食品中阪崎肠杆菌原始记录
食品微生物之检验方法-阪崎肠杆菌之检验
附件食品微生物之檢驗方法－阪崎腸桿菌之檢驗1 適用範圍〆本方法適用於一般食品及奶粉中阪崎腸桿菌之檢驗。
2 檢驗方法〆2.1 工作環境〆工作平台須寬敞、潔淨、光線良好，操作平台光度為100呎燭光以上，密閉室內換氣良好，儘可能沒有灰塵及流動空氣。
每15分鐘落菌數不得超過15 CFU／培養皿。
2.2 器具及材料〆2.2.1 乾熱滅菌器。
2.2.2 高壓滅菌釜。
2.2.3 攪拌均質器（Blender）或鐵胃（Stomacher）〆適用於無菌操作者。
2.2.4 天平〆可稱量到2000 g者，靈敏度為0.1 g々可稱量到120 g者，靈敏度為1 mg。
2.2.5 冰箱〆能維持5 ±3℃者。
2.2.6 吸管或吸管尖〆已滅菌，1 mL吸管應有0.01 mL之刻度々5 mL及10 mL吸管應有0.1 mL之刻度。
2.2.7 吸管輔助器（Pipette aid）或微量分注器。
2.2.8 稀釋瓶〆160 mL，玻璃、聚乙烯（polyethylene）、鐵弗龍（Teflon）或其他能耐121℃濕熱滅菌20分鐘以上之塑膠材質，附螺旋蓋。
2.2.9 培養皿〆已滅菌，內徑約9 cm，深度約15 mm，底皿之內外面應平坦，無氣泡、刮傷或其他缺點。
2.2.10 增菌用容器〆附螺旋蓋之125 mL、250 mL、2 L三角錐瓶或廣口瓶々玻璃、聚乙烯、鐵弗龍或其他能耐121℃濕熱滅菌20分鐘以上之塑膠材質。
2.2.11 pH測定儀。
2.2.12 培養箱〆能維持內部溫度在±1℃以內者。
2.2.13 溫度計〆量測溫度範圍1～55℃，最小刻度0.1℃。
2.2.14 水浴〆加蓋，具水流循環系統，能維持水溫溫差在±0.2℃以內者。
2.2.15 接種針及接種環（直徑約3 mm）〆鎳鉻合金、鉑銥或鉻線材質，或可拋棄式者。
2.2.16 曲玻棒〆可滅菌者，直徑3～4 mm，塗抹區域45～55 mm。
2.2.17 試管〆10 ×100 mm，13 ×100 mm，13 ×120 mm，15 ×150 mm，16 ×150 mm試管，或其他適用者。
食品克罗诺杆菌属(阪崎肠杆菌)检验原始记录
食品克罗诺杆菌属（阪崎肠杆菌）检验原始记录样品编号：检验开始时间：年月日样品名称：检验完成时间：年月日检测项目：克罗诺杆菌属（阪崎肠杆菌）检测依据：GB 4789.40-2016 第一法 第二法一、克罗诺杆菌属定性检验无菌操作称（量）取样品100g或ml置于灭菌锥形中，加入900mL已预热至44℃的缓冲蛋白胨水，摇动充分溶解，36±1℃培养18±2h，移取1mL转种于10mLST-Vm肉汤，44±0.5℃培养24±2h。
轻轻混匀培养物，各取1环，分别划线于两个阪崎杆菌显色培养基平板，36±1℃培养24±2h。
挑取可疑菌落，划线于TSA平板，25±1℃培养48±4h。
观察，挑取可疑菌落进行生化鉴定。
二、克罗诺杆菌属平板计数法无菌操作称（量）取样品100g（ml）、10g（ml）、1g（ml）置于灭菌锥形中，加入900mL、90mL、9mL已预热至44℃的缓冲蛋白胨水，摇动充分溶解，36±1℃培养18±2h，移取1mL转种于10mLST-Vm肉汤，44±0.5℃培养24±2h。
轻轻混匀培养物，各取1环，分别划线于两个阪崎杆菌显色培养基平板，36±1℃培养24±2h。
挑取可疑菌落，划线于TSA平板，25±1℃培养48±4h。
挑取可疑菌落进行生化鉴定。
注：+生长或有可疑菌落；-未生长或无可疑菌落。
计算及结果：定性检验：得100g(mL) 计数法，查MPN检索表，得MPN/g,mL电子天平编号：使用状况试验前：试验后：培养箱编号：使用状况试验前：试验后：检测人：校核人：审核人：。
阪崎肠杆菌污染途径
• 检验流程: ①接种缓冲蛋白胨水 : • ②mLST增菌24h • ③接种DFI培养基,37℃，培养 24h • ④接种API20NE
1.3 分离方法 DFI显色培养基上阪崎肠杆菌的菌落特征 显色培养基上阪崎肠杆菌的菌落特征 显色培养基上
蓝绿色菌落
1.3 分离方法
E. sakazakii 的API 20E结果 结果
• 样品修复培养（前增菌）： 样品修复培养（前增菌）：无菌称取100g乳粉加 ）： 入500ml预热45℃BP中，混匀，经36℃±1℃培 养18-24h。 • 样品肠道增菌培养 样品肠道增菌培养：移取10ml 加入90mlEE肉 汤中，于36℃±1℃培养18-24h。 • 样品分离培养：取EE增菌肉汤培养物1环，分别 样品分离培养： 划线接种EMB、MacConKey、 SorbitolMacConKey琼脂平板各1块，置 36℃±1℃培养18-24h。观察3种平板上的菌落 形态及不同的生物学特性反应及其差异比较。
DFI培养基存在的问题 培养基存在的问题
更快的检测方法? 更快的检测方法
• PCR • Q-PCR
DFI培养基存在的问题 培养基存在的问题
荧光PCR结果 结果 荧光
1.4其他肠杆菌属的检验 其他肠杆菌属的检验
• E-M-S法 • 所需培养基： • EMB • MacConKey • SorbitolMacConKey
1.3 分离方法 美国FDA 法 – 2002年 美国 年
• 对加拿大法进行了修改:
– 从10毫升接种到 毫升肠杆菌增菌肉汤（EE）。 毫升接种到90毫升肠杆菌增菌肉汤 毫升接种到 毫升肠杆菌增菌肉汤（ ）。 孵育过夜而不是直接涂布 平板. 在36oC孵育过夜而不是直接涂布 VRBG 平板 孵育过夜 – 可疑菌落接种 可疑菌落接种TSA 并在 oC 培养 48-72 hours. 并在25 – 只有产黄色色素的菌落进行 API 20E system实验 实验. 实验
关于婴幼儿奶粉中检出阪崎肠杆菌
关于婴幼儿奶粉中检出阪崎肠杆菌摘要】目的：对本市某品牌的婴幼儿配方奶粉进行阪崎肠杆菌检验，从而发现婴幼儿奶粉中所含的阪崎肠杆菌含量。
方法：选自2011年-2013年间，从我市各级市场购买的某品牌国产婴幼儿配方奶粉15份，对采集的15份市售婴幼儿配方奶粉进行菌落总数、大肠菌群及阪崎肠杆菌的检测。
结果：发现所选取的15份奶粉中，检验出5株阪崎肠杆菌。
结论：通过主要检验手段发现，检验的标准对建立降低婴幼儿配方奶粉的风险具有十分重要的意义。
【关键词】婴幼儿配方奶粉阪崎肠杆菌【中图分类号】R155.5 【文献标识码】A 【文章编号】1672-5085（2014）07-0031-02【Abstract】Objective: On a certain brand of infant formula milk powder in the city of Enterobacter sakazakii inspection，Enterobacter sakazakii and found that the content of infant milk powder，Method：From the 2011 -2013 years A domestic brand of infant formula milk powder 15 parts purchased from my suburban supermarket，The acquisition of the 15 commercial infant formula Detection of milk powder for aerobic bacterial count, coliform and Enterobacter sakazakii。
Bear fruit：15 samples of milk powder found in the selected，Test of 5 strains of Enterobacter sakazakii，Conclusion：The main test method，Very important to have the risk of infant formula milk powder was reduced inspection standard significance。
食品中阪崎肠杆菌原始记录
PITC/JJ01-WJ-0005/1-1食品中阪崎肠杆菌原始记录样品编号：样品名称：样品状态：□定型包装□散装□液态□固态收样日期：检验日期：检验项目/方法：阪崎杆菌GB 4789.40-2010仪器设备：恒温箱（36℃）PITC-411WJ-148 恒温箱（44.5℃）PITC-403WJ-140恒温箱（30℃）PITC-221WJ-104 恒温箱（26℃）PITC-221WJ-104 ATB微生物鉴定仪PITC-171步骤过程结果前增菌阳对：□NG □G 取检g/mL加入900mL以预热44℃的缓冲蛋白胨水增菌液中混匀℃培养h空白：□NG □G样品-1：□NG □G样品-2：□NG □G样品-3：□NG □G样品-4：□NG □G样品-5：□NG □G增菌阳对：□NG □G 移取1mL处理液转种于10mL mLST-Vm肉汤℃培养h空白：□NG □G样品-1：□NG □G样品-2：□NG □G样品-3：□NG □G样品-4：□NG □G样品-5：□NG □G分离分别划线接种2个阪崎显色平板℃培养h阳对：□NG □G空白：□NG □G 样品-1：□NG □G典型菌落特征按照产品说明进行判定。
样品-2：□NG □G样品-3：□NG □G样品-4：□NG □G样品-5：□NG □G挑取1~5个可疑菌落划线接种于TSA平板℃培养h阳对：□NG □G空白：□NG □G 样品-1：□NG □G典型菌落为黄色菌落。
样品-2：□NG □G样品-3：□NG □G样品-4：□NG □G样品-5：□NG □G生化鉴定结果报告（每100g或每100 mL）样品-1样品-2样品-3样品-4样品-5□ND □D□ND □D□ND □D□ND □D□ND □D注：G生长 NG不生长 D检出 ND 未检出检验者：校核者：完成日期：。
阪崎肠杆菌微生物检测原始记录表-
受控编号：
阪崎肠杆菌检测原始记录表
检测项目：☑阪崎肠杆菌检测依据：☑GB 4789.40-2016
样品状态：□液态☑固态□完好□已开封□其他：检测日期： 2023.12.4-12.6 环境条件： 25 ℃ 47 ％ RH
存放条件：□室温□冷藏☑冷冻检测仪器：☑生化培养箱WTHF1010A1-002 □电热恒温培养箱 WTHK1001A-1001
样品处理：1.阪崎肠杆菌检验平板法：操作称取100g（ml）样品，加入900mL已预热至44℃的缓冲蛋白胨水中，缓缓摇动充分混匀，置36℃恒温培养18h，移取上述增菌液1mL接种至10mL ST-Vm肉汤中，置44℃恒温培养24h。
2.阪崎肠杆菌检验MPN法:称取样品100g、10g、1g各三份,分别加入900mL、90mL、9mL已预热至44℃的BPW,轻轻振摇使充分溶解,制成1∶10样品匀液,选取合适的梯度试验，置36℃±1℃培养18h±2h。
分别移取1mL转种于10mLmLST-Vm 肉汤,44℃±0.5℃培养24h±2h。
委托单编号：
备注：1.“+”表示选择性平板上有可疑或典型菌落生长或生化试验呈阳性，“-”表示选择性平板上无可疑或典型菌落生长或生化试验呈阴性。
2.“ND”表示未检出。
检验员：复核人：审核人：。
GB478940坂崎肠杆菌检验
TSA 25℃±1℃，48h±4h
挑取黄色菌落 生化鉴定 报告
生化鉴定
5.1 前增菌和增菌
加样入已预 热到44℃的
BP中左图：Leabharlann 混合； 右图：混合后。25
5.2 分离
DFI 36℃±1℃ 24 h±2h
26
黄色素
TSA： 25 ℃培养后 典型ES：黄色
阴性对照E. coli ATCC 25922：白色菌落
• 营养要求不高： VRBGA、TSA、NA、MAC、EMB、其他
与其他常见肠杆菌相似
7
三、生化反应
生化反应 D-山梨醇 产生吐温80脂酶 细胞外Dnase 氧化酶试验 黄色菌落 α-葡萄糖苷酶
结果 + + + +
8
ES及亲缘关系较近的肠杆菌生化反应比较
生化反应1
试验
阪崎 肠杆菌
阴沟 肠杆菌
产气 肠杆菌
Germany)，NA+ -MUG
14
显色培养基的特点
-葡萄糖苷酶活性
指示剂：
1. 5-溴-4-氯-3-吲哚-，D-吡喃葡糖甙（XGlc） 2. 4-甲基伞形酮--D-葡糖苷（-MUG） 3. 4-邻硝基苯--D-吡喃葡糖甙
15
16
选择性培养基的选择
1. FDA方法使用VRBGA，ISO 方法中使用ESIA， 本方法中我们选用DFI。
2. 美国FDA 2002年颁布的“婴儿配方粉中阪崎肠杆菌的分离和 计数”（Isolation and Enumeration of Enterobacter sakazakii from Dehydrated Powdered Infant Formula）方法；
奶粉中阪崎肠杆菌分离鉴别方法研究
*基金项目:国家质量监督检疫总局科研项目(2004IK097)作者单位:中国检验检疫科学研究院食品安全研究所,北京100025作者简介:赵贵明(1963-),男,山西人,研究员,学士,研究方向:食品微生物检验技术研究。
文章编号:1001-0580(2006)02-0207-02 中图分类号:R 378.2 文献标识码:B=实验研究>奶粉中阪崎肠杆菌分离鉴别方法研究*赵贵明,袁飞,陈颖,黄文胜,刘沛,张旭阪崎肠杆菌(Enter obacter sakaz akii )可引发婴儿、早产儿脑膜炎、败血症及坏死性结肠炎,散发和暴发病例在全球范围均有报道11~32。
国际相关组织认为,奶粉中的阪崎肠杆菌与沙门菌一样,是导致幼儿感染、死亡的主要原因,已有报道从婴幼儿配方奶粉中检出阪崎肠杆菌13,42。
因此,有效地从奶粉中分离阪崎肠杆菌,准确鉴别尤为重要,本文根据所有阪崎肠杆菌菌株均产生A -葡萄苷酶的原理152,在营养琼脂中添加5-溴-4-氯-3-吲哚-A -葡萄苷作为底物,月桂基硫酸盐作为抑制剂,制成改良显色培养基,检测80份市售奶粉,同时使用肠杆菌科细菌生化鉴定试剂(AP I20E),对可疑菌株进行鉴别并分析遇到的问题。
现报告如下。
1 材料与方法111 材料 (1)标准菌珠:大肠埃希菌44104,产气肠杆菌45103,阴沟肠杆菌45301,奇异变形杆菌49005,普通变形杆菌49027,鼠伤寒沙门氏菌51315,弗氏柠檬酸杆菌11732,肺炎克雷伯菌46114以及金黄色葡萄球菌6株,表皮葡萄球菌9株,均由中国药品生物制品检定所提供;阪崎肠杆菌AT CC 29544;阪崎肠杆菌样品分离株1~4,分离自奶粉样品中。
(2)试剂与培养:肠杆菌增菌肉汤,结晶紫中性红胆盐葡萄糖琼脂(VRBGA,由北京陆桥公司生产);阪崎肠杆菌显色培养基,胰酪胨大豆胨琼脂(T SA ),由本实验室配制;A PI20E(梅里埃公司)。
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PITC/JJ01-WJ-0005/1-1
食品中阪崎肠杆菌原始记录
样品编号：样品名称：
样品状态：□定型包装□散装□液态□固态
收样日期：检验日期：
检验项目/方法：阪崎杆菌GB 4789.40-2010
仪器设备：恒温箱（36℃）PITC-411WJ-148 恒温箱（44.5℃）PITC-403WJ-140
恒温箱（30℃）PITC-221WJ-104 恒温箱（26℃）PITC-221WJ-104 ATB微生物鉴定仪PITC-171
步骤过程结果
前增菌
阳对：□NG □G 取检g/mL加入
900mL以预热44℃的缓
冲蛋白胨水增菌液中混
匀℃培养h
空白：□NG □G
样品-1：□NG □G
样品-2：□NG □G
样品-3：□NG □G
样品-4：□NG □G
样品-5：□NG □G
增菌
阳对：□NG □G 移取1mL处理液转种于
10mL mLST-Vm肉汤
℃培养h
空白：□NG □G
样品-1：□NG □G
样品-2：□NG □G
样品-3：□NG □G
样品-4：□NG □G
样品-5：□NG □G
分离分别划线接种2个阪崎
显色平板
℃培养h
阳对：□NG □G
空白：□NG □G 样品-1：□NG □G典型菌落特征按照产品
说明进行判定。
样品-2：□NG □G
样品-3：□NG □G
样品-4：□NG □G
样品-5：□NG □G
挑取1~5个可疑菌落划线接种于TSA平板
℃培养h
阳对：□NG □G
空白：□NG □G 样品-1：□NG □G典型菌落为黄色菌落。
样品-2：□NG □G
样品-3：□NG □G
样品-4：□NG □G
样品-5：□NG □G
生化鉴定
结果报告（每100g或每100 mL）样品-1样品-2样品-3样品-4样品-5
□ND □D□ND □D□ND □D□ND □D□ND □D
注：G生长 NG不生长 D检出 ND 未检出
检验者：校核者：完成日期：。