料作 物 ， 富含油 酸 、 亚油 酸 ， 二 者 的相对 比例决定 着花生 油的品质 ， 提高油酸含 量 不仅有利 于提高花生 油 的稳定 性和风 味 ， 更有益 于
中 ， 建 完成 具 有 反 向 重 复序 列的 ｐ Ｇ ／ ｎ 构 Ｆ Ｃ ２ ｄ表 达 栽体 ， 用 Ｒ Ａ 以抑 制 内源 目的基 因表 达 ， 获得 高 油 酸 亚 利 Ｎ ｉ 为
油酸 比值 的 花 生种 质 奠 定基 础 ．
关 键 词 ： 生 ； 酸脱 氢酶 ； 达 栽 体 ； Ｎ 干扰 花 油 表 Ｒ Ａ
中图 分 类号 ：５ ５ ２； ７ ２ ￥ ６ ． Ｑ ８ 文 献标 志 码 ： Ａ
Ｃｏ ｓｒ ｃ ｉ ｎ ｏ ｎ ｔ ｕ ｔｏ ｆ ＲＮＡｉｅ ｐ ｅ ｓｏ ｅ ｔ ｒ ｏ ｌ ａ ｅ ｄ ｓ ｔ ｒ ｓ ｘ ｒ ｓ ｉ ｎ ｖ ｃ ｏ ｆｏ ｅ ｔ ｅ ａ ｕ ａ ｅ
２ 结 果 与 分 析
２ １ Ｒ ｉ 达 载 体 第 １链 的 构 建 ． ＮＡ 表 对 测定 的 Ｆ Ｄ Ａ ２序 列 进 行 Ｂａｔ 析 ， 取 高 ｌ ｎ分 ｓ 选