流感病毒的快速检测方法样本
人感染H7N9采样方法及实验室检测策略
采集鼻咽拭子注意事项
• 1、采样时用干拭子采，不能蘸采样液，因为采样 液中有抗菌素，防止过敏。
• 2、采样液平时保存在-20℃或-70℃，采样前融化 到4℃。
• 3、采样液颜色呈紫色时失效不能用了。
人感染H7N9禽流感病毒鼻咽拭子标本 采集方法（2）
• 三、标本运送：
• • 新鲜的临床采集标本应在4℃条件下随样品送检单24小时
（二）标本转送和检测
• 1.H7N9禽流感病毒实验室活动和样本运输按照《人间传染 的病原微生物名录》中高致病性禽流感病毒进行管理。病 例的临床标本采集后，县级疾病预防控制机构和病例收治 的医疗机构要密切配合，按照生物安全的相关规定进行包 装，在24 小时内送到当地流感监测网络实验室进行检测。
• 2.当地流感监测网络实验室收到标本后24 小时内，立即对 呼吸道标本开展甲、乙型流感病毒通用引物、H5、H7亚型 的检测。
内运送至市CDC流感检测实验室。未能24小时内送至实验 室的，应置-70℃或以下保存；冻存的标本应在冻存条件 下，低温送至实验室。
• 四、采样时的生物安全防护：
• 采样时应带口罩，穿隔离衣，带一次性手套及帽子。若在 现场进行快速检测，应将现场用过的所有废物带回销毁。
谢谢，祝大家工作顺利！
• 若当地流感监测网络实验室检测结果为H5、H7核酸检测 阳性时，应当于24小时内将其中2管呼吸道相关原始标本 分别送省级疾控中心流感网络实验室和国家具备相应生物安全条件的网络实验室可开展病毒 分离，并将分离的毒株按要求及时送国家流感中 心。
• 3.若当地流感监测网络实验室检测结果为甲型流 感和乙型流感通用引物均阴性时，应当立即将1管 原始呼吸道标本送省级疾控中心。省级疾控中心 收到标本后，应当立即对其中1管进行SARS 、新 型冠状病毒等相关病原体的检测，另1管送国家流 感中心。
实时荧光定量PCR仪用于流感病毒检测的效果分析
实时荧光定量PCR仪用于流感病毒检测的效果分析实时荧光定量PCR（real-time quantitative PCR，qPCR）是一种常用的生物分子检测技术，对于流感病毒的检测具有高灵敏度、高特异性和高准确性的优势。
在流感的病毒检测中，实时荧光定量PCR仪被广泛应用，为流感的早期诊断和疫情监测提供了有效的方法。
实时荧光定量PCR仪通过检测RNA的数量来确定流感病毒的存在与否。
其基本原理是利用荧光标记的探针与待检测样品中的特定基因片段进行特异性结合，采用荧光信号传导系统来进行荧光信号的放大和检测。
实时荧光定量PCR仪可以实时监测PCR反应过程中的荧光信号强度，从而确定样品中目标基因片段的数量。
通过与已知标准曲线进行比对，可以定量分析待检测样品中目标基因片段的浓度。
1. 流感病毒的早期诊断：实时荧光定量PCR仪可以快速、精确地检测流感病毒的存在与否。
通过检测患者鼻咽拭子或咳嗽样本中的流感病毒核酸，可以早期发现感染者，有助于及时采取隔离和治疗措施，减少感染的传播。
2. 流感疫情监测：实时荧光定量PCR仪可以对流感病毒的传播情况进行实时监测。
通过收集不同地区、不同时间段的流感病毒样本，可以对流感疫情的流行趋势、病毒亚型和变异情况进行监测和分析，为制定疫苗种类和防控策略提供科学依据。
3. 流感病毒变异监测：流感病毒存在较高的变异性，特别是流感病毒的血凝素和神经氨酸酶基因会发生变异，导致流感疫苗的选择和疗效变化。
实时荧光定量PCR仪可以通过监测流感病毒核酸的特定位点，检测流感病毒的变异情况，并根据变异情况及时调整疫苗的配制和疫情防控策略。
4. 流感病毒药物敏感性检测：实时荧光定量PCR仪可以检测流感病毒的耐药性和药物敏感性。
通过监测流感病毒样本中特定基因片段的序列变异和药物抗性基因的存在情况，可以评估流感病毒对药物的敏感性，并为选择合适的抗病毒药物提供依据。
实时荧光定量PCR仪在流感病毒的检测中具有高效、准确、敏感、特异性等优势，能够满足对流感病毒相关特征的定量监测需求。
实时荧光定量PCR仪用于流感病毒检测的效果分析
实时荧光定量PCR仪用于流感病毒检测的效果分析一、实时荧光定量PCR原理及流感病毒检测方法实时荧光定量PCR是一种通过测定PCR反应过程中产生的荧光信号强度来定量检测靶标核酸的技术。
其原理是利用DNA polymerase在PCR反应过程中不断合成新的DNA链，并辅以荧光探针来实时监测DNA合成过程中的荧光信号变化，从而定量检测初始样本中的靶标DNA的数量。
而在流感病毒检测中，通常采用逆转录实时荧光定量PCR（real-time reverse transcription quantitative PCR，RT-qPCR）技术，即在PCR反应前先将病毒RNA 逆转录成cDNA，再进行实时荧光定量PCR检测。
实时荧光定量PCR仪由于其高灵敏度、高特异性和快速检测速度，成为流感病毒检测的首选技术之一。
在实时荧光定量PCR检测中，选择合适的引物和探针对流感病毒的特异基因序列进行扩增和检测，可以快速、准确地检测出样本中的流感病毒数量。
实时荧光定量PCR仪还可以配备多通道检测系统，同时检测多种不同类型的流感病毒，提高了检测效率和准确性。
1. 高灵敏度：实时荧光定量PCR仪可以同时检测多个样本，且每个样本的检测结果都具有高灵敏度和高特异性，能够检测到极低浓度的流感病毒。
2. 快速检测速度：实时荧光定量PCR仪可以在短时间内完成样本的检测，并且可以同时进行多个样本的检测，大大提高了检测效率。
3. 准确性高：实时荧光定量PCR仪的检测结果准确可靠，可以排除假阳性和假阴性的可能性，对于流感病毒的检测结果具有更高的信任度。
四、实时荧光定量PCR仪在流感病毒疫情防控中的应用前景实时荧光定量PCR仪在流感病毒疫情防控中具有重要的应用前景。
一方面，在流感病毒疫情监测和早期预警中，实时荧光定量PCR仪能够快速、准确地检测出病毒在人群中的传播情况，为疫情的及时控制提供重要数据支持。
在临床诊断中，实时荧光定量PCR仪可以快速、准确地诊断流感病毒，指导患者的治疗和隔离措施。
甲型流感的分子诊断技术与实验室检测方法
甲型流感的分子诊断技术与实验室检测方法甲型流感是一种由甲型流感病毒引起的急性呼吸道传染病，其传播迅速且易感染大量人群。
为了准确诊断和及时干预，科学家们开发出了多种分子诊断技术和实验室检测方法。
本文将介绍几种常用的技术与方法，以提高对甲型流感的检测效率和诊断准确性。
一、聚合酶链式反应（PCR）技术PCR技术是一种灵敏度高、特异性强的分子诊断技术，已被广泛应用于甲型流感的检测中。
该技术通过放大甲型流感病毒基因组中特定的DNA片段，从而使其能够被检测到。
PCR技术可在短时间内，从患者的样本中检测到甲型流感病毒的存在，并确定其亚型。
此外，PCR 技术还能够对病毒的基因组进行序列分析，从而确定其突变情况和传播途径。
二、实时荧光定量PCR（qPCR）技术实时荧光定量PCR技术是PCR技术的一种改进版本，其主要优势在于可实现对病毒数量的精确测量和即时定量。
该技术结合了PCR和荧光探针技术，使得可以在PCR反应过程中实时监测目标序列的扩增情况。
实时荧光定量PCR技术能够快速检测出甲型流感病毒的数量，并对病毒载量进行准确测量，帮助医生判断病情的严重程度，指导治疗决策。
三、免疫荧光技术免疫荧光技术是一种通过特定的抗体和荧光探针对病毒进行检测的技术。
在甲型流感的实验室检测中，科学家们通常采用免疫荧光技术检测病毒的抗原。
该技术的原理是将含有甲型流感病毒的标本与特异性荧光标记的抗体结合，然后通过荧光显微镜观察是否有荧光信号出现。
免疫荧光技术能够准确、快速地检测出甲型流感病毒的存在，并且可以对其亚型进行鉴定。
四、核酸测序技术核酸测序技术是一种可以解析病毒基因组序列的方法，可以帮助科学家们了解甲型流感病毒的基因组结构和功能。
通过高通量测序技术，科学家们可以在较短的时间内获取大量的病毒基因组序列信息。
这些信息有助于了解甲型流感病毒的变异情况，筛选药物治疗靶点，并指导疫苗的设计与开发。
五、免疫学检测方法除了分子诊断技术，免疫学检测方法也发挥着重要作用。
流感病毒实验室检测流程
1
流感病毒实验室检测流程
流感病毒实验室检测流程简述如下：
→样本采集：采集患者咽拭子、鼻咽拭子或呼吸道分泌物
→标本处理：使用病毒保存液，保持样本活性，低温运送
→实验室接收：记录信息，安全条件下接收样本
→核酸提取：从样本中提取RNA
→RT-PCR检测：逆转录聚合酶链反应，检测流感病毒核酸
→结果分析：观察PCR产物，判断阴阳性
→病毒分离培养：必要时，于生物安全柜中进行鸡胚或细胞培养→病毒鉴定：通过HA试验、基因测序等确定病毒类型和亚型→出具报告：记录检测结果，及时报告给临床医生
→生物安全：全程严格遵守生物安全操作规程。
1。
流感病毒RNA荧光RT(PCR检测技术)-
流感病毒RNA荧光RT（PCR检测技术）-流感病毒核糖核酸荧光逆转录聚合酶链反应检测技术实时荧光定量聚合酶链反应是在常规聚合酶链反应基础上发展起来的定量聚合酶链反应技术。
通过在聚合酶链式反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的积累，对整个聚合酶链式反应过程进行实时监控。
最后，根据ct值和标准曲线对未知模板进行定量分析。
常用的实时荧光定量PCR可分为非特异性荧光标记的SYBR Green法、特异性荧光标记的TaqMan法和分子信标法。
1。
实时荧光定量聚合酶链反应原理:1。
SYBR Green方法:SYBR Green是一种双链DNA结合染料，在自由状态下不发光，当无意中掺入双链DNA时会发出荧光信号。
它的强度与双链DNA 的数量有关。
随着扩增产物数量的增加，检测到的荧光信号增加。
2，TaqMan方法:在扩增反应液中加入特异性探针，探针的5’端和3’端分别标记有荧光报告基团和荧光淬灭基团，当探针完成时，两个基团的位置接近，5’端报告基团的荧光能量被3’端淬灭基团吸收，此时未检测到荧光信号，在扩增过程中，探针与模板结合形成5’→3’切除活性底物当Taq酶沿着模板向前延伸到探针连接处时，发生链置换。
Taq酶的5’→3’切除活性切割从探针上切割连接到探针5’端的报道基团。
5’末端报道基团的荧光能量与3’末端荧光淬灭基团的吸收分离，并且可以检测荧光信号。
在每个聚合酶链反应循环之后，荧光信号也有一个同步生长过程，就像扩增产物一样3.分子信标法:将探针设计成发夹形的茎环。
环的核苷酸序列与扩增产物的序列互补。
两端的核苷酸序列互补形成茎。
一端用报道基团标记，另一端用淬灭基团标记。
当探针不与模板结合时，报道基团和淬灭基团在空间上彼此靠近，报道基团的荧光能量被淬灭基团吸收。
此时，无法检测到荧光信号。
与模板结合后，探针的构象由发夹状变为链状，报道基团和淬灭基团分离，并呈荧光核酸检测是鉴定流感病毒基因组的一种强有力的方法，即使基因组含量很低或可以检测到死病毒。
甲型流感病毒检测方法及技术方案H1N1
甲型（H1N1）流感病毒实验室检测技术方案(试行)广州健仑生物科技有限公司整理本方案旨在为全国流感监测网络实验室提供甲型H1N1流感病毒实验室检测技术方案，不用作商业活动或赢利目的。
一、标本的采集种类和要求1、推荐采集的呼吸道标本种类疾病发病后应尽快采集如下标本：鼻拭子、咽拭子、鼻腔吸取物、鼻腔冲洗液。
气管插管的病人也应收集气管吸取物。
标本应置于无菌病毒采样液，并立即用冰块或冰排保存或置于4 ℃（冰箱），并马上送至实验室。
（临床样品采集人员及实验室检测人员的感染控制指导请见相关文件。
）采样同时填写疑似人感染甲型H1N1感染病例标本采样单。
（附表1）2、拭子的选择标本应使用头部为合成纤维的拭子（例如，聚酯纤维），用铝或塑料做柄。
不推荐棉拭子和木柄。
标本采集管应包含3毫升病毒采样液（含有蛋白质稳定剂，阻止细菌和真菌生长的抗生素，缓冲液）3、临床标本储存要求保存在4℃（不能超过4天）或者-70℃或-70℃以下。
有条件的实验室均应保存在-70℃或-70℃以下。
不应保存在-20℃。
4、标本的分装处理标本送至实验室后，立即进行处理，避免反复冻融。
将原始标本分为三份，一份用于核酸检测，一份用于病毒分离，一份保存待复核。
5、标本的运输疑似人感染甲型H1N1感染病例列为 A类，用UN2814包装运输。
填写疑似人感染甲型H1N1感染病例标本送检单（附表2）。
二、核酸检测基于PCR原理的核酸检测方法是一种快速有效的诊断方法，在突发传染病应急工作中发挥了巨大作用。
1、基于real-time RT-PCR的方法检测新的甲型H1N1流感病毒（引物和探针序列为美国CDC设计）：4月29日WHO网站上公布了美国CDC设计的针对此次甲型H1N1流感病毒的real-time RT-PCR引物和探针，此实验用于检测疑似甲型H1N1流感病例的呼吸道样本, 因此，用此real-time RT-PCR的方法，建议首先筛选甲型流感病毒并排除季节性流感病毒和H5N1禽流感病毒。
流感临床表现及诊断【范本模板】
1.流感病毒是如何进入人体致病的？当人体通过呼吸道吸入含有流感病毒的飞沫或尘埃后，病毒直接侵犯呼吸道的纤毛状上皮细胞，并在纤毛状上皮细胞内复制（生长)繁殖,致使纤毛状上皮细胞造成变性坏死、脱落外，病毒还可向下侵犯气管、支气管、直至肺泡，造成粘膜下层出现出血、水肿等病理变化。
当病毒侵犯纤毛状上皮细胞后形成变性、坏死、脱落后，此时机体就可表现出流感的呼吸道症状,如出现粘膜下层出血、水肿，肺泡有纤维蛋白渗出等病理改变，患者会在出现流感呼吸道症状的基础上,再出现肺炎的临床表现。
2。
流感症状表现与流感病毒变异有什么关系？流感症状表现轻、重与流感病毒变异有关系，流感病毒主要分甲、乙、丙三型，其中乙、丙型病毒相对较稳定，甲型流感病毒较活跃，易通过病毒本身的神经氨酸酶和血凝素改变而出现变异并产生一种新的甲型流感病毒亚型。
一种新的甲型流感病毒重组后，常会表现出传播能力强,致病性较强等特征，另一方面，作为人群来讲，体内原有的抗流感免疫力已经不起作用，作为容易感染流感新甲型病毒亚型的人群,如一旦受到传染和感染后，病人所表现出的症状与未发生病毒变异期间感染后临床表现不一样，前者可表现出症状典型,婴幼儿体弱多病，老年人可表现症状重，并发肺炎等相对高，而后者则以类似上呼吸道感染的病人或不典型流感病人多见。
3。
婴幼儿与老年人患流感的症状表现有什么特点?后果如何？婴幼儿和老年人与其他人群尤其青壮年相比，表现在机体免疫和抗病能力,室外环境适应能力不及青壮年；这类人群多数以居室内活动为主，一旦感染流感病毒病毒后，所表现出来的症状和体征较重，后果也相对较青壮年重,主要表现为以下特色与后果：1、症状相对典型，可表现为高热不退、咳嗽明显、病情可持续发展，严重者可出现呼吸急促，紫绀等。
2、易发生肺炎型流感。
发病后易发生肺炎性流感，患者可在病后1－2天病情加重，出现持续高热，剧烈咳嗽、血性痰，继后出现呼吸急促、肺部炎症表现,X光检查可显示肺部炎症阴影.如治疗不及时，病情继续发展或严重者可导致因心血管功能不全或肺水肿而死亡.4.流感发病的临床表现有哪些特点?流感病毒感染的临床表现随病毒株，人群年龄,生理状态，既往史不同而异，可表现出不显性感染,显性感染，甚至死亡。
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流感病毒的快速检测方法一、.................................................................. RT-PCR快速诊断方法
( 一) 生物安全要求
( 二) 病毒核酸提取
( 三) RT-PCR
( 四) PCR 产物纯化
( 五) 流感病毒RT-PCR检测引物二、........................................................ 免疫荧光方法检测流感病毒
( 一) 原理
( 二) 标本处理
( 三) 间接免疫荧光法
( 四) 结果判断
三、................. 实时荧光定量PCR( Real-Time PCR) 快速诊断检测
( 一) 基本原理
( 二) 实验试剂
( 三) 实验步骤四、............................................................................. 快速诊断试剂盒
流感的快速检测方法, 与传统的病毒分离鉴定相比具有快速、简便的特点。
因此常见于流感暴发时早期病原学检测用。
流感的快速诊断包括直接和间接免疫荧光法、ELISA、RT-PCR、Real-Time PCR快速诊断速方法、流感快速诊断试剂盒等。
这里介绍RT-PCR、
Real-Time PCR、免疫荧光快速诊断速诊断方法和几种流感快速诊断试剂盒优缺点。
无论那种快速诊断都无法代替传统的病毒分离鉴定方法。
一、RT-PCR快速诊断方法
核酸检测是一种鉴定流感病毒基因组的有力方法, 即使基因组含量很低或死病毒也能够检测到。
本章将介绍检测流感病毒的聚合酶链式反应( PCR) 。
流感病毒的基因组是负链RNA, 在进行PCR扩增前必须合成与病毒RNA互补的DNA, 即为cDNA。
逆转录酶( RT) 就是用于合成cDNA的多聚酶, 因此, 扩增流感病毒基因组的过程称为RT-PCR。
RT-PCR需要一对型别特异引物, 四种脱氧核苷酸( dNTPs) , RNA模板, 逆转录酶及Taq DNA 多聚酶; 首先由逆转录酶将病毒的RNA逆转录合成cDNA, 然后再进行聚合酶链反应经25～30个循环, 使DNA产物达到倍增的效果。
（一）生物安全要求
生物安全级别与个人防护要求: 生物安全二级实验室, 防护要求与二级实验室的要求相同。
并应遵守相应的生物安全规定。
进行高致病性禽H5 RT-PCR快速检测时能够在生物安全二级实验室里进行, 核酸提取在生物安全三级实验室的生物安全柜里完成。
（二）病毒核酸提取
1. 实验材料及仪器
(1) QIAGEN公司的Rneasy Mini Kit( Catalog# 74104)
(2) β-巯基乙醇( β-mercaptoethanol)
(3) 70% 乙醇
(4) 无菌1.5ml 离心管
(5) 10μl、20μl、200μl、1000μl加样器和枪头
(6) 可调14K微型离心机
(7) 旋转混合器
2. 操作步骤
(1) 取1支无菌、无RNA酶的1.5ml Eppendorf管, 加入500μl
RLT。
(2) 取采样液( 鼻拭子、咽拭子、胸水等) 或病毒培养物( 鸡
胚尿囊液或细胞培养液) 100μl, 加入上述Eppendorf管中。
(3) 加5μl β-巯基乙醇, 充分混匀。
(4) 加600μl 70%乙醇, 于旋转混合器混匀。
(5) 从试剂盒中取出带滤膜的离心柱, 并标上标本号。
(6) 将第4步的混合液体分两次( 每次600μl) 吸入于滤柱中, 1
rpm 离心15秒, 弃收集管中的离心液。
(7) 滤柱仍放回收集管上, 将第4步的混合液全部吸入滤柱中,
1 rpm 离心15秒, 弃收集管中液体。
(8) 于滤柱中加入700μl RW1, 1 rpm 离心15秒。
(9) 从试剂盒中取出一支新的2ml收集管, 将离心后的滤柱转
到新的收集管上, 于柱子中加入500μl RPE, 1 rpm 离心15
秒弃收集管中液体。
(10) 滤柱放回收集管上, 于滤柱中加入500μl RPE, 13000～
14000rpm 离心2分钟。
(11) 从试剂盒中取出一支1.5ml Eppendorf管, 将滤柱转到新的
1.5ml管上, 于滤柱中加入30～50μl 无RNA酶的水, 室温
静置1～3分钟。
(12) 1 rpm 离心1分钟, 弃滤柱。
收集的离心液即为提取病毒的
RNA, 能够直接用于逆转录实验, 或在-20℃以下保存,
-30℃可保存3～4个月。
3. 注意事项
(1) 试剂盒中的RPE液用前需加44ml无水乙醇, 使终体积达到
55ml。
(2) 所有用过的枪头、收集管放入2%次氯酸钠消毒缸中过夜。
（三）R T-PCR
1. 一步法RT-PCR
(1) 实验材料
1) QIAGEN One Step RT-PCR Kit Cat No 210212
2) RNase inhibitor 40u/μl( Promega)
3) 上游引物200ng/μl
4) 下游引物200ng/μl
5) 模板RNA( Templet RNA)
(2) 实验步骤
1) PCR反应配置( 在清洁区缓冲间, 加RNA模板应在核酸
室)
无RNA酶水( Rnase Free Water) 28.75μl
5×Buffer 10μl
10mM dNTP 2μl
Enzyme Mix 2μl
Rnase inhibitor 0.25μl
上游引物1μl
下游引物1μl
RNA 模板5μl
总量: 50μl
2) 将PCR 反应管放入PCR扩增仪
3) RT-PCR 反应条件: 此循环的反应条件仅共参考, 如果引
物更换, 相应的反应条件需要做适当调整。
→60℃ 1 min
→42℃10 min
→50℃30 min
→95℃15 min
→94℃30 sec
→52℃30 sec
→72℃ 1 min
→返回第5部, 循环34次
→72℃10 min
→4℃保存
4) PCR产物检测
琼脂糖凝胶配置: 用1×TBE 将琼脂糖配成 1.2%～1.5%溶液, 加热使之完全溶解。
冷却到50～60℃时加入溴化乙锭( Ethidium Bromide EB, 10ug/μl) , 终浓度为0.5μg/ml。
PCR产物检测: 将凝胶放入电泳槽,加入1×TBE Buffer , 使它淹没过胶面。
每份标本取4μl PCR产物, 与1μl 5×Loadin g Buffer 充分混匀后全加入凝胶孔中。
于同一凝胶的第一孔加入5μl分子量标准样品。
加完样后, 盖上电泳槽盖子, 接通电源, 稳压100v, 电泳时间约30～40min。
结果分析: 用UV～254暗箱式紫外透射仪观察电泳结果, 在透射波长254nm 下观察结果效果较好。
或者用凝胶成像系统观察电泳结果。
5) 注意事项: 含EB的琼脂糖经处理后放入科研垃圾袋内统
一处理。
含有EB的凝胶处理方法:
→加1倍体积的0.5mol/L KMnO4,小心混匀。
→加入1倍体积的2.5 mol/L HCl,小心混匀。
于室温放置数小时。