阪崎肠杆菌研究进展
阪崎肠杆菌检验技术
生态分类
一、阪崎肠杆菌概况
阪崎肠杆菌属肠杆菌科，是人和动物肠道中寄生的一种革 兰阴性无芽胞杆菌。是肠道正常菌群的一种，在一定条件 下可引起人和动物致病。1980年以前命名为黄色阴沟肠 杆菌，1980年更名为阪崎肠杆菌。
一、阪崎肠杆菌概况
生态分布 家庭、温泉、鼠、苍蝇、植物根围、沉积物，沼泽地、土壤、食品等均有检出阪 崎肠杆菌的报导。有报导推测，昆虫可能是阪崎肠杆菌的环境宿主。 婴儿配方粉的污染： 内在污染：--由加工环境中微生物的存在；加工装置内表面微生物的存在；热处理 后，与干燥基粉混合的加入成分中存在的微生物造成。 外源性污染：--受阪崎肠杆菌污染的配方粉或调制好的配方奶在较高温度下存放， 食用前不加热，或加热不彻底，喂食时间较长等都可导致阪崎肠杆菌有机会生长繁 殖，增加患病的危险性。
三、阪崎肠杆菌菌定量检测
1g(mL)×3
取样量 10g(mL)×3
100g(mL)×3
BPW 1：10 稀释
mLST-Vm
DFI、TSA
生化鉴定
报告 （MPN值）
操作规程
前增菌 选择性增菌 显色培养基 验证试验 结果报告
三、阪崎肠杆菌菌定量检测
各100ml（g)
各10ml（g)
各900ml（g) 各移1ml
900 ml BPW
样品
100mL（g） 溶解 预热
44℃
36±1℃ 18h±2h
选择性增菌 44±0.5℃
24h±2h
10mL mLST-Vm肉汤
挑取蓝绿色菌落
操作规程 API20E鉴定系统
二、阪崎肠杆菌菌定性检测
TSA平板上直接挑取黄色菌 落进行鉴定
结果鉴定
二、阪崎肠杆菌菌定性检测
阪崎肠杆菌_ppt课件
※氧化酶阴性
※过氧化氢酶阳性，并生成黄色菌落
营养成分表
样品
美赞臣 安婴儿婴儿配方奶粉
罐装
配料表： 100%进口奶源配料：乳糖、精炼植物油、浓缩 乳清蛋白、脱脂奶粉、低聚半乳糖（GOS）、 花生四烯酸（ARA）和二十二碳六烯酸（DHA） （来源于单细胞油）、矿物质（碳酸钙、氯化钙、 柠檬酸钾、氯化钾、氯化镁、硫酸亚铁、硫酸锌、 硫酸铜、硫酸锰、亚硒酸钠、碘化钾）、玉米糖 浆固体、维生素（维生素A、维生素D3、维生素 E、维生素C、维生素B1、维生素B2、维生素B6、 维生素B12、维生素K1、胆碱、肌醇、烟酰胺、 叶酸、泛酸、生物素）、牛磺酸、核苷酸、食品 添加剂：磷脂、抗坏血酸棕榈酸酯、氢氧化钙、 碳酸氢钾。
44 ℃±0.5 ℃ 培养24h±2h 。
10 mL mLST-Vm 肉汤
36 ℃±1 ℃培 养24 h±2 h。
各取增菌培养物1 环，分 别划线接种于两个阪崎肠 杆菌显色培养基平板
①前增菌和 增菌
②分离
挑取1 个～5 个可疑菌落，划 线接种于TSA 平板。 25 ℃±1 ℃培养48 h±4 h。
③鉴定
阪崎肠杆菌显色培养基DFI
微生物
菌落颜色
• 阪崎肠杆菌 • 大肠杆菌 • 金黄色葡萄球菌
蓝绿色 无色菌落 被抑制不生长
培养基和试剂
• 4 、胰蛋白胨大豆琼脂（trypticase soy agar， TSA）：见附录A 中A.3。
• 5 、生化鉴定试剂盒。 • 6、 氧化酶试剂：见附录A 中A.4。 • 7、 L-赖氨酸脱羧酶培养基：见附录A 中A.5。 • 8 、L-鸟氨酸脱羧酶培养基：见附录A 中A.6。 • 9 、L-精氨酸双水解酶培养基：见附录A 中A.7
环介导等温扩增技术在食品安全检测领域的应用研究进展
环介导等温扩增技术在食品安全检测领域的应用研究进展范安妮;佘之蕴;张娟;周臣清;梁宇斌【摘要】环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是近年发展起来的一种新型核酸检测技术其采用特异识别靶序列上6个位点的4条引物和一种具有链置换活性的DNA聚合酶,在等温条件下进行核酸扩增,与传统核酸检测技术(PCR法、实时荧光定量PCR法)相比,具有操作简单、特异性强、灵敏度高、可肉眼判读结果等优点核酸检测是食品安全检测技术的一个重要手段,本文综述了LAMP技术在食品微生物检测、转基因成分检测、过敏原成分检测和动物源性成分检测领域的应用研究进展,探讨了LAMP技术在食品检测领域的发展前景,以期为食品快速、高通量检测技术建立提供参考%loop-mediated isothermal amplification(LAMP) is a novel nucleic acid amplification method developed in recent years.The nucleic acid amplification is performed ender isothermal conditions by a set of four specially designed primers and a DNA polymerase with strand displacement pared with the traditional nucleic acid detection technology (PCR and real-time fluorescence quantitative PCR),it has the advantages of easy operation,high specificity,sensitivity and visual interpretation.Nucleic acid detectiou is an important means of food safety detection.This review summarized the application research progresses mainly focused on food safety detection,including food microorganisms testing,genetically modified organisms testing,food allergens testing and food derived ingredients testing.In addition,the perspectives of LAMP in food detectiou were discussed for better and high volume testing in food safety detection.【期刊名称】《食品工业科技》【年(卷),期】2018(039)010【总页数】5页(P330-334)【关键词】环介导等温扩增技术(LAMP);食品安全;检测;核酸扩增【作者】范安妮;佘之蕴;张娟;周臣清;梁宇斌【作者单位】广东产品质量监督检验研究院,广东顺德528300;广东产品质量监督检验研究院,广东顺德528300;广东产品质量监督检验研究院,广东顺德528300;广东产品质量监督检验研究院,广东顺德528300;广东产品质量监督检验研究院,广东顺德528300【正文语种】中文【中图分类】TS207.3核酸扩增是分子生物学研究领域的一项重要技术,目前已广泛应用于医学诊断、食品检测、动植物检验检疫等行业中。
阪崎肠杆菌的研究进展
龙道崎、邹妍、关郁芳、 雷丹丹、边伟、胡鹏
目录
概述
生物学特性
检测方法 致病性 预防和控制
阪崎肠杆菌概述
阪崎肠杆菌(Enterobacter sakazakii)属肠杆菌科， 是人和动物肠道内寄生的一种周生鞭毛、能运动、 无芽孢的革兰氏阴性菌，一直以来被称为黄色阴沟 肠杆菌 (Enterobacter cloacae)，于1980年以日 本细菌学家 Riichi Sakazakii的名字命名。 阪崎肠杆菌能引起严重的新生儿脑膜炎、小肠结肠 炎和败血症，近年来受到了研究者的广泛关注
阪崎肠杆菌的毒力因子可能是一类肠毒素样 化合物。在组织培养过程中一些菌株产生细 胞毒效应，且菌株间的毒力作用有差异。 细菌内毒素（脂多糖），是构成革兰氏阴性 细菌细胞外壁的主要成分。具有热稳定性， 能增加小肠上皮细胞通透性，促使细菌侵入 肠壁中而致病。
Байду номын сангаас防与控制
预防 坚持母乳喂养 选择检查合格的奶粉 开水冲调婴幼儿配方食品，再次食用前应重新加热。 控制 制定婴幼儿配方奶粉中阪崎肠杆菌微生物标准 制定加工、使用和操作婴幼儿配方食品的导则 制定有效的环境监测计划 建立实验室监测网络，对阪崎肠杆菌的来源、传播途径 等进行调查研究
阪崎肠杆菌的致病性
阪崎肠杆菌是存在自然环境中的一种
“条件致病菌”，由其引发的危害人群 主要是婴儿以及早产儿。偶尔还可引起 成人局部感染。
阪崎肠杆菌能引起严重的新生儿脑膜炎、
菌血症和坏死性小肠结肠炎，并可能遗 留严重的神经系统后遗症，死亡率20 ％～50％。
阪崎杆菌的致病性
致病机制研究不多，尚不清楚。 目前所知阪崎肠杆菌致病性可能与肠毒素和内毒 素有关
LAMP法和PCR法对阪崎肠杆菌快速检测的对比探究
LAMP法和PCR法对阪崎肠杆菌快速检测的对比探究作者：颜学伟来源：《中外医学研究》2013年第05期【摘要】目的：研究LAMP法和PCR法在阪崎肠杆菌快速检测中的差异，指导临床在阪崎肠杆菌快速检测中方法的选择。
方法：针对阪崎肠杆菌的OmpA基因，设计相关特异性引物，分别建立LAMP法和PCR法两种检测方法体系对其进行检测，并对两种检测方法的灵敏度进行记录比较；分别采用两种方法对45株阪崎肠杆菌近源菌进行检测，分析比较两种方法的特异性；最后采用两种方法对60份商场奶粉样品进行检测，将检测结果与FDA检测结果进行比较分析。
结果：两种检测方法的灵敏度检测结果显示：LAMP法对阪崎肠杆菌快速检测的敏感度（101 cfu/ml）明显高于PCR法（102 cfu/ml），两者比较差异有统计学意义（P【关键词】 LAMP； PCR；阪崎肠杆菌中图分类号 R33 文献标识码 A 文章编号 1674-6805（2013）5-0001-02阪崎肠杆菌是肠杆菌科的一种，是奶粉（乳）制品中新发现的一种致病菌。
由其可引发婴儿各种疾病，致病机制可能与其侵入、诱导凋亡及肠毒素作用有关[1]。
对于阪崎肠杆菌的检测，最新研究发现LAMP法对阪崎肠杆菌快速检测，灵敏度高、特异性强[2]。
笔者所在医院应用LAMP法和PCR法对阪崎肠杆菌快速检测的进行对比探究，现报道如下。
1 资料与方法1.1 菌株标本所研究的菌株共60株，其中2株阪崎肠杆菌标准菌株是由广东省微生物研究所提供的ATCC51329和ATCC29544，8株阪崎肠杆菌野生菌株是采用FDA传统手段从商场奶粉或果汁中提取出来的；其余在试验中用到的菌株均为本实验室自己保存。
1.2 仪器细菌基因组DNA抽提试剂盒（上海生工生物工程技术服务有限公司），Bst DNA Polymerase（美国NEB公司），betaine（美国Sigma公司），agarose（Promega），DK28D型电热恒温水槽（上海一恒科技有限公司），PCR仪：PTC-200型；美国Bio-rad公司，EPS301电泳仪（瑞典Amersham公司）。
钦州市售婴幼儿食品中阪崎肠杆菌污染状况调查论文
钦州市售婴幼儿食品中阪崎肠杆菌污染状况调查【摘要】目的：了解钦州市售婴幼儿食品阪崎肠杆菌的污染状况，为食品风险评估提供科学依据。
方法：对钦州市内销售的广西区内外生产的婴幼儿食品进行定期随机采购，应用食品安全国家标准食品微生物检验阪崎肠杆菌检验（gb4789.40 -2010）计数法进行检验。
结果：96件样品中共检出13株阪崎肠杆菌，检出率为（13.54%）。
其中24件适合6月龄以下段婴幼儿配方奶粉阪崎肠杆菌的检出率8.33%（2/24），36件适合6月龄以上婴幼儿配方奶粉检出率为11.11%（4/36），36件婴幼儿谷类辅助食品阪崎肠杆菌检出率为19.44%（7/36），阪崎肠杆菌定量结果为0.3～46mpn/100g 不等。
结论：婴幼儿食品中阪崎肠杆菌污染问题值得重视，存在严重安全隐患。
【关键词】市售；婴幼儿食品；阪崎肠杆菌；监测【中图分类号】r155.5 【文献标识码】a 【文章编号】1004-7484（2013）04-0832-02阪崎肠杆菌又名阴沟肠杆菌，为肠杆菌属的一个种，革兰氏阴性杆菌，有周鞭毛，能运动，无芽胞，氧化酶阴性[1]。
是近几年在乳制品中新发现并引起广泛关注的一种致病菌。
它是存在于自然环境中的一种“条件致病菌”，已被世界卫生组织和许多国家确定为引起婴幼儿死亡的重要条件致病茵。
由阪崎肠杆菌引发疾病而导致的死亡率高达40%-80%。
研究表明，婴幼儿配方奶粉是阪崎肠杆菌的主要感染渠道，这已起世界各国的重视。
2004年fao/who在制定婴幼儿配方奶粉标准时，经过风险评估后，将阪崎肠杆菌与沙门氏菌列婴儿配方奶粉的列为a类致病菌[2]。
2004年中国安徽阜阳由阪崎肠杆菌污染的劣质婴儿配方奶粉事件引起了我国政府的高度重视[3]。
卫生部自2005年起，开始对全国婴幼儿配方奶粉进行监测。
为了解钦州市售婴幼儿配方奶粉及婴幼儿辅助食品中阪崎肠杆菌的污染情况，我们于2011年3月至2012年10月对钦州市售的96件婴幼儿食品进行了监测检验，现将结果报告如下：1 材料与方法1.1 材料3 计论阪崎肠杆菌可引起各年龄段人群患病，1岁以下婴儿是该菌感染的高危人群，特别是新出生婴儿，早婴产儿及出生体重偏低和免疫力下降等身体状况较差的婴幼儿易感[4]。
婴幼儿乳粉加工环境中克罗诺杆菌属（阪崎肠杆菌）监控方案的构建
食安管理婴幼儿乳粉加工环境中克罗诺杆菌属（阪崎肠杆菌）监控方案的构建陶文靖1，赵婷婷2，许冉冉2，张君超1，吴 萍2，董 彬3*（1.北京美正生物科技有限公司，北京 102200；2.光明乳业股份有限公司华东中心工厂，上海 201111；3.北京光明健能乳业有限公司，北京 101300）摘 要：克罗诺杆菌属（阪崎肠杆菌）作为婴幼儿配方乳粉中的A类致病菌备受关注。
该菌耐干燥，可长期存在于婴儿奶粉生产环境中。
婴儿配方奶粉加工、运输及销售等环节都有可能污染克罗诺杆菌属（阪崎肠杆菌），因此控制婴幼乳粉加工环境中克罗诺杆菌属（阪崎肠杆菌）的污染尤为重要。
本文结合标准法规要求和婴幼儿配方乳粉企业环境监测的经验，构建出加工过程环境中克罗诺杆菌属（阪崎肠杆菌）监控基础方案，包括区域划分、采样方案、检测方法、预防措施和纠正措施等，可帮助企业科学有效地控制克罗诺杆菌属的污染风险。
关键词：克罗诺杆菌属；婴幼儿奶粉；加工环境Construction of Monitoring Program for Cronobacter(Enterobacter sakazakii) in Infant Formula ProcessingEnvironmentTAO Wenjing1, ZHAO Tingting2, XU Ranran2, ZHANG Junchao1, WU Ping2, DONG Bin3*(1.Beijing Meizheng Bio-Tech Co., Ltd., Beijing 102200, China; 2.Bright Dairy Co., Ltd., East China Center Factory,Shanghai 201111, China; 3.Beijing Guangming Jianneng Dairy Co., Ltd., Beijing 101300, China) Abstract:Cronobacter (Enterobacter sakazakii) has attracted much attention as a group A pathogenic bacteria in infant formula milk powder. The bacterium is resistant to desiccation and can persist for a long time in the environment of infant milk powder production. Cronobacter (Enterobacter sakazakii) may be contaminated in the processing, transportation and sales of infant formula milk powder. Therefore, the contamination control of Cronobacter (Enterobacter sakazakii) in the processing environment of infant milk powder is particularly important. This paper combines the requirements of standards and regulations and the experience of environmental monitoring in infant formula milk powder enterprises to construct a basic monitoring plan for Cronobacter (Enterobacter sakazakii) in the processing environment, including area division, sampling plan, detection method, preventive measures and corrective measures, etc., can help enterprises to control the risk of Cronobacter more scientifically and effectively.Keywords:Cronobacter; infant formula; processing environment克罗诺杆菌属（阪崎肠杆菌）（以下简称“克罗诺杆菌属”）是婴幼儿乳粉中备受关注的食源性致病菌之一，严重危害婴幼儿的健康。
阪崎肠杆菌污染途径
• 检验流程: ①接种缓冲蛋白胨水 : • ②mLST增菌24h • ③接种DFI培养基,37℃，培养 24h • ④接种API20NE
1.3 分离方法 DFI显色培养基上阪崎肠杆菌的菌落特征 显色培养基上阪崎肠杆菌的菌落特征 显色培养基上
蓝绿色菌落
1.3 分离方法
E. sakazakii 的API 20E结果 结果
• 样品修复培养（前增菌）： 样品修复培养（前增菌）：无菌称取100g乳粉加 ）： 入500ml预热45℃BP中，混匀，经36℃±1℃培 养18-24h。 • 样品肠道增菌培养 样品肠道增菌培养：移取10ml 加入90mlEE肉 汤中，于36℃±1℃培养18-24h。 • 样品分离培养：取EE增菌肉汤培养物1环，分别 样品分离培养： 划线接种EMB、MacConKey、 SorbitolMacConKey琼脂平板各1块，置 36℃±1℃培养18-24h。观察3种平板上的菌落 形态及不同的生物学特性反应及其差异比较。
DFI培养基存在的问题 培养基存在的问题
更快的检测方法? 更快的检测方法
• PCR • Q-PCR
DFI培养基存在的问题 培养基存在的问题
荧光PCR结果 结果 荧光
1.4其他肠杆菌属的检验 其他肠杆菌属的检验
• E-M-S法 • 所需培养基： • EMB • MacConKey • SorbitolMacConKey
1.3 分离方法 美国FDA 法 – 2002年 美国 年
• 对加拿大法进行了修改:
– 从10毫升接种到 毫升肠杆菌增菌肉汤（EE）。 毫升接种到90毫升肠杆菌增菌肉汤 毫升接种到 毫升肠杆菌增菌肉汤（ ）。 孵育过夜而不是直接涂布 平板. 在36oC孵育过夜而不是直接涂布 VRBG 平板 孵育过夜 – 可疑菌落接种 可疑菌落接种TSA 并在 oC 培养 48-72 hours. 并在25 – 只有产黄色色素的菌落进行 API 20E system实验 实验. 实验
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肠杆菌属，鉴于所分离出的阪崎肠杆菌 之间也有差异，被分成15个生物型或群。
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细菌分类方面的问题
• 种是生物分类中基本分类单位，是具有高 度特征相似性的菌株群，该菌株群与其它 类群的菌株有很明显的区别；
• 细菌学家和分类学家存在一定分歧； • DNA杂交同源性在60-70%以上，或
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DNA相关性实验
ATCC29544
阴沟肠杆菌 差异柠檬酸杆菌
51% 51%
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生化试验
• 不利用山梨醇 • 36C下培养7d，DNA酶为阳性
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Farmer实验结论
• 阪崎肠杆菌与阴沟肠杆菌不是同一个种； • 阪崎肠杆菌生化反应与肠杆菌属细菌更
– 16S rRNA全序列比较 – DNA- DNA杂交实验结果。
• 2008年Iversen等在记录新细菌类群包括分类、命名、鉴定和系统 发育的官方杂志“国际期刊系统与进化微生物学（International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, IJSB）” 上发表文章。
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阪崎肠杆菌对配方粉的污染点、存活时间和传播线路 • 监控时间：2005.4—2006.3 • 分离出阪崎肠杆菌：80株 • 中间产品和终产品的阳性检出率：2.5% • 阳性样品检出点占全部取样点的比例：31%
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第一部分：阪崎肠杆菌的分类学变化
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“系统与进化微生物学国际期刊（International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, IJSB）”
记录新细菌类群包括分类、命名、鉴定和系统发育的官方杂志
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• 阪崎肠杆菌的发现及其命名历史
– 1929年Pangalos报道的一种引起婴儿败血症的产 黄色素的大肠菌，称为“黄色大肠菌、黄色肠杆 菌”;
– 1961年Urmenyi和Franklin根据1958年发生在英国 奥尔本的两例新生儿死亡病理研究，在报道中描 述了其病因源于一种少见的产黄色素的阴沟肠杆 菌菌群，并取日本细菌学家Riichi Sakazaki的名 字作为该菌的名称;有人称之为：“Urmenyi和 Franklin杆菌”；
克罗诺杆菌属（Cronobacter spp.）
包括5个新种,（其中Cronobacter sakazakii称为新组合）、1个克罗诺 杆菌基因种（genomospeciese）和三个新亚种.
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阴沟肠杆菌 阪崎肠杆菌
• 阪崎肠杆菌为新种的分类 依据
– 统一了该菌的名称；
– 确证了“产黄色素的阴沟肠 杆菌”是一个新种，而不是 阴沟肠杆菌的一个生物群。
依据什么？
DNA相关性 产黄色素 生化试验 抗生素易感性
细菌不同株属于同一种水平 DNA的相关性通常应在70% 或更高
– 1965年Joker等分析了发生在丹麦的一个相同病例， 并报道该种菌可导致新生儿脑膜炎并产生神经损 伤，根据两起报道首次明确了该种病原菌为“非 典型的产黄色素的阴沟肠杆菌”.
– 直到1980年，Farmer等发表了题为 “Enterobacter sakazakii, new species of Enterobacteriaceae isolated from clinical specimens.”的文章，该菌才被统一命名并定义， 该篇文章是对阪崎肠杆菌研究的阶段性成果总结。
阪崎肠杆菌研究进展
中国检验检疫科学研究院食品安全研究所 赵贵明 2009年8月
中国检验检疫科学研究院食品安全研究所
内容提要
• 第一部分：阪崎肠杆菌的分类学变化 • 第二部分：阪崎肠杆菌检验研究进展
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阪崎肠杆菌的重视程度
• 《CODE OF HYGIENIC PRACTICE FOR POWDERED FORMULAE FOR INFANTS AND YOUNG CHILDREN》 CAC/RCP 66 - 2008替代 CAC/RCP 21-1979 – 由争论到定论 – 给出了制定阪崎肠杆菌监控计划的指南
• 建议将阪崎肠杆菌重新分类命名，成为肠杆菌科1个新属，即克罗 诺杆菌属（Cronobacter spp.）包括5个新种（其中Cronobacter sakazakii称为新组合）、1个克罗诺杆菌基因种 （genomospeciese）和三个新亚种，在该杂志通知清单上 （2008年，58卷，第6部分）1个新属、5个新种和三个新亚种已 公布。
16SrRNA序列同源性达到97%以上的菌株， 被认为是同一种。
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阪崎肠杆菌的分类学变化
• 16SrRNA序列同源性在 细菌分类学上的重要作用
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阪崎肠杆菌重新分类的依据及结果
• 重新分类的依据：
– 的扩增片段长度多态性分析（Amplified fragment length polymorphismas, AFLP）
• 阪崎肠杆菌分类学及命名的发展 历史
– 阪崎肠杆菌的发现及其命名历史 – 阪崎肠杆菌为新种的分类依据
• 克罗诺杆菌分类学、词源学及其 属和种生物学特性
– 克罗诺杆菌（Cronobacter spp.） 属名、种名词源学
– 属及其各个种的生物学特性、代表 性种
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阪崎肠杆菌分类学及命名的检疫科学研究院食品安全研究所
菌血症
我国对阪崎肠杆菌方面的管理规定
• 《关于对进口乳制品进行阪崎肠杆菌检测的通知》(国质 检食函[2005]690号)；
• 《关于加强进口乳制品检验检疫监督管理工作的通知》 国质检食函[2007]298号）；
• 《婴幼儿配方乳粉生产许可证审查细则》(2006、2008 版)