GB坂崎肠杆菌检验
食品微生物之检验方法-阪崎肠杆菌之检验
附件食品微生物之檢驗方法－阪崎腸桿菌之檢驗1 適用範圍〆本方法適用於一般食品及奶粉中阪崎腸桿菌之檢驗。
2 檢驗方法〆2.1 工作環境〆工作平台須寬敞、潔淨、光線良好，操作平台光度為100呎燭光以上，密閉室內換氣良好，儘可能沒有灰塵及流動空氣。
每15分鐘落菌數不得超過15 CFU／培養皿。
2.2 器具及材料〆2.2.1 乾熱滅菌器。
2.2.2 高壓滅菌釜。
2.2.3 攪拌均質器（Blender）或鐵胃（Stomacher）〆適用於無菌操作者。
2.2.4 天平〆可稱量到2000 g者，靈敏度為0.1 g々可稱量到120 g者，靈敏度為1 mg。
2.2.5 冰箱〆能維持5 ±3℃者。
2.2.6 吸管或吸管尖〆已滅菌，1 mL吸管應有0.01 mL之刻度々5 mL及10 mL吸管應有0.1 mL之刻度。
2.2.7 吸管輔助器（Pipette aid）或微量分注器。
2.2.8 稀釋瓶〆160 mL，玻璃、聚乙烯（polyethylene）、鐵弗龍（Teflon）或其他能耐121℃濕熱滅菌20分鐘以上之塑膠材質，附螺旋蓋。
2.2.9 培養皿〆已滅菌，內徑約9 cm，深度約15 mm，底皿之內外面應平坦，無氣泡、刮傷或其他缺點。
2.2.10 增菌用容器〆附螺旋蓋之125 mL、250 mL、2 L三角錐瓶或廣口瓶々玻璃、聚乙烯、鐵弗龍或其他能耐121℃濕熱滅菌20分鐘以上之塑膠材質。
2.2.11 pH測定儀。
2.2.12 培養箱〆能維持內部溫度在±1℃以內者。
2.2.13 溫度計〆量測溫度範圍1～55℃，最小刻度0.1℃。
2.2.14 水浴〆加蓋，具水流循環系統，能維持水溫溫差在±0.2℃以內者。
2.2.15 接種針及接種環（直徑約3 mm）〆鎳鉻合金、鉑銥或鉻線材質，或可拋棄式者。
2.2.16 曲玻棒〆可滅菌者，直徑3～4 mm，塗抹區域45～55 mm。
2.2.17 試管〆10 ×100 mm，13 ×100 mm，13 ×120 mm，15 ×150 mm，16 ×150 mm試管，或其他適用者。
阪崎肠杆菌检验技术
生态分类
一、阪崎肠杆菌概况
阪崎肠杆菌属肠杆菌科，是人和动物肠道中寄生的一种革 兰阴性无芽胞杆菌。是肠道正常菌群的一种，在一定条件 下可引起人和动物致病。1980年以前命名为黄色阴沟肠 杆菌，1980年更名为阪崎肠杆菌。
一、阪崎肠杆菌概况
生态分布 家庭、温泉、鼠、苍蝇、植物根围、沉积物，沼泽地、土壤、食品等均有检出阪 崎肠杆菌的报导。有报导推测，昆虫可能是阪崎肠杆菌的环境宿主。 婴儿配方粉的污染： 内在污染：--由加工环境中微生物的存在；加工装置内表面微生物的存在；热处理 后，与干燥基粉混合的加入成分中存在的微生物造成。 外源性污染：--受阪崎肠杆菌污染的配方粉或调制好的配方奶在较高温度下存放， 食用前不加热，或加热不彻底，喂食时间较长等都可导致阪崎肠杆菌有机会生长繁 殖，增加患病的危险性。
三、阪崎肠杆菌菌定量检测
1g(mL)×3
取样量 10g(mL)×3
100g(mL)×3
BPW 1：10 稀释
mLST-Vm
DFI、TSA
生化鉴定
报告 （MPN值）
操作规程
前增菌 选择性增菌 显色培养基 验证试验 结果报告
三、阪崎肠杆菌菌定量检测
各100ml（g)
各10ml（g)
各900ml（g) 各移1ml
900 ml BPW
样品
100mL（g） 溶解 预热
44℃
36±1℃ 18h±2h
选择性增菌 44±0.5℃
24h±2h
10mL mLST-Vm肉汤
挑取蓝绿色菌落
操作规程 API20E鉴定系统
二、阪崎肠杆菌菌定性检测
TSA平板上直接挑取黄色菌 落进行鉴定
结果鉴定
二、阪崎肠杆菌菌定性检测
阪崎肠杆菌检验
第一部分：一般特征
一．培养特征 二．生化反应 三．抵抗力 四．增殖能力
与其他常见肠杆菌相似
5
一、培养特征
阪崎肠杆菌兼性厌氧，营养要求不高，能在营养琼脂、 血平板、麦康凯(MacConkey，MAC)琼脂、伊红美蓝 琼脂、脱氧胆酸琼脂等多种培养基上生长繁殖。
ES在VRBGA平板上首次划线分离时，37℃培养24h可生成2种不同 的形态学特征： 1. 干燥或粘液状、圆锯齿状（凹口或锯齿），用金属环接触时 可发现坚韧或有弹力，即粘贴金属环的菌量很少，并且菌落 可很快恢复。传代培养后可能会转变为典型的光滑菌落。 2. 光滑、易于用金属环从菌落移取细胞。
阪崎肠杆菌检验
GB 4789.40--2010
Enterobacter sakazakii(ES)
2
内
容
第一部分：一般特征 第二部分：致病性 第三部分E．sakazakii)是人和动物肠道内 寄生的一种革兰阴性无芽孢杆菌，属肠杆 菌科肠杆菌属，是肠道正常菌丛中的一种 ，在一定条件下可引起人和动物致病。 阪崎肠杆菌能引起严重的新生儿脑膜炎、小 肠结肠炎和菌血症，死亡率高达50% 以上 。目前，微生物学家尚不清楚阪崎肠杆菌 的污染来源，但许多病例报告表明婴儿配 方粉是目前发现的主要感染渠道。
7
二、生化反应
8
• DNASE-脱氧核糖核酸酶
注：＋ ：90-100％；(＋) ：75-89%； V ：25-74％；(－)：10 -24％；－ ：0-9％
10
三、抵抗力
• 耐热性 • 渗透压 • 干燥
不同菌株的耐热性存在明显的差别，但标准的巴氏消 毒过程能有效的灭活ES。 ES对渗透压的耐受性使该菌能够成为环境中的优势株， 增加PIF（婴儿配方奶）加工后污染的危险性，使其在PIF （婴儿配方奶） 中长期存活。
阪崎肠杆菌检测标准
阪崎肠杆菌检测标准1. 引言阪崎肠杆菌〔Hafnia alvei〕是一种革兰氏阴性菌，属于肠杆菌科。
它在自然环境中广泛存在，也可以在人和动物的消化道内找到。
阪崎肠杆菌可以对人类和动物造成感染，引起各种疾病，如泌尿系统感染、呼吸道感染和胃肠道感染等。
为确保食品和饮用水的平安，阪崎肠杆菌的检测标准十分重要。
2. 检测方法2.1 阪崎肠杆菌的培养方法阪崎肠杆菌可以在一般细菌培养基上生长，常用的培养基包括MacConkey琼脂培养基和Eosin Methylene Blue〔EMB〕琼脂培养基。
培养时一般在37°C下孵育24-48小时。
2.2 阪崎肠杆菌的生化检测阪崎肠杆菌可以通过一系列的生化反响进行检测和鉴定。
常用的生化试验包括氧化/发酵葡萄糖试验〔O/F试验〕和酮糖酸盐〔Voges-Proskauer〕试验等。
2.3 阪崎肠杆菌的PCR检测PCR〔聚合酶链式反响〕是一种常用的分子生物学方法，可以快速、准确地检测阪崎肠杆菌。
通过特定的引物在PCR反响中扩增阪崎肠杆菌的DNA片段，然后通过凝胶电泳进行检测和鉴定。
3. 检测标准3.1 食品中阪崎肠杆菌的检测标准根据国家食品平安标准，食品中阪崎肠杆菌的检测标准如下： - 生肉制品：阪崎肠杆菌在每克样品中不得超过10 CFU； - 加工食品：阪崎肠杆菌在每克样品中不得超过100 CFU； - 饮用水：阪崎肠杆菌在每100毫升样品中不得检出。
3.2 环境中阪崎肠杆菌的检测标准根据环境保护标准，阪崎肠杆菌的检测标准如下： - 水质：阪崎肠杆菌在每升水样中不得超过100 CFU； - 空气：阪崎肠杆菌在每立方米空气中不得超过100 CFU； - 土壤：阪崎肠杆菌在每克土壤样品中不得超过1000 CFU。
4. 检测流程4.1 样品采集从食品、饮用水或环境样品中采集足够数量的样品。
使用无菌容器收集，并确保样品处于最正确的保存条件。
4.2 样品处理将采集的样品经过适当的处理，在无菌条件下进行前处理，如制备悬浮液或稀释样品。
GB坂崎肠杆菌检验
2024/6/19 即：不能观察到ES的特征性菌落。
15
显色培养基的选择性较好
• DFI对ES的选择性较好，ES形成的蓝绿色特征性菌落 易于辨认，而且：
硫化氢指示剂可以区分ES和产生少量α-葡萄糖苷酶但H2S阳 性菌株（如普通变形杆菌）。
ES都可以在DFI平板上生长并产生蓝绿色菌落 其他常见菌在DFI平板的菌落颜色
2024/6/19
4
二、培养特征
• G－无芽孢杆菌，兼性厌氧，在6℃-47℃范 围内均可生长，适温35-37℃
• 营养要求不高： VRBGA、TSA、NA、MAC、EMB、其他
与其他常见肠杆菌相似
2024/6/19
5
三、生化反应
生化反应 D-山梨醇 产生吐温80脂酶 细胞外Dnase 氧化酶试验 黄色菌落 α-葡萄糖苷酶
Enterobacter sakazakii(ES)
2024/6/19
1
内容
第一部分：一般特征 第二部分：流行病学特征 第三部分：ES的检验
2024/6/19
2
第一部分：一般特征
命名 培养特征 生化反应 抵抗力 增殖能力 致病性
2024/6/19
3
一、命名
1980年之前一直被称为黄色阴沟肠杆菌。 • DNA-DNA杂交 • 生化反应 • 黄色素 • 抗生素敏感性
2024/6/19
27
API 20E生化鉴定板典型生化反应图示
API 20E反应编码 3345 373 3305 173 3305 363 3305 373
API 20E结果评价 Excellent identification Excellent identification Very good identification
阪崎肠杆菌检测标准
阪崎肠杆菌检测标准阪崎肠杆菌（Enterobacter sakazakii）是一种常见的致病菌，它可以存在于环境中的多种食品和饮用水中。
由于其对婴儿和免疫系统较弱者具有较高的致病性，因此对阪崎肠杆菌的检测标准显得尤为重要。
本文将介绍阪崎肠杆菌检测的相关标准，以便从事食品生产和检验的相关人员了解和遵循。
首先，阪崎肠杆菌的检测应该遵循国家相关的标准和规定，如《食品安全国家标准食品中阪崎肠杆菌的检验》（GB 4789.41-2016）。
该标准规定了食品中阪崎肠杆菌的检测方法和技术要求，包括样品的采集、处理、培养和鉴定等步骤。
在进行检测时，应当严格按照标准的要求进行操作，以确保检测结果的准确性和可靠性。
其次，阪崎肠杆菌的检测需要使用合适的检测方法和设备。
常见的检测方法包括PCR法、免疫学方法、生化方法等。
在选择检测方法时，应根据实际情况和样品的特点进行合理的选择，以确保检测的准确性和灵敏度。
同时，应使用经过认证的检测设备和试剂，确保其质量和性能符合要求。
另外，阪崎肠杆菌的检测还需要严格控制检测过程中可能存在的污染和干扰因素。
在样品采集、处理和检测过程中，应避免外部环境的污染，确保样品的纯净性和可靠性。
同时，应严格控制实验室环境和操作流程，避免可能对检测结果产生干扰的因素存在。
最后，阪崎肠杆菌的检测结果应当进行合理的解读和评估。
在获得检测结果后，应根据标准的要求进行结果的解读和评估，判断样品中阪崎肠杆菌的存在情况和数量水平。
同时，应根据检测结果进行合理的风险评估和控制措施制定，以保障食品安全和公共健康。
总之，阪崎肠杆菌的检测标准对于食品安全和公共健康具有重要意义。
相关从业人员应当严格遵循国家标准和规定，选择合适的检测方法和设备，严格控制检测过程中的污染和干扰因素，合理解读和评估检测结果，以确保食品的安全和可靠性。
希望本文能够为相关人员提供一定的参考和帮助，促进阪崎肠杆菌检测工作的规范和标准化。
阪崎肠杆菌
目前，微生 物学家尚不 清楚阪崎肠 杆菌的污染 来源，但许 多病例报告 表明婴儿配 方粉是目前 发现的主要 感染渠道。
阪崎肠 杆菌是 乳制品 中近几 年新发 现的一 种致病 菌。
阪崎肠杆菌
阪崎肠杆菌在自然界分布广泛，繁殖迅速，但不耐热， 可通过巴斯德消毒法杀灭。阪崎肠杆菌属条件致病菌， 在一般情况下，不对人体健康产生危害，但对于免疫 力低下者和婴幼儿、新生儿，尤其是早产儿、低体重 儿可以致病。感染来源主要是受阪崎肠杆菌污染的奶 粉，人与人之间无传染性。
培养基和试剂
1、缓冲蛋白胨水BPW（略） 2、改良月桂基硫酸盐以蛋白胨肉汤-万古霉素 （mlST-Vm）
• 成分和配置方法详见GB/T 4789.40-2010 附录A2。
加入万古霉素的目的是抑制革兰氏阳性菌等杂 菌的生长。
注意：新鲜配置的mLST-Vm应该在24h内使用， 万古霉素溶液可在在0 ℃～5 ℃保存15 天。
注意：要避光4℃保存。
阪崎肠杆菌显色培养基DFI
微生物
菌落颜色
• 阪崎肠杆菌 • 大肠杆菌 • 金黄色葡萄球菌
蓝绿色 无色菌落 被抑制不生长
培养基和试剂
• 4 、胰蛋白胨大豆琼脂（trypticase soy agar， TSA）：见附录A 中A.3。
• 5 、生化鉴定试剂盒。 • 6、 氧化酶试剂：见附录A 中A.4。 • 7、 L-赖氨酸脱羧酶培养基：见附录A 中A.5。 • 8 、L-鸟氨酸脱羧酶培养基：见附录A 中A.6。 • 9 、L-精氨酸双水解酶培养基：见附录A 中A.7。 • 10、 糖类发酵培养基：见附录A 中A.8。 • 11 、西蒙氏柠檬酸盐培养基：见附录A 中A.9。
阪崎肠杆菌的生理生化特征 报》 2006年06期 《阪 崎肠杆菌的生物学特性及 其检测技术》
牛奶中阪崎肠杆菌的检测方法
牛奶中阪崎肠杆菌的检测方法引言：阪崎肠杆菌（又称阪崎氏肠杆菌）是一种周身无鞭毛，能运动，无芽孢的兼性厌氧菌，革兰氏阴性杆菌。
1980年由黄色阴沟肠杆菌更名为阪崎肠杆菌。
阪崎肠杆菌能引起严峻的新生儿脑膜炎、小肠结肠炎和菌血症，致死率可达40％～80%，自1961年首次由阪崎肠杆菌引起的新生儿脑膜炎之后，全球范围间续消失感染大事，丹麦、希腊、英国、荷兰、冰岛等国均有报道。
其严峻性已引起世界多国相关部门的重视，阪崎肠杆菌已被世界卫生组织和很多国家确定为引起婴儿死亡的重要条件致病菌。
我国也于2021年5月20日通过了《奶粉中阪崎肠杆菌检测方法》行业标准，并于同年10月实施，我国《婴儿配方食品》和《幼儿配方食品》相关标准规定婴幼儿配方奶粉、食品中禁止检出阪崎肠杆菌等致病菌。
一、阪崎杆菌的生物学特性1 形态染色阪崎肠杆菌属肠杆菌科肠杆菌属, 因此本菌具备肠杆菌基本形态特征: 革兰阴性粗短杆菌，有周身菌毛, 无芽胞, 有动力[1] 。
2 培育特性能在一般养分琼脂、血平板、麦康凯(MAC) 琼脂、伊红美兰(EMB) 琼脂、脱氧胆酸琼脂等多种培育基上生长繁殖。
培育最佳温度25 ～36 ℃ , 在6～45 ℃下都能生长, 某些菌株可在47 ℃下生长[8] 。
在胰蛋白胨琼脂(TSA) 、脑心浸液琼脂(BH I) 及血平板上经25 ～36 ℃培育24 h 后, 形成1. 5 ～2. 5mm, 黄色菌落。
在结晶紫中性红胆盐葡萄糖琼脂(VRBG) 能产生紫红色菌落[2]。
二、阪崎杆菌的传统检测方法阪崎肠杆菌检验程序见图1。
1 基本步骤如下：取检样100g（mL）加入已预热至44℃装有900mL缓冲蛋白胨水的锥形瓶中，用手缓缓地摇动至充分溶解，36℃1℃培育18 h2h。
移取1mL 转种于10mL mLST-Vm肉汤，44℃0.5 ℃培育24 h2h。
轻轻混匀mLST-Vm 肉汤培育物，各取增菌培育物1环，分别划线接种于两个阪崎肠杆菌显色培育基平板，36℃1℃培育18 h2 h。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
2021/2/26
GB坂崎肠杆菌检验
13
显色培养基的特点
-葡萄糖苷酶活性
指示剂：
1. 5-溴-4-氯-3-吲哚-，D-吡喃葡糖甙（XGlc） 2. 4-甲基伞形酮--D-葡糖苷（-MUG） 3. 4-邻硝基苯--D-吡喃葡糖甙
2021/26
GB坂崎肠杆菌检验
3
第一部分：一般特征
一．命名 二．培养特征 三．生化反应 四．抵抗力 五．增殖能力 六．致病性
2021/2/26
GB坂崎肠杆菌检验
4
一、命名
1980年之前一直被称为黄色阴沟肠杆菌。 • DNA-DNA杂交 • 生化反应 • 黄色素 • 抗生素敏感性
2021/2/26
GB坂崎肠杆菌检验
5
二、培养特征
• G－无芽孢杆菌，兼性厌氧，在6℃-47℃范 围内均可生长，适温35-37℃
• 营养要求不高： VRBGA、TSA、NA、MAC、EMB、其他
与其他常见肠杆菌相似
2021/2/26
GB坂崎肠杆菌检验
6
三、生化反应
生化反应
D-山梨醇 产生吐温80脂酶
细胞外Dnase 氧化酶试验 黄色菌落 α-葡萄糖苷酶
结果
+ + + +
2021/2/26
GB坂崎肠杆菌检验
7
ES及亲缘关系较近的肠杆菌生化反应比较
生化反应1
试验
阪崎 肠杆菌
阴沟 肠杆菌
产气 肠杆菌
成团 肠杆菌
日勾维 肠杆菌
赖氨酸脱羧酶 精氨酸双水解酶 鸟氨酸脱羧酶 KCN生长 发酵:
蔗糖
－
－
＋
－
＋
＋
＋
－
－
－
＋
＋
＋
－
＋
＋
＋
＋
v
＋
＋
＋
＋
(＋)
＋
卫矛醇
－
17
选择性增菌肉汤的选择
• FDA方法选择EE肉汤，ISO方法选择mLST-Vm ，即在LST中加入Nacl和Vm。本标准使用 mLST-Vm。
• EE肉汤适合所有肠道菌群的生长繁殖，这就可能 对ES的生长产生竞争性抑制作用，降低检出率。
• 研究证明与其他肠杆菌科细菌（如沙门氏菌，大 肠埃希氏菌等）相比，ES具有较高的耐渗透压能 力。加入0.5M的Nacl在保证ES良好生长的同时 ，可以有效地抑制上述其他细菌的生长。
团肠杆菌等多种肠道菌都可以在该平板上生长并
产生粉紫色菌落，胆汁酸沉淀形成紫色晕圈。
2021/2/26
GB坂崎肠杆菌检验
16
显色培养基的选择性较好
• DFI对ES的选择性较好，ES形成的蓝绿色特征性菌落 易于辨认，而且：
1. 硫化氢指示剂可以区分ES和产生少量α-葡萄糖苷酶但H2S阳 性菌株（如普通变形杆菌）。
• Vm可有效地抑制G+菌的生长。而较高的生长温 度可以进一步抑制其他细菌的生长。
2021/2/26
GB坂崎肠杆菌检验
二、食品卫生微生物学检验 阪崎肠杆菌检验
2021/2/26
GB坂崎肠杆菌检验
19
本标准修改采用
1. ISO/TS 22964 （ 1st edition 2006-02-01 ） Milk and milk products — Detection of Enterobacter sakazakii
2. FDA July 2002; Revised August 2002 Isolation and Enumeration of Enterobacter sakazakii from Dehydrated Powdered Infant Formula
GB坂崎肠杆菌检验
主要内容
一、制订的主要依据 二、《食品卫生微生物学检验 阪崎肠杆菌检验》
2021/2/26
GB坂崎肠杆菌检验
10
制订的主要依据
1. ISO 2006年“乳和乳制品中阪崎肠杆菌的检测”（Milk and milk products—Detection of Enterobacter sakazakii）方法；
• 本标准与GB/T 4789.40-2008 相比，主要变 化如下：
• ——修改了标准的中英文名称； • ——删除了附录A 中A.3。
GB坂崎肠杆菌检验
Enterobacter sakazakii(ES)
2021/2/26
GB坂崎肠杆菌检验
2
内容
第一部分：一般特征 第二部分：流行病学特征 第三部分：ES的检验
4. 雀巢研究中心2005年环境样品中阪崎肠杆菌快速检测方法； 5. 阪崎肠杆菌快速检测培养基DFI研究资料。
GB坂崎肠杆菌检验
• SN第一部分：分离与计数方法 第二部分：PCR方法 第三部分：荧光PCR方法
GB坂崎肠杆菌检验
常见选择性培养基
• DFI (Oxoid, UK) • ESIA (AES, France) • R＆F（R&F Laboratories，Switzerland） • OK medium • 其他：国内阪崎肠杆菌显色培养基、CES (Merck,
2021/2/26
GB坂崎肠杆菌检验
15
选择性培养基的选择
1. FDA方法使用VRBGA，ISO 方法中使用ESIA， 本方法中我们选用DFI。
2.ESIA和DFI的基本原理相似，二者都是根据ES能 产生α-葡萄糖苷酶，分解底物XaGlc产生有色菌 落。
3.VRBGA对ES的选择性差，ES、阴沟肠杆菌和成
(－)
－
(－)
－
核糖醇
－
(－)
＋
－
－
棉子糖
＋
＋
＋
v
＋
D-山梨醇
－
＋
＋
v
－
χ-甲基-葡萄糖甙
＋
(＋)
－
－
－
D-阿拉伯糖醇
－
(－)
＋
－
＋
黄色素
＋
－
－
(＋)
－
注：＋ ：90-100％；(＋) ：75-89%； V ：25-74％；(－)：10 -24％；－ ：0-9％
第三部分 食品卫生微生物学检验
阪崎肠杆菌检验
2. ES都可以在DFI平板上生长并产生蓝绿色菌落
3. 其他常见菌在DFI平板的菌落颜色
a. 白色菌落：肺炎克雷伯氏菌、阴沟肠杆菌、大肠埃希氏 菌、泛菌属的多种菌等
b. 黄色菌落：赫氏埃希氏菌
c. 黑褐色、粉色或中心蓝绿菌落：少量菌种
• ESIA:蓝色，1-3mm
2021/2/26
GB坂崎肠杆菌检验
2. 美国FDA 2002年颁布的“婴儿配方粉中阪崎肠杆菌的分离和 计数”（Isolation and Enumeration of Enterobacter sakazakii from Dehydrated Powdered Infant Formula）方法；
3. 2004年荷兰乳及乳制品控制中心对各种阪崎肠杆菌检测方法 的比较研究；