阪崎肠杆菌
阪崎肠杆菌检验技术
生态分类
一、阪崎肠杆菌概况
阪崎肠杆菌属肠杆菌科，是人和动物肠道中寄生的一种革 兰阴性无芽胞杆菌。是肠道正常菌群的一种，在一定条件 下可引起人和动物致病。1980年以前命名为黄色阴沟肠 杆菌，1980年更名为阪崎肠杆菌。
一、阪崎肠杆菌概况
生态分布 家庭、温泉、鼠、苍蝇、植物根围、沉积物，沼泽地、土壤、食品等均有检出阪 崎肠杆菌的报导。有报导推测，昆虫可能是阪崎肠杆菌的环境宿主。 婴儿配方粉的污染： 内在污染：--由加工环境中微生物的存在；加工装置内表面微生物的存在；热处理 后，与干燥基粉混合的加入成分中存在的微生物造成。 外源性污染：--受阪崎肠杆菌污染的配方粉或调制好的配方奶在较高温度下存放， 食用前不加热，或加热不彻底，喂食时间较长等都可导致阪崎肠杆菌有机会生长繁 殖，增加患病的危险性。
三、阪崎肠杆菌菌定量检测
1g(mL)×3
取样量 10g(mL)×3
100g(mL)×3
BPW 1：10 稀释
mLST-Vm
DFI、TSA
生化鉴定
报告 （MPN值）
操作规程
前增菌 选择性增菌 显色培养基 验证试验 结果报告
三、阪崎肠杆菌菌定量检测
各100ml（g)
各10ml（g)
各900ml（g) 各移1ml
900 ml BPW
样品
100mL（g） 溶解 预热
44℃
36±1℃ 18h±2h
选择性增菌 44±0.5℃
24h±2h
10mL mLST-Vm肉汤
挑取蓝绿色菌落
操作规程 API20E鉴定系统
二、阪崎肠杆菌菌定性检测
TSA平板上直接挑取黄色菌 落进行鉴定
结果鉴定
二、阪崎肠杆菌菌定性检测
阪崎肠杆菌_ppt课件
※氧化酶阴性
※过氧化氢酶阳性，并生成黄色菌落
营养成分表
样品
美赞臣 安婴儿婴儿配方奶粉
罐装
配料表： 100%进口奶源配料：乳糖、精炼植物油、浓缩 乳清蛋白、脱脂奶粉、低聚半乳糖（GOS）、 花生四烯酸（ARA）和二十二碳六烯酸（DHA） （来源于单细胞油）、矿物质（碳酸钙、氯化钙、 柠檬酸钾、氯化钾、氯化镁、硫酸亚铁、硫酸锌、 硫酸铜、硫酸锰、亚硒酸钠、碘化钾）、玉米糖 浆固体、维生素（维生素A、维生素D3、维生素 E、维生素C、维生素B1、维生素B2、维生素B6、 维生素B12、维生素K1、胆碱、肌醇、烟酰胺、 叶酸、泛酸、生物素）、牛磺酸、核苷酸、食品 添加剂：磷脂、抗坏血酸棕榈酸酯、氢氧化钙、 碳酸氢钾。
44 ℃±0.5 ℃ 培养24h±2h 。
10 mL mLST-Vm 肉汤
36 ℃±1 ℃培 养24 h±2 h。
各取增菌培养物1 环，分 别划线接种于两个阪崎肠 杆菌显色培养基平板
①前增菌和 增菌
②分离
挑取1 个～5 个可疑菌落，划 线接种于TSA 平板。 25 ℃±1 ℃培养48 h±4 h。
③鉴定
阪崎肠杆菌显色培养基DFI
微生物
菌落颜色
• 阪崎肠杆菌 • 大肠杆菌 • 金黄色葡萄球菌
蓝绿色 无色菌落 被抑制不生长
培养基和试剂
• 4 、胰蛋白胨大豆琼脂（trypticase soy agar， TSA）：见附录A 中A.3。
• 5 、生化鉴定试剂盒。 • 6、 氧化酶试剂：见附录A 中A.4。 • 7、 L-赖氨酸脱羧酶培养基：见附录A 中A.5。 • 8 、L-鸟氨酸脱羧酶培养基：见附录A 中A.6。 • 9 、L-精氨酸双水解酶培养基：见附录A 中A.7
阪崎肠杆菌的研究进展
龙道崎、邹妍、关郁芳、 雷丹丹、边伟、胡鹏
目录
概述
生物学特性
检测方法 致病性 预防和控制
阪崎肠杆菌概述
阪崎肠杆菌(Enterobacter sakazakii)属肠杆菌科， 是人和动物肠道内寄生的一种周生鞭毛、能运动、 无芽孢的革兰氏阴性菌，一直以来被称为黄色阴沟 肠杆菌 (Enterobacter cloacae)，于1980年以日 本细菌学家 Riichi Sakazakii的名字命名。 阪崎肠杆菌能引起严重的新生儿脑膜炎、小肠结肠 炎和败血症，近年来受到了研究者的广泛关注
阪崎肠杆菌的毒力因子可能是一类肠毒素样 化合物。在组织培养过程中一些菌株产生细 胞毒效应，且菌株间的毒力作用有差异。 细菌内毒素（脂多糖），是构成革兰氏阴性 细菌细胞外壁的主要成分。具有热稳定性， 能增加小肠上皮细胞通透性，促使细菌侵入 肠壁中而致病。
Байду номын сангаас防与控制
预防 坚持母乳喂养 选择检查合格的奶粉 开水冲调婴幼儿配方食品，再次食用前应重新加热。 控制 制定婴幼儿配方奶粉中阪崎肠杆菌微生物标准 制定加工、使用和操作婴幼儿配方食品的导则 制定有效的环境监测计划 建立实验室监测网络，对阪崎肠杆菌的来源、传播途径 等进行调查研究
阪崎肠杆菌的致病性
阪崎肠杆菌是存在自然环境中的一种
“条件致病菌”，由其引发的危害人群 主要是婴儿以及早产儿。偶尔还可引起 成人局部感染。
阪崎肠杆菌能引起严重的新生儿脑膜炎、
菌血症和坏死性小肠结肠炎，并可能遗 留严重的神经系统后遗症，死亡率20 ％～50％。
阪崎杆菌的致病性
致病机制研究不多，尚不清楚。 目前所知阪崎肠杆菌致病性可能与肠毒素和内毒 素有关
阪崎肠杆菌检测标准
阪崎肠杆菌检测标准1. 引言阪崎肠杆菌（Hafnia alvei）是一种革兰氏阴性菌，属于肠杆菌科。
它在自然环境中广泛存在，也可以在人和动物的消化道内找到。
阪崎肠杆菌可以对人类和动物造成感染，引起各种疾病，如泌尿系统感染、呼吸道感染和胃肠道感染等。
为确保食品和饮用水的安全，阪崎肠杆菌的检测标准十分重要。
2. 检测方法2.1 阪崎肠杆菌的培养方法阪崎肠杆菌可以在一般细菌培养基上生长，常用的培养基包括MacConkey琼脂培养基和Eosin Methylene Blue（EMB）琼脂培养基。
培养时一般在37°C下孵育24-48小时。
2.2 阪崎肠杆菌的生化检测阪崎肠杆菌可以通过一系列的生化反应进行检测和鉴定。
常用的生化试验包括氧化/发酵葡萄糖试验（O/F试验）和酮糖酸盐（Voges-Proskauer）试验等。
2.3 阪崎肠杆菌的PCR检测PCR（聚合酶链式反应）是一种常用的分子生物学方法，可以快速、准确地检测阪崎肠杆菌。
通过特定的引物在PCR反应中扩增阪崎肠杆菌的DNA片段，然后通过凝胶电泳进行检测和鉴定。
3. 检测标准3.1 食品中阪崎肠杆菌的检测标准根据国家食品安全标准，食品中阪崎肠杆菌的检测标准如下： - 生肉制品：阪崎肠杆菌在每克样品中不得超过10 CFU； - 加工食品：阪崎肠杆菌在每克样品中不得超过100 CFU； - 饮用水：阪崎肠杆菌在每100毫升样品中不得检出。
3.2 环境中阪崎肠杆菌的检测标准根据环境保护标准，阪崎肠杆菌的检测标准如下： - 水质：阪崎肠杆菌在每升水样中不得超过100 CFU； - 空气：阪崎肠杆菌在每立方米空气中不得超过100 CFU； - 土壤：阪崎肠杆菌在每克土壤样品中不得超过1000 CFU。
4. 检测流程4.1 样品采集从食品、饮用水或环境样品中采集足够数量的样品。
使用无菌容器收集，并确保样品处于最佳的保存条件。
4.2 样品处理将采集的样品经过适当的处理，在无菌条件下进行前处理，如制备悬浮液或稀释样品。
阪崎肠杆菌显色培养基原理
阪崎肠杆菌显色培养基原理
阪崎肠杆菌显色培养基是一种针对阪崎肠杆菌（Enterobacter sakazakii）的检测工具，通过显色原理，可快速、准确地检测食品中的阪崎肠杆菌。
其原理主要包括以下几个方面：
1.选择性生长：阪崎肠杆菌显色培养基中的成分专门针对阪崎肠杆菌的生长需求，为其提供适宜的营养环境。
同时，培养基中还含有抑制其他微生物生长的成分，从而确保只有阪崎肠杆菌能够在培养基上生长。
2.酶反应显色：阪崎肠杆菌在生长过程中，能产生特定酶，这些酶与培养基中的显色底物发生反应，使菌落呈现出特定的颜色。
阪崎肠杆菌显色培养基中的显色底物是由产色因子和微生物部分可代谢物质组成，在特异性酶作用下，游离出产色因子使菌落显示一定颜色。
3.菌落显色区分：在适宜的培养条件下，阪崎肠杆菌生长出的菌落呈现蓝-绿色，而其他微生物生长的菌落则为无色或黄色。
通过观察菌落颜色，可以快速区分目标菌和非目标菌。
4.生化试验验证：对于显色培养基上呈现典型蓝-绿色菌落的样品，还需进行生化试验以进一步确认阪崎肠杆菌的identity。
常见的生化试验包括氧化酶试验、气泡产生试验等。
5.质量控制：为了确保阪崎肠杆菌显色培养基的可靠性和准确性，需进行质量控制。
主要包括观察培养基的外观、菌落颜色以及生长情况等，确保培养基符合相关标准和要求。
总之，阪崎肠杆菌显色培养基通过选择性生长、酶反应显色、菌落显色区分、生化试验验证和质量控制等原理，实现了对食品中阪崎肠杆菌的快速、准确检测。
在实际应用中，实验室人员可以根据需求选择合适的显色培养基，并按照操作步骤进行检测，以保障食品的安全性。
长春阪崎肠杆菌科鉴定流程
长春阪崎肠杆菌科鉴定流程
阪崎肠杆菌属于肠杆菌科中的一种常见细菌，其主要存在于人和动物的肠道中。
该细菌可引起多种疾病，如腹泻、肺炎、败血症等。
因此，在医学诊断和食品安全监管方面，对阪崎肠杆菌的鉴定十分重要。
下面是长春阪崎肠杆菌科鉴定的流程：
1.搜集样本
对于可能污染阪崎肠杆菌的样品，如肉类、蔬菜、水果、动物粪便等，进行采集，并妥善保存。
2.培养
将样品进行培养，常用的培养基为MacConkey培养基或兰伯特培养基。
在37摄氏度下，进行18-24小时的培养，以使菌落生长到足
够数量。
3.鉴定
（1）形态特征：观察菌落的形态，如颜色、形状、大小等，再
观察细菌的形态、大小和运动性等。
（2）生化特性：采用一系列生化试验，如氧化酶试验、卡氏试验、甲烷酸盐发酵试验等，以区分阪崎肠杆菌和其他肠杆菌。
（3）免疫学鉴定：采用免疫学方法，如酶联免疫吸附试验(ELISA)、荧光抗体法等，检测阪崎肠杆菌的抗原。
以上是长春阪崎肠杆菌科鉴定的流程。
在鉴定过程中，需要严格控制卫生条件，避免交叉污染。
鉴定结果的准确性将影响到后续的治
疗和防控措施。
阪崎肠杆菌污染途径
• 检验流程: ①接种缓冲蛋白胨水 : • ②mLST增菌24h • ③接种DFI培养基,37℃，培养 24h • ④接种API20NE
1.3 分离方法 DFI显色培养基上阪崎肠杆菌的菌落特征 显色培养基上阪崎肠杆菌的菌落特征 显色培养基上
蓝绿色菌落
1.3 分离方法
E. sakazakii 的API 20E结果 结果
• 样品修复培养（前增菌）： 样品修复培养（前增菌）：无菌称取100g乳粉加 ）： 入500ml预热45℃BP中，混匀，经36℃±1℃培 养18-24h。 • 样品肠道增菌培养 样品肠道增菌培养：移取10ml 加入90mlEE肉 汤中，于36℃±1℃培养18-24h。 • 样品分离培养：取EE增菌肉汤培养物1环，分别 样品分离培养： 划线接种EMB、MacConKey、 SorbitolMacConKey琼脂平板各1块，置 36℃±1℃培养18-24h。观察3种平板上的菌落 形态及不同的生物学特性反应及其差异比较。
DFI培养基存在的问题 培养基存在的问题
更快的检测方法? 更快的检测方法
• PCR • Q-PCR
DFI培养基存在的问题 培养基存在的问题
荧光PCR结果 结果 荧光
1.4其他肠杆菌属的检验 其他肠杆菌属的检验
• E-M-S法 • 所需培养基： • EMB • MacConKey • SorbitolMacConKey
1.3 分离方法 美国FDA 法 – 2002年 美国 年
• 对加拿大法进行了修改:
– 从10毫升接种到 毫升肠杆菌增菌肉汤（EE）。 毫升接种到90毫升肠杆菌增菌肉汤 毫升接种到 毫升肠杆菌增菌肉汤（ ）。 孵育过夜而不是直接涂布 平板. 在36oC孵育过夜而不是直接涂布 VRBG 平板 孵育过夜 – 可疑菌落接种 可疑菌落接种TSA 并在 oC 培养 48-72 hours. 并在25 – 只有产黄色色素的菌落进行 API 20E system实验 实验. 实验
各种食源性致病菌的危害
1、阪崎肠杆菌：阪崎肠杆菌是奶粉（乳）制品中新发现的一种致病菌。
研究表明婴幼儿配方奶粉是当前发现致婴幼儿、早产儿脑膜炎、败血症和坏死性结肠炎的主要感染渠道,在某些情况下，由阪崎肠杆菌引发疾病而导致的死亡率可达40％～80%。
2、沙门氏菌：我国食源性疾病中细菌性食物中毒病例最为常见，其中由沙门氏菌引起的中毒病例占70％-80％，而以肉、蛋、奶等畜产品被沙门氏菌污染所引起的中毒可占90％以上。
该菌对人致病，引起肠伤寒，肠胃炎和败血症，也可能传染人类以外的其他多种动物。
因此，目前对食品质量安全监控进行CMA（中国计量认证/认可）认证检测时，沙门氏菌的检测已成为了必检的卫生指标测定项目之一。
3、志贺氏菌：志贺氏菌属即通称的痢疾杆菌，细菌性痢疾是最常见的肠道传染病,夏秋两季患者最多。
传染源主要为病人和带菌者,通过污染了痢疾杆菌的食物、饮水等经口感染。
志贺氏菌所致菌痢的病情较重，志贺氏菌侵入肠粘膜组织并释放内毒素引起症状。
症状为剧烈腹痛、腹泻（水样便，可带血和粘液）、发热、里急后重显著。
严重者出现痉挛和休克。
4、金黄色葡萄球菌：金黄色葡萄球菌是人类化脓感染中最常见的病原菌，可引起局部化脓感染，也可引起肺炎、伪膜性肠炎、心包炎等，甚至败血症、脓毒症等全身感染。
近年来，美国疾病控制中心报告，由金黄色葡萄球菌引起的感染占第二位，仅次于大肠杆菌。
金黄色葡萄球菌引起的中毒食品种类多，如奶、肉、蛋、鱼及其制品。
此外，剩饭、油煎蛋、糯米糕及凉粉等引起的中毒事件也有报道。
5、副溶血弧菌：副溶血弧菌对人和动物均有较强的毒力，其致病物质溶血素、溶血毒，具有溶血活性、肠毒素和致死作用。
副溶血性弧菌食物中毒也称嗜盐菌食物中毒，是进食含有该菌的食物所致，主要来自海产品或盐腌渍品，常见者为蟹类、乌贼、海蜇、鱼、黄泥螺等，其次为蛋品、肉类或蔬菜。
临床上以急性起病、腹痛、呕吐、腹泻及水样便为主要症状。
主要病理变化为空肠及回肠有轻度糜烂，胃粘膜炎、内脏(肝、脾、肺)淤血等。
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• 婴幼儿脑膜炎：未足月出生的新生儿占75％。主要变现为 发热、面色苍白，有抽搐或颤抖，张力亢进，囱门隆出， 无颈项强直。合并有菌血症者占5／8，坏死性小肠结肠炎 占2／8，死亡率高达75％。阪崎肠杆菌引起的脑膜炎常引 起脑梗塞、脑脓肿、囊肿形成和脑室炎等并发症,并且可 引起神经系统后遗症或迅速死亡。 。 • 新生儿菌血症:低热，寒战，白细胞偏低，血液培养分离 可得到阪崎肠杆菌 ，多数症状较轻，如出现严重的脓毒 血症，死亡率可达36％。 • 新生儿坏死性小肠结肠炎(NEC):多发生于未足月出生体重 较轻的婴幼儿 。 • 成人感染 ：阪崎肠杆菌引起成人菌血症或局部感染。
所致疾病
阪崎肠杆菌可以对任何年龄段的人群引起疾 病，但主要是婴幼儿，特别是1岁以下和出生28 天以内的婴儿，早产儿、低体重儿或免疫缺陷的 婴幼为他们主要依靠奶粉喂养， 比其他婴幼儿更容易感染。感染主要引起脑膜炎、 脓血症、坏死性小肠结肠炎,阪崎肠杆菌引起的脑 膜炎常引起脑梗塞、脑脓肿、囊肿形成和脑室炎 等并发症,并且可引起神经系统后遗症或迅速死亡。
生物学性状
• 形态特征:革兰阴性粗短杆菌细胞大小为 ( 0.6~1.1 )×( 1.2~3.0 )µm，有周身菌毛,无芽胞,有动力 。 • 培养:兼性厌氧,营养要求不高,能在营养琼脂、血平板、麦 康凯等多种培养基上生长。在TSA和BHI生长为 1.5~2.5mm的黄色菌落 ，在VRBG能产生紫红色菌落，而 在TSA上加xα-GLC将出现绿色菌落，氧化酶阴性，触酶 反应阳性。 • 抵抗力：耐高温、干燥、渗透压 阪崎肠杆菌比其他肠杆 菌耐高温。耐酸性并对清洁剂和杀菌剂有较强抵抗力 。 •
我国对阪崎肠杆菌方面的管理规定
• 《关于对进口乳制品进行阪崎肠杆菌检测的通知》(国质 检食函[2005]690号)； • 《关于加强进口乳制品检验检疫监督管理工作的通知》 国质检食函[2007]298号）； • 《婴幼儿配方乳粉生产许可证审查细则》(2006、2008 版)
中国检验检疫科学研究院食品安全研究所
预防
婴儿出生的前6个月，母乳喂养最有助于婴儿的 生长和健康。但是为了保证婴儿发育需要的营养， 必须科学地补充喂养适宜的母乳代用品，如符合 食品法典委员会(CAC)标准的婴儿配方食品。应 对不能进行母乳喂养的婴幼儿，特别是高危人群 提出警示：配方乳粉并不是灭菌产品，可能被病 原体污染并引起疾病。 • 用商业无菌液体或开水冲调配方食品，喂食婴儿 剩余的液体调配食品应放置冰箱保存，并在食用 前再加热。
案例
• 美国印第安那州1名由阪崎肠杆菌感染引起的严重 的新生儿脑膜炎病例,在针对该患儿的病例研究中, 研究人员确定了阪崎肠杆菌的致病性。被阪崎肠 杆菌感染的患儿原本是健康的5 周龄婴儿,入院时, 该患儿易激惹，但无发热症状,无尿道、胃肠道或 中枢神经系统先天发育不良症状。患儿用氨比西 林和庆大霉素治疗21 d 后出院,2 个月后,患儿头围 迅速增大,必须实行引流手术,患儿健康恢复缓慢并 伴有严重的神经系统后遗症。
阪崎肠杆菌
20094291
• 2008年8月至11月，国家质检总局公布了进境的 852批不合格食品、化妆品名单。其中，味全食 品的三类配方奶粉被检验出含有致病菌阪崎肠杆 菌。 • 阜阳劣质奶粉事件发生后，从87份阜阳劣质奶粉 样品中，检测到11份阪崎肠杆菌阳性样品，污染 阳性率为12.6%。 • 2004年世界粮农组织和世界卫生组织经过风险性 评估将阪崎肠杆菌和沙门氏菌共同列为婴幼儿配 方奶粉A类致病菌，在不同地区，婴幼儿配方奶 粉中阪崎肠杆菌检出率在2至22.7％之间。
主要的生化反应特性
致病物质
• 阪崎肠杆菌的毒力因子和致病性现在还不太清楚，但已发 现有些阪崎肠杆菌可能产生一种毒力因子-类肠毒素样化 合物。而且，组织培养也发现一些菌株可产生细胞毒效应。 • 最近，TOWNSEND 等发现婴儿配方奶粉中含有细菌脂多 糖—内毒素(LPS )，具有热稳定性，能增加小肠上皮细胞 通透性，促使细菌侵入肠壁中而致病。 • MANGE等通过体外组织细胞培养实验观察到阪崎肠杆菌 对人类上皮细胞和脑微血管内皮细胞有吸附粘连特性，并 形成丛生，表面形成生物保护膜。 • 由于阪崎肠杆菌细胞内含有大量的海藻糖酶，累积有大量 的海藻糖，使得阪崎肠杆菌比沙门菌和其他肠杆菌更耐受 渗透压和干燥。因阪崎肠杆菌这些特性，使得奶粉生产时 不易被杀灭，储存时易生存下来。
发现过程
• 1976 年Steigerwalt 等发现肠杆菌属菌株可分为与“黄色 素存在或缺失”相关的两种不同的DNA 杂交群。1977 年 Brenner 等发现可根据D - 山梨醇产酸和延迟产生脱氧核 糖核酸酶(Deoxyribonuclease ,DNase) 区分产色素和不产 色素的菌株。1980 年Farmer 等建议对产黄色素的阴沟肠 杆菌重新分类,在同一篇文献中Farmer 等指出通过DNA DNA杂交他们发现阪崎肠杆菌之间DNA 一致性可达83 %～89 % ,而阪崎肠杆菌与阴沟肠杆菌的DNA 共有序列只 有31 %～49 %。 • 该菌感染引起的死亡率高达50 %以上，现在还不能确定 阪崎肠杆菌的宿主和传播模型,但在一些新生儿阪崎肠杆 菌感染事件的调查中发现婴儿配方粉是主要的感染渠道。
微生物学检查
• 不利用山梨醇 • 36°C下培养7d，DNA酶为阳性 • 根据阪崎肠杆菌中寡- 1, 6 - 葡萄 糖苷酶基因设计引物建立PCR方 法,并进行PCR反应的灵敏度、特 异性实验以及模拟实际样品的最 低检出限测定
治疗
• 一般说来,与肠杆菌属其它细菌相比,阪崎肠杆菌对 常用的抗菌药更敏感。 • 阪崎肠杆菌对先锋霉素Ⅰ和新诺明之外的所有试 验用药敏感,且该菌是唯一对氨比西林敏感的肠杆 , 菌。 • 虽然阪崎肠杆菌的最佳抗生素治疗方法尚未确定, 但在大多数早期报告的病例中都是应用氨比西林 和庆大霉素联合疗法。