阪崎肠杆菌检验培训课件
食品微生物之检验方法-阪崎肠杆菌之检验

附件食品微生物之檢驗方法-阪崎腸桿菌之檢驗1 適用範圍〆本方法適用於一般食品及奶粉中阪崎腸桿菌之檢驗。
2 檢驗方法〆2.1 工作環境〆工作平台須寬敞、潔淨、光線良好,操作平台光度為100呎燭光以上,密閉室內換氣良好,儘可能沒有灰塵及流動空氣。
每15分鐘落菌數不得超過15 CFU/培養皿。
2.2 器具及材料〆2.2.1 乾熱滅菌器。
2.2.2 高壓滅菌釜。
2.2.3 攪拌均質器(Blender)或鐵胃(Stomacher)〆適用於無菌操作者。
2.2.4 天平〆可稱量到2000 g者,靈敏度為0.1 g々可稱量到120 g者,靈敏度為1 mg。
2.2.5 冰箱〆能維持5 ±3℃者。
2.2.6 吸管或吸管尖〆已滅菌,1 mL吸管應有0.01 mL之刻度々5 mL及10 mL吸管應有0.1 mL之刻度。
2.2.7 吸管輔助器(Pipette aid)或微量分注器。
2.2.8 稀釋瓶〆160 mL,玻璃、聚乙烯(polyethylene)、鐵弗龍(Teflon)或其他能耐121℃濕熱滅菌20分鐘以上之塑膠材質,附螺旋蓋。
2.2.9 培養皿〆已滅菌,內徑約9 cm,深度約15 mm,底皿之內外面應平坦,無氣泡、刮傷或其他缺點。
2.2.10 增菌用容器〆附螺旋蓋之125 mL、250 mL、2 L三角錐瓶或廣口瓶々玻璃、聚乙烯、鐵弗龍或其他能耐121℃濕熱滅菌20分鐘以上之塑膠材質。
2.2.11 pH測定儀。
2.2.12 培養箱〆能維持內部溫度在±1℃以內者。
2.2.13 溫度計〆量測溫度範圍1~55℃,最小刻度0.1℃。
2.2.14 水浴〆加蓋,具水流循環系統,能維持水溫溫差在±0.2℃以內者。
2.2.15 接種針及接種環(直徑約3 mm)〆鎳鉻合金、鉑銥或鉻線材質,或可拋棄式者。
2.2.16 曲玻棒〆可滅菌者,直徑3~4 mm,塗抹區域45~55 mm。
2.2.17 試管〆10 ×100 mm,13 ×100 mm,13 ×120 mm,15 ×150 mm,16 ×150 mm試管,或其他適用者。
阪崎肠杆菌_ppt课件

※氧化酶阴性
※过氧化氢酶阳性,并生成黄色菌落
营养成分表
样品
美赞臣 安婴儿婴儿配方奶粉
罐装
配料表: 100%进口奶源配料:乳糖、精炼植物油、浓缩 乳清蛋白、脱脂奶粉、低聚半乳糖(GOS)、 花生四烯酸(ARA)和二十二碳六烯酸(DHA) (来源于单细胞油)、矿物质(碳酸钙、氯化钙、 柠檬酸钾、氯化钾、氯化镁、硫酸亚铁、硫酸锌、 硫酸铜、硫酸锰、亚硒酸钠、碘化钾)、玉米糖 浆固体、维生素(维生素A、维生素D3、维生素 E、维生素C、维生素B1、维生素B2、维生素B6、 维生素B12、维生素K1、胆碱、肌醇、烟酰胺、 叶酸、泛酸、生物素)、牛磺酸、核苷酸、食品 添加剂:磷脂、抗坏血酸棕榈酸酯、氢氧化钙、 碳酸氢钾。
44 ℃±0.5 ℃ 培养24h±2h 。
10 mL mLST-Vm 肉汤
36 ℃±1 ℃培 养24 h±2 h。
各取增菌培养物1 环,分 别划线接种于两个阪崎肠 杆菌显色培养基平板
①前增菌和 增菌
②分离
挑取1 个~5 个可疑菌落,划 线接种于TSA 平板。 25 ℃±1 ℃培养48 h±4 h。
③鉴定
阪崎肠杆菌显色培养基DFI
微生物
菌落颜色
• 阪崎肠杆菌 • 大肠杆菌 • 金黄色葡萄球菌
蓝绿色 无色菌落 被抑制不生长
培养基和试剂
• 4 、胰蛋白胨大豆琼脂(trypticase soy agar, TSA):见附录A 中A.3。
• 5 、生化鉴定试剂盒。 • 6、 氧化酶试剂:见附录A 中A.4。 • 7、 L-赖氨酸脱羧酶培养基:见附录A 中A.5。 • 8 、L-鸟氨酸脱羧酶培养基:见附录A 中A.6。 • 9 、L-精氨酸双水解酶培养基:见附录A 中A.7
KJ06 阪崎肠杆菌普通PCR法.

阳性结果:282bp PCR扩增产物
4.结果分析
阳性:阴性和空白对照均未出现预期大小的扩增条 带;阳性对照和待测样品均出现预期大小的扩增条 带,怀疑存在阪崎肠杆菌。 阴性:阴性、空白对照及待测样品均未出现预期大 小的扩增条带;阳性对照出现预期大小的扩增条带。 无效试验:阳性对照未出现预期大小的扩增条带。 污染可能:阴性对照和空白对照出现预期大小的扩 增条带。
试剂 仪器设备 方法步骤及注意事项 结果分析 确认试验
1.试剂
增菌: • 改良月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤(MLST) 即:在一升LST中增加氯化钠29.22克;高 压后添加万古霉素10mg/L。 • 脑心浸液(BHI) DNA提取:试剂盒
PCR试剂: 10×PCR buffer、Taq酶、dNTP、ddH2O、 引物、阳性、阴性对照DNA。 电泳: 琼脂糖(分析纯)、溴化乙锭、电泳缓冲 液、加样缓冲液、分子量标记:100 bp DNA ladder。
5.确认试验
PCR阳性结果需做确认试验。 取留存的BHI增菌液接种于VRBGA及显色培 养基,参照标准第一部分挑取可疑菌落进行 鉴定。
6.检验程序
样品100 g加入900 mL MLST中 44°Байду номын сангаас 22 h~24 h
0.2mL MLST增菌液加到5 mL BHI中 36℃1℃ 水浴4h PCR 检测 阴性 阳性
SN/T 1632.1-2005 奶粉中阪崎肠杆菌检测方法
第2部分
奶粉中阪崎肠杆菌的PCR检测方法
增菌液的选择
采用经试验评估的美国杜邦公司BAX系 统相关增菌方法:用改良月桂基硫酸盐 胰蛋白胨肉汤(MLST)对奶粉中阪崎肠 杆菌进行选择性增菌,再用脑心浸液 (BHI)对阪崎肠杆菌在短时间内进行快 速增殖,以供PCR检测。
阪崎肠杆菌的测定.pptx

阪崎肠杆菌的分布
1.环境 原油、切削液、苍蝇、食品加工厂(奶制品、谷类、
巧克力、马铃薯粉),医院(空气、听诊器、临床 食品)、家庭、温泉、鼠、沉积物、沼泽地、土壤 2.食品及相关用品 啤酒杯、干酪、婴儿配方奶粉和豆粉、婴儿配方粉 冲调用品(搅拌器、勺子、甁刷),普通奶粉、碎 牛肉、肉类、香肠、发酵面包、豆腐、蔬菜、水 (管道、生物膜)、调味品
冷藏条件下可以生长 5、在TSA培养基上产生黄色色素 6、产生α-葡萄糖苷酶,其它肠杆菌均不产生; 7、较强的耐干燥性,耐高渗透压, “干燥逆境抗
性”比其他,大多数乳品中分离得到的肠杆菌更 加耐热,但标准的高温短时巴氏杀菌可消灭
5
易感人群
• 阪崎肠杆菌可引起各年龄段的感染,但从 报道病例的年龄分布来看,高危人群主要是 婴儿(即<1岁的儿童),新生儿(≤28天)、 尤其是早产儿、低出生体重或免疫力下的婴 儿,发生严重感染的危险性最高。
• 母亲HIV阳性的婴儿
6
主要感染渠道
虽然现在还不能确定阪 崎肠杆菌的宿主和传播 模型,但在多起新生儿 阪崎肠杆菌感染事件的 调查中发现婴幼儿配方 粉是主要的感染渠道
7
阪
崎
检
1前增菌 2选择性增菌
测 3平板分离
பைடு நூலகம்
步
4平板确认 5 生化鉴定
骤
8
阪崎肠杆菌检验——前增菌
操作:100g样品+900mL增菌液,培养18h±2h GB使用的增菌液为BPW 主要作用:营养丰富,更利于食品检验具有缓冲体系
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阪崎肠杆菌检验——平板分离
操作:各取培养物一环,接种显色平板,培养24h±2h 培养基作用 显色培养基 •显色培养基利用阪崎特异性α-葡萄糖苷酶原理,分解底物
食品卫生微生物学检验-阪崎肠杆菌 ppt课件

阪崎肠杆菌介绍
易感人群:
免疫力低下者和婴幼儿、新生儿, 尤其是早产儿、低体重儿可以致病。感 染来源主要是受阪崎肠杆菌污染的奶粉, 人与人之间无传染性。
阪崎肠杆菌介绍
1、阪崎肠杆菌在自然界分布广泛,在水、土壤、食 物、排泄物等中都能够检出。细菌不耐热,加热到 72℃持续15秒就可以杀灭。细菌不在人与人之间传播。 2、阪崎肠杆菌在一般情况下不对人体健康产生危害, 但对于新生儿,尤其是早产儿、低体重儿可以致病。 3、绝大多数患者为轻症病例,表现为轻微的消化道 症状,恢复良好;重症病例罕见但病死率高。对于发 现的病例应及时报告。
阪崎肠杆菌介绍
阪崎肠杆菌(Enterobater sakazakii)属肠杆菌科肠杆 菌属,革兰染色阴性杆菌。阪崎肠杆菌在自然界分布 广泛,繁殖迅速,但不耐热,可通过巴斯德消毒法杀 灭。阪崎肠杆菌属条件致病菌,在一般情况下,不对 人体健康产生危害,但对于免疫力低下者和婴幼儿、 新生儿,尤其是早产儿、低体重儿可以致病。感染来 源主要是受阪崎肠杆菌污染的奶粉,人与人之间无传
食品卫生微生物学检验-阪崎肠杆菌 ppt课件
阪崎肠杆菌检验 GB/T 4789.40-2008
一、采标情况
二、适用范围 三、操作过程 1 第一法 阪崎肠杆菌的检验 2 第二法 阪崎肠杆菌的计数
阪崎肠杆菌检验 GB/T 4789.40-2008
二、适用范围
适用于婴幼儿配方奶粉、乳和乳制品及 其原料中阪崎肠杆菌的检验
挑取绿色菌落
接种TSA平板
25℃±1 ℃ 48 h ± 4 h 挑取黄色菌落
生化鉴定
阪崎肠杆菌检验

第一部分:一般特征
一.培养特征 二.生化反应 三.抵抗力 四.增殖能力
与其他常见肠杆菌相似
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一、培养特征
阪崎肠杆菌兼性厌氧,营养要求不高,能在营养琼脂、 血平板、麦康凯(MacConkey,MAC)琼脂、伊红美蓝 琼脂、脱氧胆酸琼脂等多种培养基上生长繁殖。
ES在VRBGA平板上首次划线分离时,37℃培养24h可生成2种不同 的形态学特征: 1. 干燥或粘液状、圆锯齿状(凹口或锯齿),用金属环接触时 可发现坚韧或有弹力,即粘贴金属环的菌量很少,并且菌落 可很快恢复。传代培养后可能会转变为典型的光滑菌落。 2. 光滑、易于用金属环从菌落移取细胞。
阪崎肠杆菌检验
GB 4789.40--2010
Enterobacter sakazakii(ES)
2
内
容
第一部分:一般特征 第二部分:致病性 第三部分E.sakazakii)是人和动物肠道内 寄生的一种革兰阴性无芽孢杆菌,属肠杆 菌科肠杆菌属,是肠道正常菌丛中的一种 ,在一定条件下可引起人和动物致病。 阪崎肠杆菌能引起严重的新生儿脑膜炎、小 肠结肠炎和菌血症,死亡率高达50% 以上 。目前,微生物学家尚不清楚阪崎肠杆菌 的污染来源,但许多病例报告表明婴儿配 方粉是目前发现的主要感染渠道。
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二、生化反应
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• DNASE-脱氧核糖核酸酶
注:+ :90-100%;(+) :75-89%; V :25-74%;(-):10 -24%;- :0-9%
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三、抵抗力
• 耐热性 • 渗透压 • 干燥
不同菌株的耐热性存在明显的差别,但标准的巴氏消 毒过程能有效的灭活ES。 ES对渗透压的耐受性使该菌能够成为环境中的优势株, 增加PIF(婴儿配方奶)加工后污染的危险性,使其在PIF (婴儿配方奶) 中长期存活。
阪崎肠杆菌科菌种鉴定细菌成分

阪崎肠杆菌科菌种鉴定细菌成分一、引言阪崎肠杆菌科(Sakazakii Enterobacteriaceae)是一种常见的细菌科,包含多种致病性菌种。
其中的阪崎肠杆菌(Cronobacter sakazakii)是一种已知的人类致病菌,能引起新生儿脑膜炎、败血症、肺炎等严重感染。
因此,对于阪崎肠杆菌科菌种鉴定的准确性和全面性要求极高。
二、样品采集与处理1. 采集样品:从食品、环境等来源中采集样品,如奶粉、水源等。
2. 处理样品:将样品进行预处理,如加入缓冲液等,以保证后续操作的可靠性和准确性。
三、培养基选择与制备1. 培养基选择:常用的培养基有Luria-Bertani(LB)、营养琼脂(NA)、大肠杆菌选择性培养基MacConkey(MAC)等。
2. 培养基制备:按照标准配方制备培养基,并进行灭菌处理。
四、细胞分离与纯化1. 细胞分离:将样品接种到培养基中,进行静置或摇床培养,使菌落生长。
2. 细胞纯化:通过不同的方法,如差速离心、磁珠分离等,将目标细菌分离纯化。
五、生化鉴定1. 氧化酶试验:检测细菌是否具有氧化酶活性。
2. 婴儿食品模拟液培养:将细菌接种到婴儿食品模拟液中进行培养,观察是否能够生长。
3. 阳性和阴性反应检测:通过添加不同的试剂观察细菌是否产生阳性或阴性反应。
六、分子生物学鉴定1. PCR扩增:使用特异性引物对目标基因进行PCR扩增。
2. 16S rRNA序列分析:对PCR扩增得到的16S rRNA序列进行测序和比对,并与数据库中的已知序列进行比较。
七、质谱鉴定1. MALDI-TOF MS技术:利用MALDI-TOF MS技术对目标菌株进行质谱分析,并与数据库中的已知质谱图谱进行比对。
八、总结阪崎肠杆菌科菌种鉴定需要综合应用多种方法,包括样品采集与处理、培养基选择与制备、细胞分离与纯化、生化鉴定、分子生物学鉴定和质谱鉴定等。
在实际操作中,需要根据具体情况选择合适的方法,并注意操作规范和安全性。
食品微生物之检验方法-阪崎肠杆菌之检验

食品微生物之检验方法-阪崎肠杆菌之检验1 适用范围:本方法适用于一般食品及奶粉中阪崎肠杆菌之检验。
2 检验方法:2.1 工作环境:工作平台须宽敞、洁净、光线良好,操作平台光度为100呎烛光以上,密闭室内换气良好,尽可能没有灰尘及流动空气。
每15分钟落菌数不得超过15 CFU/培养皿。
2.2 器具及材料:2.2.1 干热灭菌器。
2.2.2 高压灭菌釜。
2.2.3 搅拌均质器(Blender)或铁胃(Stomacher):适用于无菌操作者。
2.2.4 天平:可称量到2000 g者,灵敏度为0.1 g;可称量到120 g者,灵敏度为1 mg。
2.2.5 冰箱:能维持5 ± 3℃者。
2.2.6 吸管或吸管尖:已灭菌,1 mL吸管应有0.01 mL之刻度;5 mL及10 mL吸管应有0.1 mL 之刻度。
2.2.7 吸管辅助器(Pipette aid)或微量分注器。
2.2.8 稀释瓶:160 mL,玻璃、聚乙烯(polyethylene)、铁弗龙(Teflon)或其它能耐121℃湿热灭菌20分钟以上之塑料材质,附螺旋盖。
2.2.9 培养皿:已灭菌,内径约9 cm,深度约15 mm,底皿之内外面应平坦,无气泡、刮伤或其它缺点。
2.2.10 增菌用容器:附螺旋盖之125 mL、250 mL、2 L三角锥瓶或广口瓶;玻璃、聚乙烯、铁弗龙或其它能耐121℃湿热灭菌20分钟以上之塑料材质。
2.2.11 pH测定仪。
2.2.12 培养箱:能维持内部温度在± 1℃以内者。
2.2.13 温度计:量测温度范围1~55℃,最小刻度0.1℃。
2.2.14 水浴:加盖,具水流循环系统,能维持水温温差在± 0.2℃以内者。
2.2.15 接种针及接种环(直径约3 mm):镍铬合金、铂铱或铬线材质,或可抛弃式者。
2.2.16 曲玻棒:可灭菌者,直径3~4 mm,涂抹区域45~55 mm。
2.2.17 试管:10 × 100 mm,13 × 100 mm,13 × 120 mm,15 × 150 mm,16 × 150 mm试管,或其它适用者。
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阪崎肠杆菌检验
7
简介
微生物学家尚不清楚阪崎肠杆菌的污染来源,但 许多病例报告表明婴儿配方粉是目前发现的主要 感染渠道。
以下3 种主要途径可以导致婴儿配方奶粉中阪崎 肠杆菌的污染:
A 通过生产婴儿配方奶粉的原料; B 在巴斯德杀菌后,配方粉污染或其他添加
带入; C 喂养婴儿前被污染
剂干粉
阪崎肠杆菌检验
3
奶粉?隐形杀手?
阪崎肠杆菌检验
4
简介
危害性:阪崎肠杆菌已被世界卫生组 织和许多国家确定为引起婴幼儿死亡 的重要条件致病菌
阪崎肠杆菌检验
5
简介
阪崎肠杆菌属条件致病菌,在一般情况下,不对人体健康 产生危害,成年人感染常为轻度的胃肠道症状。
新生儿(出生28天或以下)和不足2个月的婴儿,尤其是早 产儿、体重不足2.5公斤和免疫力较弱(母亲HIV)的婴儿 的感染风险最高。可致严重脑膜炎,败血症,小肠结肠炎, 死亡率可高达50%~80%。
8
简介
2002年美国FDA在本土某些国际乳业巨头生产的 婴儿配方奶粉中检出阪崎肠杆菌。
2003年又一家国际乳业巨头公司主动召回在美国 生产的一批检出极微量阪崎肠杆菌的罐装早产儿 特殊配方奶粉。
阪崎肠杆菌从此成为世界瞩目的焦点,得到世界 多国相关部门的重视。
阪崎肠杆菌检验
9
简介
2005年以来,广州、中山、汕头检验检疫部 门在食品工业用进口奶粉中已多次检出阪 崎肠杆菌。
2008年10月17日,产自台湾的9.62吨配方 奶粉从香港入境时被检验出阪崎肠杆菌超 标 。不合格奶粉包括味全婴儿配方奶粉、 味全幼儿成长配方奶粉和味全较大婴儿配 方奶粉。
阪崎肠杆菌检验
10
简介
阪崎肠杆菌的检验方法?标准化?
阪崎肠杆菌检验
11
简介
美国食品和药品管理局(FDA)的检测方法是国际检 测阪崎肠杆菌的标准生化方法。此外,还有依据 该菌生理生化特征的鉴定方法和PCR法检测及荧 光PCR等分子检测方法。
阪崎肠杆菌检验
13
简介
2006年2月,国际标准化组织(ISO)和 国际乳品联盟(IDF)联合公布了“乳和 乳制品中阪崎肠杆菌的检测”方法, 即ISO/TS 22964 IDF/RM210
阪崎肠杆菌检验
14
简介
2008-11-21,中华人民共和国卫生部联合国家 标准化委员会发布GB/T 4789.40-2008食品卫 生微生物学检验阪崎肠杆菌检验, 2009-03-01 实施。
注意:新鲜配制的mLST-Vm应该24h内使用, 万古霉素溶液可在4 ℃保存15d
阪崎肠杆菌检验
19
培养基和试剂
阪崎肠杆菌显色培养基DFI
附录A.3,由英国Oxoid公司提供,也可用同等效 果的产品替代。
原 理: DFI中含有胆盐抑制革兰氏阳性菌,同时显色底物5溴-4-氯-3-吲哚-ɑ-D 葡萄糖苷则与阪崎肠杆菌中的α葡萄糖苷酶发生反应,水解底物,释放出5-溴-4-氯3-吲哚基显色基团,在深黄色平板上产生绿-蓝绿色 的菌落。
阪崎肠杆菌检验
简介
阪崎肠杆菌( Enterobacter sakazakii ) 分类在肠杆菌科, 肠杆菌属, G-b,无芽胞,有周身鞭毛,兼性厌氧, 棒状或球杆状,长 0.6~6.0μm,宽 0.3~1.0 μm。
生长特性:经过适宜的条件培养后在营养琼脂或血 平板上形成圆形,光滑,突起,直径 2~3 mm,黄 色菌落,黄色素在 25 ℃ 时更为明显。
这项标准的出台,解决了我国检测婴幼儿配 方奶粉中阪崎肠杆菌无国家标准检测方法的 问题。
阪崎肠杆菌检验
15
适用范围
规定了食品中阪崎肠杆菌的检验方法
适用于婴幼儿配方食品,乳及乳制品,及 其原料中阪崎肠杆菌的检验
阪崎肠杆菌检验
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设备和材料
微生物实验室常规灭菌与培养设备
冰箱2℃~5℃、水浴箱44 ℃ +0.5 ℃ 、感量 0.1g天平、振荡器、均质器
注意要避光4℃ 保存
阪崎肠杆菌检验
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阪崎肠杆菌显色培养基DFI
微生物 阪崎肠杆菌 大肠菌群 金黄色葡萄球菌
菌落颜色 蓝绿色 无色菌落 被抑制不生长
阪崎肠杆菌检验
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培养基和试剂
胰蛋白胨大豆琼脂TSA (略) API 20E(也可选用其他等效鉴定试剂代替) 氧化酶试剂A.5 L-赖氨酸脱羧酶培养基A.6 L-鸟氨酸脱羧酶培养基A.7 L-精氨酸双水解酶培养基A.8 糖类发酵培养基A.9 西蒙氏柠檬酸盐培养基A.10
新生儿(尤其是早产婴儿)胃的酸性较成年人低(PH高), 这可能是阪崎肠杆菌可在婴儿体内生存的一个主要因素。
阪崎肠杆菌检验
6
1961年,英国的Fr简anklin介等人首次报道了2例阪
崎肠杆菌脑膜炎,此后相继出现阪崎肠杆菌 致人类感染的散发和暴发的病例报告。
统计到2004年,全球各地报道的确诊病例在 60例以上,导致多起商业婴儿配方奶粉被广 泛召回。
生化特性与阴沟肠杆菌相似,故1980年以前被称为 黄色阴沟肠杆菌,后更名为阪崎肠杆菌。
阪崎肠杆菌检验
2
简介
自然界分布广泛,在水、土壤、食物、排 泄物等中都能够检出。细菌不耐热,加热 到72℃持续15秒就可以杀灭。细菌不在人与 人之间传崎肠杆菌检验
无菌吸管10ml,0.1ml,微量移液器,吸头
阪崎肠杆菌检验
17
设备和材料
无菌锥形瓶100ml\200ml\2000ml 90mm直径无菌培养皿 PH计或精密PH试纸 VITEK全自动微生物鉴定系统(可选用其
他等效设备代替)
阪崎肠杆菌检验
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培养基和试剂
缓冲蛋白胨水BPW(略) 改良月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤-万古霉素 mLST-Vm 成分和配制方法见附录A.2,加入万古霉 素目的是抑制革兰阳性细菌等杂菌的生长
2008年11月国家标准出台前,我国只有行业标准。
阪崎肠杆菌检验
12
简介
2005-5-20中国检验检疫科学研究院和天津出入境 检验检疫局牵头完成《奶粉中阪崎肠杆菌检测方 法》行业标准。
该标准建立了阪崎肠杆菌改进的传统检测方法(经 典方法)、普通PCR方法和荧光PCR方法(快速筛选 方法),其中改进的传统方法与FDA方法比较,检 测结果一致,但效率大大提高,时间缩短1/3~ 1/2。