高效液相色谱法在样品分析中的应用

高效液相色谱法在样品分析中的应用

摘要：本文介绍了高效液相色谱法的基本原理和按照分离机制的不同进行分类。对于在生化医药方面，环境监测方面，食品分析方面的应用做了简要介绍。最后对其特点做了总结，并对其应用前景展望。

关键词：高效液相色谱法应用特点前景

一前言：

高效液相色谱(HPLC)是在经典液相色谱法和气相色谱法的基础上,发展起来的一种新型分离分析技术。高效液相色谱是色谱法的一个重要分支，以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析。它采用新型高压输液泵、高灵敏度检测器和高效微粒固定相及各种智能化软件,比经典液相色谱柱效高、分离能力高且速度快。近年来,HPLC 技术发展较快,已在环境监测中得到广泛应用,特别适用于分子量大、挥发性低、热稳定性差的有机污染物的分离和分析。

二 HPLC的分类：

HPLC按照分离机制可分为以下4 种

1 液-液分配色谱法（liquid-liquid chromatography)

LLC 根据流动相和固定相的极性不同又可分为：①正向LLC，流动相极性小于固定相极性，极性小的组分先流出色谱柱，适合极性物质分离；②反向LLC，流动相极性大于固定相极性，极性大的组分先流出色谱柱，适合非极性物质分离。理论上不相溶的固定相和流动相，实际上仍有少量微量固定相溶解，并且机械冲击作用也会导致固定相流失，使色谱柱的分离效率和选择性降低, 目前主要采用化学键合固定相(即通过固定相的有机基团与载体表面的游离羟基发生化学反应，从而使固定相与载体键合起来)来克服这一问题。

2 液-固吸附色谱法（liquid-solid adsorption chromatography）

在吸附色谱中，组分分子和流动相分子对吸附剂（固定相）表面产生竞争性吸附，利用组分和固定相吸附力的不同而分离。

3 离子交换色谱法(ion exchange chromatography)

离子交换剂上可解离的离子与流动相中组分离子进行可逆的离子交换，利用试样

中不同组分与离子交换剂具有不同的亲和力而将它们分离的方法。凡是在溶剂中能够电离的物质通常都可以用离子交换色谱法来进行分离。

4 空间排阻色谱法（凝胶色谱法）

空间排阻色谱法以凝胶为固定相。它类似于分子筛的作用，但凝胶的孔径比分子筛要大得多，一般为数纳米到数百纳米。溶质在两相之间不是靠其相互作用力的不同来进行分离，而是按分子大小进行分离。分离只与凝胶的孔径分布和溶质的流动力学体积或分子大小有关。试样进入色谱柱后，随流动相在凝胶外部间隙以及孔穴旁流过。在试样中一些太大的分子不能进入凝胶孔而受到排阻，因此就直接通过柱子，首先在色谱图上出现，一些很小的分子可以进入所有凝胶孔并渗透到颗粒中，这些组分在色谱柱上的保留值最大，在色谱图上最后出现。

三应用

1 HPLC在生化医药方面的应用[1]

目前,HPLC技术已成为化学家、生物学家和医药学家认识世界的不可缺少的工具,它的应用已成为生物、医药学等领域中的一个重要组成部分。究其原因,在于分析分离过程中HPLC技术具有：

○1分离检测过程温和,不破坏样品;

○2对样品的回收能够定量进行,而且操作简单(这对需要提纯或制备具有一定纯度的物质的生化制药方面特别有利);

○3分离过程容易控制,通过调整流动相同样可达到分离目的等特点。

HPLC技术在生化制药方面的应用,主要体现在以下几个方面。

（1）用于生化药物的分析

HPLC在分离过程中不破坏样品的特点,使之特别适合于对高沸点、大分子、强极性和热稳定性差的生化药物的分析,尤其在对具有生物活性物质的分析上,具有特殊的能力。此外,对于某些极性化合物药物,如有机酸、有机碱等,使用液相色谱分析亦较为方便。

（2）用于生化药物的分离提纯[2]

HPLC的使用,引发了生化医药方面的一场革命。这一方面表现在分子生物领

域中对基因重整而得到的新基因的分离和纯化,单克隆抗体的纯化等方面;

另一方面,在将基因工程产品工业化生产时,使用HPLC将能有效地将产品从

发酵液中提取出来,从而得到纯度足够高的、对人体无害的蛋白质药物和疫苗产品。目前,除聚合物外,大约80%的药物都能用HPLC进行分离纯化,其中尤以生化药品为多。对于一般手段较难分离的异构体药物及亲脂性很强的药物,采用硅胶色谱柱即可达到分离的目的.

(3)用于临床的快速检监测[3]

临床分析要求“短平快”,特别是抢救过程中,样品的检测要求在最短时间内完成以尽可能地挽救生命。对此, HPLC具有不可替代的优势。如在对氨基酸样品的分析上,50年代要经过离子交换等分离步骤,时间较长。如今,虽有了全自动氨基酸分析仪,但分析一个样品仍需2-6h,这个时间对临床来说仍然

过长。而HPLC进行这样的分析,所需时间大为缩短。

2 HPLC在环境监测上的应用

HPLC在环境监测中运用广泛，常用于对大气，土壤和水资源中的污染物进行测定分析，HPLC 检测结果准确可靠，灵敏度、分辨率高，重现性好，能同时分离多种污染物，目前，HPLC 已成为环境中常规监测和系统分析方法的重要台柱。(1)HPLC 在大气环境监测中的应用[4]

采用HPLC 对空气和废气中10 种醛酮污染物进行测定，发现回收率为90%-110%，最低检出限为1-5ng，线性工作范围为5-300ng，可同时测定空气和车间空气中的10 种酮和醛类污染物。测定空气中的甲醛含量，方法检出限为8×l0-6g/L,平均回收率为92.5%，平均相对标准偏差为4.8%，该方法具有灵敏度高，无干扰，试剂易保存，检验结果重复性好等优点。

(2)HPLC 在水环境监测中的应用

水的污染不仅影响人民生活，破坏生态，直接危害人的健康，而且影响工业生产、增大设备腐蚀、影响产品质量，甚至使生产不能进行下去。因此必须采取各种方法对水体质量进行监测，及时采取措施来治理被污染的水源，以免有害物质通过饮水和食物链进入人体。HPLC 检测结果准确可靠，灵敏度高，稳定性好，在水资源监测中运用广泛，很多学者对HPLC 用于水资源监测做了大量研究。

(3)HPLC 在土壤环境监测中的应用