阪崎肠杆菌检验 ppt课件
食品微生物之检验方法-阪崎肠杆菌之检验
附件食品微生物之檢驗方法－阪崎腸桿菌之檢驗1 適用範圍〆本方法適用於一般食品及奶粉中阪崎腸桿菌之檢驗。
2 檢驗方法〆2.1 工作環境〆工作平台須寬敞、潔淨、光線良好，操作平台光度為100呎燭光以上，密閉室內換氣良好，儘可能沒有灰塵及流動空氣。
每15分鐘落菌數不得超過15 CFU／培養皿。
2.2 器具及材料〆2.2.1 乾熱滅菌器。
2.2.2 高壓滅菌釜。
2.2.3 攪拌均質器（Blender）或鐵胃（Stomacher）〆適用於無菌操作者。
2.2.4 天平〆可稱量到2000 g者，靈敏度為0.1 g々可稱量到120 g者，靈敏度為1 mg。
2.2.5 冰箱〆能維持5 ±3℃者。
2.2.6 吸管或吸管尖〆已滅菌，1 mL吸管應有0.01 mL之刻度々5 mL及10 mL吸管應有0.1 mL之刻度。
2.2.7 吸管輔助器（Pipette aid）或微量分注器。
2.2.8 稀釋瓶〆160 mL，玻璃、聚乙烯（polyethylene）、鐵弗龍（Teflon）或其他能耐121℃濕熱滅菌20分鐘以上之塑膠材質，附螺旋蓋。
2.2.9 培養皿〆已滅菌，內徑約9 cm，深度約15 mm，底皿之內外面應平坦，無氣泡、刮傷或其他缺點。
2.2.10 增菌用容器〆附螺旋蓋之125 mL、250 mL、2 L三角錐瓶或廣口瓶々玻璃、聚乙烯、鐵弗龍或其他能耐121℃濕熱滅菌20分鐘以上之塑膠材質。
2.2.11 pH測定儀。
2.2.12 培養箱〆能維持內部溫度在±1℃以內者。
2.2.13 溫度計〆量測溫度範圍1～55℃，最小刻度0.1℃。
2.2.14 水浴〆加蓋，具水流循環系統，能維持水溫溫差在±0.2℃以內者。
2.2.15 接種針及接種環（直徑約3 mm）〆鎳鉻合金、鉑銥或鉻線材質，或可拋棄式者。
2.2.16 曲玻棒〆可滅菌者，直徑3～4 mm，塗抹區域45～55 mm。
2.2.17 試管〆10 ×100 mm，13 ×100 mm，13 ×120 mm，15 ×150 mm，16 ×150 mm試管，或其他適用者。
GB 坂崎肠杆菌检验(共32张PPT)
4
一、命名
1980年之前一直被称为黄色阴沟肠杆菌。
• DNA-DNA杂交 • 生化反应
• 黄色素 • 抗生素敏感性
5
二、培养特征
• G－无芽孢杆菌，兼性厌氧，在6℃-47℃范围内
均可生长，适温35-37℃ • 营养要求不高： VRBGA、TSA、NA、MAC、EMB、其他
常见选择性培养基
• DFI (Oxoid, UK)
• ESIA (AES, France)
• R＆F（R&F Laboratories，Switzerland）
• OK medium
• 其他：国内阪崎肠杆菌显色培养基、CES (Merck, Germany)，
NA+ -MUG
13
显色培养基的特点
2. ES都可以在DFI平板上生长并产生蓝绿色菌落
3. 其他常见菌在DFI平板的菌落颜色 a. 白色菌落：肺炎克雷伯氏菌、阴沟肠杆菌、大肠埃希氏菌、 泛菌属的多种菌等 b. 黄色菌落：赫氏埃希氏菌 c. 黑褐色、粉色或中心蓝绿菌落：少量菌种
• ESIA:蓝色，1-3mm
2022/8/30
17
选择性增菌肉汤的选择
5-溴-4-氯-3-吲哚- ，D-吡喃葡糖甙（X Glc）
API (＋)
2：07E5反-8应9%编；码（Isolation
and
Enumeration
of
Enterobacter
sakazaΒιβλιοθήκη iifrom右图：混合后。
）方法； 研究证明与其他肠杆菌科细菌（如沙门氏菌，大肠埃希氏菌等）相比，ES具有较高的耐渗透压能力。
• 本标准与GB/T 4789.40-2008 相比，主要变 化如下：
阪崎肠杆菌_ppt课件
※氧化酶阴性
※过氧化氢酶阳性，并生成黄色菌落
营养成分表
样品
美赞臣 安婴儿婴儿配方奶粉
罐装
配料表： 100%进口奶源配料：乳糖、精炼植物油、浓缩 乳清蛋白、脱脂奶粉、低聚半乳糖（GOS）、 花生四烯酸（ARA）和二十二碳六烯酸（DHA） （来源于单细胞油）、矿物质（碳酸钙、氯化钙、 柠檬酸钾、氯化钾、氯化镁、硫酸亚铁、硫酸锌、 硫酸铜、硫酸锰、亚硒酸钠、碘化钾）、玉米糖 浆固体、维生素（维生素A、维生素D3、维生素 E、维生素C、维生素B1、维生素B2、维生素B6、 维生素B12、维生素K1、胆碱、肌醇、烟酰胺、 叶酸、泛酸、生物素）、牛磺酸、核苷酸、食品 添加剂：磷脂、抗坏血酸棕榈酸酯、氢氧化钙、 碳酸氢钾。
44 ℃±0.5 ℃ 培养24h±2h 。
10 mL mLST-Vm 肉汤
36 ℃±1 ℃培 养24 h±2 h。
各取增菌培养物1 环，分 别划线接种于两个阪崎肠 杆菌显色培养基平板
①前增菌和 增菌
②分离
挑取1 个～5 个可疑菌落，划 线接种于TSA 平板。 25 ℃±1 ℃培养48 h±4 h。
③鉴定
阪崎肠杆菌显色培养基DFI
微生物
菌落颜色
• 阪崎肠杆菌 • 大肠杆菌 • 金黄色葡萄球菌
蓝绿色 无色菌落 被抑制不生长
培养基和试剂
• 4 、胰蛋白胨大豆琼脂（trypticase soy agar， TSA）：见附录A 中A.3。
• 5 、生化鉴定试剂盒。 • 6、 氧化酶试剂：见附录A 中A.4。 • 7、 L-赖氨酸脱羧酶培养基：见附录A 中A.5。 • 8 、L-鸟氨酸脱羧酶培养基：见附录A 中A.6。 • 9 、L-精氨酸双水解酶培养基：见附录A 中A.7
食品微生物之检验方法-阪崎肠杆菌之检验
食品微生物之检验方法－阪崎肠杆菌之检验1 适用范围：本方法适用于一般食品及奶粉中阪崎肠杆菌之检验。
2 检验方法：2.1 工作环境：工作平台须宽敞、洁净、光线良好，操作平台光度为100呎烛光以上，密闭室内换气良好，尽可能没有灰尘及流动空气。
每15分钟落菌数不得超过15 CFU／培养皿。
2.2 器具及材料：2.2.1 干热灭菌器。
2.2.2 高压灭菌釜。
2.2.3 搅拌均质器（Blender）或铁胃（Stomacher）：适用于无菌操作者。
2.2.4 天平：可称量到2000 g者，灵敏度为0.1 g；可称量到120 g者，灵敏度为1 mg。
2.2.5 冰箱：能维持5 ± 3℃者。
2.2.6 吸管或吸管尖：已灭菌，1 mL吸管应有0.01 mL之刻度；5 mL及10 mL吸管应有0.1 mL 之刻度。
2.2.7 吸管辅助器（Pipette aid）或微量分注器。
2.2.8 稀释瓶：160 mL，玻璃、聚乙烯（polyethylene）、铁弗龙（Teflon）或其它能耐121℃湿热灭菌20分钟以上之塑料材质，附螺旋盖。
2.2.9 培养皿：已灭菌，内径约9 cm，深度约15 mm，底皿之内外面应平坦，无气泡、刮伤或其它缺点。
2.2.10 增菌用容器：附螺旋盖之125 mL、250 mL、2 L三角锥瓶或广口瓶；玻璃、聚乙烯、铁弗龙或其它能耐121℃湿热灭菌20分钟以上之塑料材质。
2.2.11 pH测定仪。
2.2.12 培养箱：能维持内部温度在± 1℃以内者。
2.2.13 温度计：量测温度范围1～55℃，最小刻度0.1℃。
2.2.14 水浴：加盖，具水流循环系统，能维持水温温差在± 0.2℃以内者。
2.2.15 接种针及接种环（直径约3 mm）：镍铬合金、铂铱或铬线材质，或可抛弃式者。
2.2.16 曲玻棒：可灭菌者，直径3～4 mm，涂抹区域45～55 mm。
2.2.17 试管：10 × 100 mm，13 × 100 mm，13 × 120 mm，15 × 150 mm，16 × 150 mm试管，或其它适用者。
肠杆菌科细菌检验PPT课件
1
目的要求
• 掌握常见肠杆菌科细菌的培养特性和形态染色特征 • 掌握常见肠杆菌科细菌的鉴定技术 • 掌握肠杆菌科微量生化管编码鉴定技术 • 掌握肠杆菌科临床常见致病菌的血清学凝集技术
2
实验材料
一、菌种： 大肠埃希菌、沙门菌、普通变形杆菌、肺炎克雷伯菌（BAP、 MAC、SS） 二、生化管： KIA、半固体、肠杆菌科微量生化管编码鉴定管（1套/2人） 三、诊断血清： 沙门菌多价 四、其他： 玻片、盐水、接种环（针）、革兰染液、3%H2O2、氧化酶试 剂、液体石蜡
5
检验程序
粪便
肠道外标本
肠道选择培养基
血平板、弱选择平板
可疑菌落
血清学实验 生化反应 药敏试验
结果报告
6
肠道杆菌的生化反应鉴定
1. 肠杆菌科与其它革兰阴性杆菌区别
7
2. 初步分三组
苯丙氨酸（－） 苯丙氨酸（＋） 苯丙氨酸（－）
VP（－）
VP（－）
VP（＋）
埃希菌属
变形杆菌属
克雷伯菌属
沙门菌属 普罗威登斯菌属 肠杆菌属
MACC
SS
12
大肠埃希杆菌呈典型粉红色，乳糖发酵菌落。福氏 痢疾杆菌 菌落小，无色透明，非乳糖发酵菌。 （18hr,37℃)
13
双糖铁培养基(KIA)
蛋白胨 10g
氯化钠 5 g
牛肉膏 3 g
琼 脂 16g
水
1000ml
葡 萄 糖 1g 乳 糖 10g 硫代硫酸钠 0.2g 硫酸亚铁 0.2g 0.4%酚红 6ml
克雷伯菌属 A
A
+ － - d+
9
麦康凯琼脂（MACC）
阪崎肠杆菌检验
第一部分：一般特征
一．培养特征 二．生化反应 三．抵抗力 四．增殖能力
与其他常见肠杆菌相似
5
一、培养特征
阪崎肠杆菌兼性厌氧，营养要求不高，能在营养琼脂、 血平板、麦康凯(MacConkey，MAC)琼脂、伊红美蓝 琼脂、脱氧胆酸琼脂等多种培养基上生长繁殖。
ES在VRBGA平板上首次划线分离时，37℃培养24h可生成2种不同 的形态学特征： 1. 干燥或粘液状、圆锯齿状（凹口或锯齿），用金属环接触时 可发现坚韧或有弹力，即粘贴金属环的菌量很少，并且菌落 可很快恢复。传代培养后可能会转变为典型的光滑菌落。 2. 光滑、易于用金属环从菌落移取细胞。
阪崎肠杆菌检验
GB 4789.40--2010
Enterobacter sakazakii(ES)
2
内
容
第一部分：一般特征 第二部分：致病性 第三部分E．sakazakii)是人和动物肠道内 寄生的一种革兰阴性无芽孢杆菌，属肠杆 菌科肠杆菌属，是肠道正常菌丛中的一种 ，在一定条件下可引起人和动物致病。 阪崎肠杆菌能引起严重的新生儿脑膜炎、小 肠结肠炎和菌血症，死亡率高达50% 以上 。目前，微生物学家尚不清楚阪崎肠杆菌 的污染来源，但许多病例报告表明婴儿配 方粉是目前发现的主要感染渠道。
7
二、生化反应
8
• DNASE-脱氧核糖核酸酶
注：＋ ：90-100％；(＋) ：75-89%； V ：25-74％；(－)：10 -24％；－ ：0-9％
10
三、抵抗力
• 耐热性 • 渗透压 • 干燥
不同菌株的耐热性存在明显的差别，但标准的巴氏消 毒过程能有效的灭活ES。 ES对渗透压的耐受性使该菌能够成为环境中的优势株， 增加PIF（婴儿配方奶）加工后污染的危险性，使其在PIF （婴儿配方奶） 中长期存活。
阪崎肠杆菌科菌种鉴定细菌成分
阪崎肠杆菌科菌种鉴定细菌成分一、引言阪崎肠杆菌科（Sakazakii Enterobacteriaceae）是一种常见的细菌科，包含多种致病性菌种。
其中的阪崎肠杆菌（Cronobacter sakazakii）是一种已知的人类致病菌，能引起新生儿脑膜炎、败血症、肺炎等严重感染。
因此，对于阪崎肠杆菌科菌种鉴定的准确性和全面性要求极高。
二、样品采集与处理1. 采集样品：从食品、环境等来源中采集样品，如奶粉、水源等。
2. 处理样品：将样品进行预处理，如加入缓冲液等，以保证后续操作的可靠性和准确性。
三、培养基选择与制备1. 培养基选择：常用的培养基有Luria-Bertani（LB）、营养琼脂（NA）、大肠杆菌选择性培养基MacConkey（MAC）等。
2. 培养基制备：按照标准配方制备培养基，并进行灭菌处理。
四、细胞分离与纯化1. 细胞分离：将样品接种到培养基中，进行静置或摇床培养，使菌落生长。
2. 细胞纯化：通过不同的方法，如差速离心、磁珠分离等，将目标细菌分离纯化。
五、生化鉴定1. 氧化酶试验：检测细菌是否具有氧化酶活性。
2. 婴儿食品模拟液培养：将细菌接种到婴儿食品模拟液中进行培养，观察是否能够生长。
3. 阳性和阴性反应检测：通过添加不同的试剂观察细菌是否产生阳性或阴性反应。
六、分子生物学鉴定1. PCR扩增：使用特异性引物对目标基因进行PCR扩增。
2. 16S rRNA序列分析：对PCR扩增得到的16S rRNA序列进行测序和比对，并与数据库中的已知序列进行比较。
七、质谱鉴定1. MALDI-TOF MS技术：利用MALDI-TOF MS技术对目标菌株进行质谱分析，并与数据库中的已知质谱图谱进行比对。
八、总结阪崎肠杆菌科菌种鉴定需要综合应用多种方法，包括样品采集与处理、培养基选择与制备、细胞分离与纯化、生化鉴定、分子生物学鉴定和质谱鉴定等。
在实际操作中，需要根据具体情况选择合适的方法，并注意操作规范和安全性。
食品微生物之检验方法-阪崎肠杆菌之检验
食品微生物之检验方法－阪崎肠杆菌之检验1 适用范围：本方法适用于一般食品及奶粉中阪崎肠杆菌之检验。
2 检验方法：2.1 工作环境：工作平台须宽敞、洁净、光线良好，操作平台光度为100呎烛光以上，密闭室内换气良好，尽可能没有灰尘及流动空气。
每15分钟落菌数不得超过15 CFU／培养皿。
2.2 器具及材料：2.2.1 干热灭菌器。
2.2.2 高压灭菌釜。
2.2.3 搅拌均质器（Blender）或铁胃（Stomacher）：适用于无菌操作者。
2.2.4 天平：可称量到2000 g者，灵敏度为0.1 g；可称量到120 g者，灵敏度为1 mg。
2.2.5 冰箱：能维持5 ± 3℃者。
2.2.6 吸管或吸管尖：已灭菌，1 mL吸管应有0.01 mL之刻度；5 mL及10 mL吸管应有0.1 mL 之刻度。
2.2.7 吸管辅助器（Pipette aid）或微量分注器。
2.2.8 稀释瓶：160 mL，玻璃、聚乙烯（polyethylene）、铁弗龙（Teflon）或其它能耐121℃湿热灭菌20分钟以上之塑料材质，附螺旋盖。
2.2.9 培养皿：已灭菌，内径约9 cm，深度约15 mm，底皿之内外面应平坦，无气泡、刮伤或其它缺点。
2.2.10 增菌用容器：附螺旋盖之125 mL、250 mL、2 L三角锥瓶或广口瓶；玻璃、聚乙烯、铁弗龙或其它能耐121℃湿热灭菌20分钟以上之塑料材质。
2.2.11 pH测定仪。
2.2.12 培养箱：能维持内部温度在± 1℃以内者。
2.2.13 温度计：量测温度范围1～55℃，最小刻度0.1℃。
2.2.14 水浴：加盖，具水流循环系统，能维持水温温差在± 0.2℃以内者。
2.2.15 接种针及接种环（直径约3 mm）：镍铬合金、铂铱或铬线材质，或可抛弃式者。
2.2.16 曲玻棒：可灭菌者，直径3～4 mm，涂抹区域45～55 mm。
2.2.17 试管：10 × 100 mm，13 × 100 mm，13 × 120 mm，15 × 150 mm，16 × 150 mm试管，或其它适用者。
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在肠杆菌的生化鉴定中使用最广泛的是API 20E和Vitek GNI+。
第一部分：一般特征
一．
培养特征
二．
三． 四．
生化反应
抵抗力 增殖能力
与其他常见肠杆菌相似
5
一、培养特征
阪崎肠杆菌兼性厌氧，营养要求不高，能在营养琼脂、血平板、麦康凯(MacConkey， MAC)琼脂、伊红美蓝琼脂、脱氧胆酸琼脂等多种培养基上生长繁殖。
ES在VRBGA平板上首次划线分离时，37℃培养24h可生成2种不同的 形态学特征：
2.
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第一法：阪崎肠杆菌的检验
第二法：阪崎肠杆菌的计数
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第一法 阪崎肠杆菌的检验
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阪崎肠杆菌检验程序
检样 100 g/mL+BPW稀释液 900 mL 36℃±1℃，18 h±2h
1mL + mLST-Vm 10mL 44℃±0.5℃，24 h±2h
DFI琼脂 36℃±1℃，24 h±2h 挑取蓝绿色菌落 TSA 25℃±1℃，48 h±4h 挑取黄色菌落 生化鉴定 报 告 生 化 鉴 定 选择性分离 前 增 菌
选择性增菌
5.1 前增菌和增菌
BPW（合适时可选择无菌水） 左图：未混合； 右图：混合后。
21
mLST-Vm
mLST-Vm，即在大肠菌群增菌肉汤LST中另加入 适量的NaCl和Vm 。
研究证明与其他肠杆菌科细菌（如沙门菌属、大肠埃希氏
菌等）相比，ES具有较高的耐渗透压能力。加入0.5 M 的
NaCl在保证ES良好生长的同时，可以有效地抑制上述其他 细菌的生长。 Vm可有效地抑制G+菌的生长。而较高的生长温度可以进一 步抑制其他细菌的生长。
7
2.
3.
二、生化反应
8
DNASE-脱氧核糖核酸酶
注：＋ ：90-100％；(＋) ：75-89%； V ：25-74％；(－)：10 -24％；－ ：0-9％
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三、抵抗力
耐热性
渗透压
干燥
不同菌株的耐热性存在明显的差别，但标准的巴氏消 毒过程能有效的灭活ES。 ES对渗透压的耐受性使该菌能够成为环境中的优势株， 增加PIF（婴儿配方奶）加工后污染的危险性，使其在PIF （婴儿配方奶） 中长期存活。
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第二部分：致病性
一．
易感人群
二．பைடு நூலகம்
三． 四．
主要感染渠道
配方粉中ES的污染状况 PIF中ES的来源及中毒发生的原因
13
一、易感人群
婴儿：
1. 2. 3.
脑膜炎 坏死性小肠结肠炎 菌血症 严重的神经系统后遗症
高危人群：主要是婴儿，新生儿、尤其是早产儿、低出 生体重等免疫力低下的婴儿。
死亡率：50%，20-50 %
1.
干燥或粘液状、圆锯齿状（凹口或锯齿），用金属环接触时 可发现坚韧或有弹力，即粘贴金属环的菌量很少，并且菌落 可很快恢复。传代培养后可能会转变为典型的光滑菌落。 光滑、易于用金属环从菌落移取细胞。
2.
6
本实验室
1.
大多数分离株呈流蜡样， 粉紫色、圆形、光滑、凸 起、饱满，并散发出特殊 气味； 干燥、顶端发白的粉紫色 菌落； 从配方粉中初次分离到的 该 菌 在 VRBGA 平 板 上 过 夜 培养后呈现特殊的菌落形 态：菌落干燥、边缘有褶 皱，极富弹性。传代后， 菌落皱褶减少，延长培养 时间，可见皱褶逐渐增加。
22
5.2 分离
显色培养基的基本原理相似，二者都是根据ES能产生α-葡萄糖苷
酶，分解底物XaGlc产生有色菌落。
23
显色培养基对 ES 的选择性较好， ES 形成的特征性菌 落易于辨认，以DFI为例：
硫化氢指示剂可以区分ES和产生少量α-葡萄糖苷酶但H2S 阳性菌株（如普通变形杆菌）。
1.
2.
典型ES：黄色
阴性对照E. coli ATCC 25922：白色菌落
27
5.3 鉴定（生化反应）
29
商业生化鉴定系统的应用
推荐使用的ES生化鉴定方法有很多，主要有API 20E，ID 32E，Biolog GN2 MicroPlate，VITEK GNI+等。
上述方法都比较成熟，稳定性较好，已被许多国家和组织的标准采用。
3.
ES都可以在该平板上生长并产生蓝绿色菌落
其他常见菌在DFI平板的菌落颜色
a. 白色菌落：肺炎克雷伯氏菌、阴沟肠杆菌、大肠埃希氏菌、泛 菌属的多种菌等 b. 黄色菌落：赫氏埃希氏菌 c. 黑褐色、粉色或中心蓝绿菌落：少量菌种
• ESIA:蓝色，1-3mm • 国产显色培养基
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26
黄色素 TSA： 25℃培养后
14
二、主要感染渠道 ！！！
乳品安全标准（报批稿）
《婴儿配方食品》 《特殊医学用途配方食品》
0-6个月龄
15
第三部分
食品卫生微生物学检验
阪崎肠杆菌检验
本标准修改采用
1.
ISO/TS 22964 （ 1st edition 2006-02-01 ）Milk and milk products — Detection of Enterobacter sakazakii FDA July 2002; Revised August 2002 Isolation and Enumeration of Enterobacter sakazakii from Dehydrated Powdered Infant Formula
11
四、增殖能力
6℃，21℃，37℃分别是13.7h，1.7h，19－21min
研究发现，与本底相比，25℃ 放置6h 该菌的相对危
险性可增加30倍；25℃放置10h可增加30 000倍。
2004 年 2 月 FAO/WHO 在日内瓦召开的 PIF 中 ES 专家研 讨会上提出 PIF 中微量的 ES （ ＜ 3 CFU/100g ）污染 也能导致感染的发生。
阪崎肠杆菌检验
GB 4789.40--2010
Enterobacter sakazakii(ES)
2
内 容
第一部分：一般特征 第二部分：致病性
第三部分：ES的检验
3
阪崎肠杆菌(E． sakazakii) 是人和动物肠道内寄生的一种革兰阴性无 芽孢杆菌，属肠杆菌科肠杆菌属，是肠道正常菌丛中的一种，在一定 条件下可引起人和动物致病。 阪崎肠杆菌能引起严重的新生儿脑膜炎、小肠结肠炎和菌血症，死亡 率高达50% 以上。目前，微生物学家尚不清楚阪崎肠杆菌的污染来 源，但许多病例报告表明婴儿配方粉是目前发现的主要感染渠道。