微波水解衍生高效液相色谱法测定西洋参中的氨基酸_渠琛玲

图 1 氨基 酸与衍生剂比例对衍生反应的影响 F ig . 1 E ffec ts o f ratio o f a m ino ac ids to 2, 4 din itrofluorobenzene( DNFB) on de rivation reaction
a . 微波衍生 ( m icrow ave derivat ion ) ; b . 加热衍生 ( heat ing derivation ) 。
表 1 16 种氨基酸的标准曲线 , 浓度范围和检出限 T able 1 Ca libration curve , concentra tion range and LOD fo r 16 am ino ac ids
氨基酸 Am ino acids A spart ic acid( A sp) G lutam ic acid( G lu) S erin e( Ser) H istid in e( H is) G lycine( G ly) Pro line( Pro) A lan ine( A la) V alin e( V al) M eth ion in e( M et) Cysteine( Cys) Isoleucin e( Ile) Leu cine( Leu ) Tryptophan ( T rp) Phenylalan in e( Phe) Lysine( Lys) Tyrosine( Tyr) 标准曲线 Standard curve A = 10168 . 36c- 837 . 08 A = 10534 . 89c- 1190. 86 A = 14337 . 87c- 703 . 10 A = 5272. 65c- 138 . 62 A = 20233 . 51c- 610 . 11 A = 12279 . 66c- 543 . 07 A = 16664 . 08c- 1032. 16 A = 11945 . 95c- 379 . 46 A = 10670 . 88c- 899 . 52 A = 12463 . 77c- 979 . 17 A = 10870 . 46c- 387 . 83 A = 11972 . 26c- 731 . 6729 A = 8342. 03c- 126 . 33 A = 9295. 139c- 402 . 16 A = 11670 . 98c- 127 . 86 A = 12242 . 64c- 149 . 40 相关系数 ( r) 0 . 9991 0 . 9992 0 . 9962 0 . 9996 0 . 9982 0 . 9983 0 . 9977 0 . 9986 0 . 9970 0 . 9984 0 . 9982 0 . 9973 0 . 9947 0 . 9977 0 . 9950 0 . 9994 浓度范围 Con cent ration range ( g /L ) 0. 033~ 2 .1 0. 03~ 1 . 9 0. 015~ 0 . 98 0. 043~ 2 .6 0. 022~ 0 .7 0. 030~ 1 .9 0. 020~ 1 .3 0. 014~ 0 . 88 0. 026~ 1 .7 0. 015~ 0 . 98 0. 015~ 0 . 97 0. 021~ 1 . 33 0. 016~ 0 . 99 0. 018~ 1 . 14 0. 023~ 1 . 45 0. 015~ 0 . 95 检出限 LOD ( g /L ) 0 . 0021 0 . 0020 0 . 0015 0 . 0040 0 . 0010 0 . 0017 0 . 0013 0 . 0018 0 . 0020 0 . 0017 0 . 0019 0 . 0018 0 . 0025 0 . 0023 0 . 0018 0 . 0017
2008 08 15收稿 ; 2008 12 04接收 * E m ai: l analchem@ jlu . edu. cn686Βιβλιοθήκη 分析化学第 37 卷
( T yr) 购于 Sigm a 公司; DNFB 购自武汉福鑫化工有限公司。实验中所用的乙腈为 H PLC 级, 水经过 M illi Q 系统纯化。其它试剂均为分析纯。向 0 . 03 m o l/L 乙酸钠溶液 ( 含 0 . 15 % 三乙胺 )中加入乙酸, 调至 p H 为 5 . 1 , 配制成乙酸 乙酸钠缓冲溶液。称取 9 . 535 g Na3 BO 3 10 H 2O, 并用水定容至 250 mL, 得到 p H为 9 . 0的 H 3 BO3 N a3 BO3 缓冲溶液。用乙腈配制 0 . 1 m o l/L DNFB 溶液。西洋参采自吉林省靖宇县。 2 . 2 实验方法 2 . 2 . 1 标准溶液的配制 分别称取适量的 18种氨基酸的标准品, 用 0 . 05 mo l /L HC l定容于 10 mL 容 量瓶中。得到浓度分别为 4 . 261 g /L A sp 、 3 . 881 g /L G lu 、 1. 954 g /L Ser 、 5 . 157 g /L H is 、 1 . 420 g /L G ly 、 3 . 875 g /L P ro 、 2 . 592 g /L A la 、 1 . 758 g /L Va 、 l3 . 356 g /L M et 、 1 . 950 g /L Cys 、 1 . 936 g /L Ile 、 2 . 669 g /L L eu 、 1 . 988 g /L T rp 、 2 . 290 g /L Phe 、 2 . 899 g /L Lys、 1 . 902 g /L T yr的混合标准溶液。 2 . 2 . 2 微波提取和水解 准确称取 0 . 5 g 西洋参根粉末 ( 过 0 . 45 mm 孔径 ) 于微波罐中, 并加入 20 mL 含 1% 苯酚 (作为一种抗氧化剂可防止蛋氨酸等氨基酸氧化 ) 的 6 m ol /L H C l溶液。通氮气除氧后 , 旋 紧盖子 , 放入微波炉中。控制时间和温度进行提取和水解。水解完毕后, 冷却至室温, 打开罐, 抽滤, 旋转蒸发浓缩样品, 并用 0. 05 m o l /L HC l定容至 5 mL。用 0 . 45 m 滤膜过滤。 2 . 2 . 3 加热提取 和水解 准确称 取 0 . 5 g 西 洋参根粉 末于微 波罐中 , 加 入 20 m L 含 1 % 苯 酚的 6 m ol /L H C l溶液。通氮气除氧后, 旋紧盖子, 放入 110 烘箱水解 24 h 。水解完毕后 , 冷却至室温, 打开罐 , 抽滤, 旋转蒸发浓缩样品, 并用 0 . 05 m o l/L HC l定容至 5 mL。用 0 . 45 m 滤膜过滤。 2 . 2 . 4 微波衍生 取经过滤膜的样品 50 L, 加入 650 L H 3 BO 3 Na3 BO3 缓冲溶液。最后加入 150 L 0 . 1 m o l/L DNFB 衍生溶液, 在固定微波功率 260W, 衍生时间 50 s的条件下放入微波中衍生。衍生后 直接进样。 2 . 2 . 5 色谱 条件 P revail C18 色 谱柱 ( 250 mm 4 . 6 mm I . D. , 5 m ), 柱 温: 40 ; 流 速: 1 . 0 mL /m in ; 进样体积 20 L。检测波长 : 360 n m。流动相为乙腈 ( A ) 和乙酸 乙酸钠缓冲溶液 ( B ), 按以下梯度洗脱 , 0 ~ 5 m in , 19 % ~ 12 % A; 5 ~ 15 m in , 12 % ~ 18 % A; 15 ~ 20 m in , 18 % ~ 28 % A; 20~ 39 m in , 28 % A; 39~ 46 m in , 28 % ~ 60 % A; 46~ 50 m in, 60 % A。
行测定。对微波衍生条件和微波 水解的条件进行了优化。研究结果表明 , 190 酸的产率与传统加热水解 ( 110
氨基酸在微波衍生时间大于 20 s 时, 衍生反应基本完全 ; 而传统 DNFB 衍生需在 60
衍生法明显缩短了氨基酸分析时间。用高效 液相色谱法对西洋参根中的氨基酸进行了测定 , 结 果令人满意。 关键词 微波水解 , 微波衍生 , 氨 基酸 , 高效液相色谱 , 西洋参 , 2, 4 二硝基氟 苯
第 5期
渠琛玲等 : 微波水解衍生高效液相色谱法测定西洋参中的氨基酸
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3 . 1 . 2 微波衍生时间
固定氨基酸与衍生剂的摩尔比为 1 5 , 微波功率为 260 W。改变衍生时间。由
图 2 可见, 20 s即衍生完全。 3 . 1 . 3 微波衍生功率 固定氨基酸与衍生剂的摩 尔比为 1 5 , 衍生时间 30 s。考察了微波功率的影 响。结果表明, 130 W 即可保证衍生完全。 综上可 知, 固 定氨 基酸 与衍 生剂 的 摩尔 比为 1 5 , 衍生功率为 130 W 时 , 30 s 即可以完成反应; 固定氨基酸与衍生剂的摩尔比为 1 5, 衍生功率为 260W 时 , 20 s完成衍生反应。在后续定量实验中, 为了保证氨基酸衍生完全 , 衍生功率选取 260W, 衍 生时间 50 s 。 3 . 2 标准曲线的绘制 取不同浓度的氨基酸混标
2 实验部分
2 . 1 仪器与试剂 1100高效液相色谱仪 ( 美国 A ilgent公司 ) , WR C 微波样品处理系统 ( 北京美诚科技有限公司 ); H e id olph 旋转蒸发仪。 18种氨基酸 ( 纯度均为 99 % ) , 天冬氨酸 ( A sp)、 谷氨酸 ( G lu) 、 丝氨酸 ( Ser)、 组 氨酸 ( H is) 、 精氨酸 ( Arg)、 苏氨酸 ( T hr)、 甘氨酸 ( G ly)、 脯氨酸 ( P ro) 、 丙氨酸 ( A la) 、 缬氨酸 ( Val)、 蛋氨酸 (M et)、 胱氨酸 ( Cys)、 异亮氨酸 ( Ile)、 亮氨酸 ( L eu)、 色氨酸 ( T rp)、 苯丙氨酸 ( Phe)、 赖氨酸 ( L ys)和酪氨酸
[ 6]
、
采用正交
实验方法以 H 2 SO 4 为水解介质, 选用微波功率、 H 2 SO4 浓度、 水解时间作为 3 个考察因素研究蛋白质的 水解。文献 [ 7]综述了不同介质的蛋白质微波水解以及氨基酸的损失情况。 柱前衍生高效液相色谱法测定氨基酸由于具有分析时间较短、 灵敏度高等优点, 近年来被越来越 多地用于氨基酸分析 , 而衍生剂的选择是这种方法的关键。常用的衍生剂有邻苯二甲醛 ( OPA ) 、 萘 2 , 3 二甲醛 ( NDA )、 9 芴甲基氯甲酸酯 ( FMOC )、 异硫氰酸苯酯 ( P ITC) 、 丹酰氯 ( Dansyl C l) 、 4 , 4 二甲胺基 [ 8~ 12 ] 偶氮苯 4 磺酰氯 ( DABS C l)和 6 氨基奎啉 N 羟基琥珀酰亚胺碳酸盐 ( AQC )等 。不同的衍生剂都 有各自的不足, 如 OPA 不能与仲氨酸反应 , FMOC 需用戊烷萃取衍生完成后过剩的 FMOC, 使操作繁 琐。而 2, 4 二硝基氟苯 ( DNFB) 作为衍生 剂具有成本低、 衍生产物 稳定、 操作简便 等优点 , 常 规的 DNFB 衍生是在 60 水浴加热的条件下进行 1 h 。 [ 13 ] 微波衍生气相色谱分析近年来逐渐增多。朱丹等 用动态液相微萃取 微波衍生化 气相色谱 选 择离子检测 质谱法测定了毛发中的苯丙胺类毒品。而侯俊红等 波衍生 ) 进行了分析。刘冬娴等 分析却少见报道。