里氏木霉β-葡萄糖苷酶水解大豆异黄酮糖苷的工艺研究

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里氏木霉与黑曲霉混合发酵产纤维素酶及其水解特性_宋娜娜

第8卷第5期2010年9月生物加工过程Ch i nese Journa l o f B ioprocess Eng i neer i ng V o.l 8N o .5Sep .2010do:i 10.3969/.j issn .1672-3678.2010.05.002收稿日期:2010-04-21基金项目:国家自然科学基金资助项目(30871992);国家高技术研究发展计划(863计划)资助项目(2008AA05Z401)作者简介:宋娜娜(1985)),女,江苏南京人,硕士研究生,研究方向:生物燃料乙醇;宋向阳(联系人),副教授,E -m ai:l xi angyangs ong @hot m ai.l co m里氏木霉与黑曲霉混合发酵产纤维素酶及其水解特性宋娜娜,宋向阳,欧阳嘉,勇强(南京林业大学化学工程学院,林木遗传与生物技术省部共建教育部重点实验室,南京210037)摘要:研究了利用里氏木霉和黑曲霉混合培养产纤维素酶,以黑曲霉孢子悬浮液的不同活化浓度及不同的活化时间来寻找2个菌种发挥最大协同作用的结合点以及所产纤维素酶的水解特性。

以里氏木霉单一培养和黑曲霉单一培养为参照进行对比研究。

底物为农林废弃物之一的玉米秸秆,经过蒸气爆破预处理后,用作产酶C 源。

结果表明:黑曲霉孢子悬浮液活化浓度为10个/mL,活化时间为12h 时,滤纸酶比酶活最高,达3132U /mL,高于里氏木霉单一培养的2125U /mL,B -葡萄糖苷酶比酶活达1132U /mL,高于里氏木霉单一培养的0157U /mL 。

为进一步验证混合菌产纤维素酶的水解效果,利用混合菌产纤维酶的酶液及里氏木霉产纤维素酶的酶液进行酶水解实验,当酶用量为20U /g 绝干纤维素,底物质量浓度为100g /L 条件下水解48h ,混合菌所产酶液酶解得率达70100%,高于里氏木霉所产酶液的酶解得率63105%。

实验表明里氏木霉与黑曲霉混合培养产酶是可行的,并优于单一菌种培养。

绿色木霉β-葡萄糖苷酶的重组表达及进一步纯化

１材料与方法
１１菌株及质粒．绿色木霉Ｓ－１６为沈阳农业大学生物科技ｎ９０学院酶学实验室保存。大肠杆菌ＴＰ０感受态Ｏ１
的ｐＤ葡萄糖苷键， —－并释放出ｐＤ葡萄糖和相应－－
的配基。近年来，在食品工业中展示了独其特的应用前景：・萄糖苷酶可水解果蔬中的风Ｂ葡味前体物质如单帖烯醇糖苷等，放出沉香醇等释具有浓郁天然香气的物质，已成为食品工业中重要的风味酶 “ 。在制备功能性食品时则用于生物活性物质的转化。ｐ葡萄糖苷酶的另一重一
Ｌ，ａ１０．／ＦＳＣＣ２６ｓＬ，ｅＯ４・Ｈ２／Ｌ，Ｓ７Ｏ５ｍｒＭｎＯ４・
Ｈ２１６ｍｓＯ．／Ｌ，ＳＺｎＯ４・７Ｈ２Ｏ１４．ｍｇ／Ｌ，Ｃ１Ｃｏ２２
要用途是作用于纤维素生物转化，维素这一巨纤
Ｄ—ｌｃｓｅｇｕｏｙｒｌｓ（ｇ１）ｇｎ，ｃｍｐｅｅｇｕｏｉｌｃｈｄｏａｅｂｌｄｅｅｏｌｔ
Ｂ葡萄糖苷酶活性测定参照文献１。定义．４在最适反应条件下每ｍｉｎ催化底物水解产生
１Ｉｌ硝基苯酚的酶量为１酶活单位。粗酶ｍｏ￣对个
序。１６Ｂ基因原核表达．Ｇ
的完整性相对较好，以用于Ｒ —Ｃ可ＴＰＲ。然后用ａｔｃｉ因引物对ｃＮｎ基ＤＡ第一链进行ＰＲ扩增，Ｃ在２８ｂ６ｐ左右的位置获得了１个清晰单一的条带（２，明合成的ｃＮ图）证ＤＡ可用于下一步反应；最后，过Ｒ —Ｃ通ＴＰＲ获得２３ｂ２５ｐ的Ｂ葡萄糖苷酶基一因（３。将该基因序列与Ｇｎａｋ０５０１图）ｅＢｎ：Ｕ９８．进行比较分析，现二者的核苷酸序列同源性达发

_葡萄糖苷酶的研究进展_综述_

安徽农业大学学报,2002,29(4):421～425Journal of A nhui A gricultural U niversityΒ2葡萄糖苷酶的研究进展(综述)α李远华(安徽农业大学农业部茶叶生物技术重点开放实验室,合肥230036)摘　要:Β2葡萄糖苷酶不仅具有纤维素的糖化作用,而且与萜烯类香气前驱体有密切关系。

本文详述了该酶在微生物体中的研究概况,特别是在茶树中的研究进展,以及Β2葡萄糖苷酶基因的克隆和表达。

关键词:Β2葡萄糖苷酶;研究进展中图分类号:Q55612文献标识码:A文章编号:100022197(2002)0420421205Β2葡萄糖苷酶(EC3,2,1,21),其英文名是:beta gluco sidase,属于水解酶类,存在于自然界许多植物体,还存在于一些酵母、曲霉菌、木霉菌属及细菌体内。

它的特性是可水解结合于未端、非还原性的Β2D2糖苷键,同时释放Β2D2葡萄糖和相应的配基[1];此外还能微弱地水解对硝基苯2Β2D2半乳糖和Β2D2木糖苷。

在纤维素的糖化作用中,Β2葡萄糖苷酶功能是将纤维素二糖和纤维素寡糖水解成葡萄糖。

根霉能在许多种纤维素物质上生长,正是由于它能产生包括Β2葡萄糖苷酶在内的多种纤维素酶所致[2]。

近年来Β2葡萄糖苷酶的研究势头有增无减,除对其微生物体进行研究外,还扩展到其他的作物领域,如茶叶、水果、蔬菜等,主要是该酶与萜烯类香气前驱体有密切关系,使糖苷键合态变成游离态。

另外该酶能水解野黑樱苷,释放HCN,对植物体起到一定的抗病虫害作用。

1　Β-葡萄糖苷酶的研究概况Β2葡萄糖苷酶的研究可以追溯到1837年,L iebig and W oh ler[3]首次在苦杏仁汁中发现了该酶,该酶分布较为广泛,特别是植物的种子和微生物中尤为普遍,杏仁是Β2D2葡萄糖苷酶的最经典的来源。

L ym ar E S[4],K i2Bong O H[5],GuevasL[6],Podsto lsk i,H euser W,Grover A K,J H Sch reier,A shock K Grover,N adia A IT,Shoeyov,M artine L等[3]先后分离纯化了该酶且进行研究,并从黑樱桃[7]、水稻[8]、大豆[9]、木薯[10,11]作物中纯化出Β2葡萄糖苷酶。

_葡萄糖苷酶水解银杏黄酮糖苷的研究

β2葡萄糖苷酶水解银杏黄酮糖苷的研究伍毅1,王洪新1,23　(1.食品科学与技术国家重点实验室,江南大学食品学院,江苏无锡214012;2.石河子大学食品学院,新疆石河子832003)摘要　采用β2葡萄糖苷酶水解银杏叶提取物(G BE),使糖苷型黄酮转化为苷元型黄酮。

通过正交试验得出水解的最佳工艺参数,即温度40℃,酶浓度5×10-3m g/m l,pH值5.0下水解6h。

由HP LC图谱可得该条件下水解的苷元得率9.08%,纯度68.24%。

酶解产物中还部分保留了银杏内酯等活性成分,有利于保留银杏叶提取物的综合生物活性。

关键词　银杏叶提取物;黄酮苷元;β2葡萄糖苷酶;水解中图分类号　Q946 文献标识码　A 文章编号　0517-6611(2008)01-00030-03Study on H ydrolyzing G inkgo F lavone G lycoside w ithβ2glycosid aseWU Yi et al　(S tate K ey Lab oratory of F ood Science and T echn ology,Sch ool of F ood Science&T echn ology,S outhern Y angtze University,W uxi,Jiangsu 214012)Abstract　β2glycosidase was used to hydrolyze the extract from ginkg o leaves to trans form flav one glycoside into flav one aglycone.T he optimum techn o2 logical param eters of hydrolysis were obtained through orth og onal ex perim ent,which were enzym e concentration of5×10-3m g/m l and pH value of5.0, hydrolysis tem perature of40℃and tim e of6h.It was kn own from HP LC spectrogram that the aglycone yield of hydrolysis under this condition was9.08%w ith purity of68.24%.In the enzym olysis products,the active ingredients such as ginkg o lactone were als o reserved partly,which was in fav orof reserving the synthesized bioactivity of ginkg o leaves extract.K ey w ords　G inkg o leaves extract;Flav one aglycone;β2glycosidase;H ydrolysis 银杏(G inkgo biloba L.)属银杏科银杏属多年生落叶乔木,是冰川时期存活的孑遗植物之一,属我国特产植物,主产于河南、湖北等地,其种子、根、叶均可药用。

异黄酮的微生物发酵和酶转化生产

【作者简介】张雯煜（１９７５－），女，浙江台州人，工程师，现在台州市环境监测中心站从事检测工作。

广西轻工业ＧＵＡＮＧＸＩＪＯＵＲＮＡＬＯＦＬＩＧＨＴＩＮＤＵＳＴＲＹ２００７年８月第８期（总第１０５期）食品与生物１大豆异黄酮的功能大豆富含优质蛋白质和脂类，自古以来一直是中华民族重要传统食品，已有几千年悠久的食用历史。

大豆不仅是非常优良的营养源，而且因其富含许多微量生理活性物质，现已被誉之为“功能性食品”原料宝库。

近年，对大豆所含磷脂、生育酚、植物凝血素、低聚糖、类黄酮等生理活性物质的研究开发日益深化。

最近，据许多流行病学、免疫学、动物体内、体外试验等研究报告著称大豆异黄酮具有诸多生理功能，备受世人瞩目［１］。

大豆异黄酮属于黄酮类化合物，是一类具有重要生物活性的化合物，在大豆和大豆制品中含量丰富。

大豆异黄酮具有防癌、防骨质疏松症、改善妇女更年期综合症、防心血管疾病等诸多生理功能。

其独特的生理功能，已引起国内外学者的广泛关注。

大豆异黄酮的研究，不仅为大豆制品的开发提供新的途径，也为人们合理的膳食提供参考，所以具有很高的研究价值［２］。

除大豆外还有很多其它豆制品以及葛根等植物也富含异黄酮。

２大豆异黄酮的微生物发酵２．１豆类中发酵异黄酮的形成异黄酮是一类类黄酮化合物，其母核是指具有两个芳环Ａ与Ｂ，通过三碳链相互连接而成的一系列化合物。

目前，已经从大豆发酵制品中分离出１３种异黄酮。

并根据紫外光谱、质谱和核磁共振谱分析法确定了这些组分的结构。

大豆平均含０．１２％～０．４２％总异黄酮，分布于种皮、子叶和胚轴之中，其中以胚轴的含量最多。

大豆中９９％的异黄酮通过β－葡萄糖苷键以糖苷的形式存在。

在发酵过程中，由于发酵的微生物能够分泌β－葡萄糖苷酶，作用于异黄酮糖苷，使糖苷几乎完全水解为异黄酮甙元。

研究表明，游离的甙元比糖苷更具有广泛的生物学活性。

因具有很大表面积的小肠上端，对异黄酮甙元有相当大的吸收能力。

未经发酵的大豆中的异黄酮糖苷，虽然经过饮食进入大肠后，经肠中的微生物分泌酶切除葡萄糖苷后可被吸收，但此类异黄酮糖苷不是肠道中糖苷酶最佳底物，所以该途径异黄酮吸收的量极其有限。

里氏木霉生产纤维素酶的研究进展[1]

卷第期里氏木霉生产纤维素酶的研究进展张继泉王瑞明孙玉英关凤梅摘要主要介绍了里氏木霉产纤维素酶的特性及其产纤维素酶高产菌株的筛选鉴定和纤维素酶活的测定方法发酵生产方式以及发酵工艺条件的控制最后简单介绍了纤维素酶提取的新方法与新工艺
《饲料工业》・!""# 年第 !$ 卷第 % 期
酶制剂专栏
里氏木霉生产纤维素酶的研究进展
张继泉王瑞明孙玉英关凤梅
摘
要
主要介绍了里氏木霉产纤维素酶的特性及其产纤维素酶高产菌株的筛选、鉴定和纤
维素酶活的测定方法，发酵生产方式以及发酵工艺条件的控制，最后简单介绍了纤维素酶提取的新方法与新工艺。关键词里氏木霉；纤维素酶；反胶束 !"#$% &
小梗. 小梗瓶形，分生孢子球形或长椭圆形，表面粗糙，布满小刺；单胞，靠粘液在小梗上聚集成球状绿色的分生孢子头。以里氏木霉为出发菌种，经初筛、复筛、诱变后，固态法发酵或液体深层培养发酵生产纤维素酶，里氏木霉发酵生产的纤维素酶是胞外酶，经过粗提和分离纯化后，就得到纯化的纤维素酶制剂。纤维素酶是指能水解纤维素 ! - #， ) 葡萄糖苷键，使纤维素变成纤维二糖和葡萄糖的一组酶的总称，它不是单一酶，而是起协同作用的多组分酶系。纤（）维素酶由葡聚糖内切酶 5/+6 ,6 #6 )，也称 /C 酶、葡（5/+6 ,6 #6 D# ，聚糖外切酶也称 /# 酶）、 ! - 葡萄糖苷（5/+6 ,6 #6 ,#，酶也称 /E 酶或纤维二糖酶）三个主要成分组成的诱导型复合酶系。 5F 和 /EG 主要溶解纤维素，当三个主要 EF 主要将纤维二糖转化为葡萄糖，成分的活性比例适当时，就能完成纤维素的降解。近年来纤维素酶在饲料、制糖、化纤、造纸工业等方面的广泛应用，开拓了良好的市场前景。尽可能提高菌株产纤维素酶的能力一直是各国科研工作者努力公关的项目之一。国外对纤维素酶的研究有近 )* 多年的历史，纤维素酶产生菌主要有木霉、青霉和曲霉等，其中里氏木霉 H2I / - +* 被认为是最好的纤维素酶产生菌之一；我国对纤维素酶的研究和生产也已开展了广泛的研究，大多数采用固体发酵。对液体发酵生产纤维素酶的研究报道尚不多见，固体发酵有许多优越之处，但发酵水平不稳定，不适于大规模生产，而液体深层发酵就改变了这一点。通过分批发酵或流

黑曲霉与里氏木霉混合发酵产β-葡萄糖苷酶

ａｎｄｏｐｔｉｍｉｚｅｄ．Ｔｈｅｒｅｓｕｈｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｏｐｔｉｍｕｍｃｕｌｔｕｒｅｍｅｄｉｕｍｗａｓｄｅｓｃｒｉｂｅｄａｓｆｏｌｌｏｗｓ：ｂｒａｎ１５ｇ／Ｌ，ｃｏｒｎｃｏｂ３５ｇ／Ｌ，
ห้องสมุดไป่ตู้
ｉｎｏｅｕｌｕｍｓｉｚｅ，ｉｎｏｃｕｌｕｍｔｉｍｅａｎｄｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎｏｆｔｈｅｓｅｔｗｏｅｎｚｙｍｅｓｏｎｔｈｅａｃｔｉｖｉｔｙｏｆ口一ｇｌｙｃｏｓｉｄａｓｅｗｅｒｅｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ
Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓＮＬ０２ａｎｄＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｒｅｅｓｅｉＲＵＴ— Ｃ３０ｗｅｒｅＣＯ — ｃｕｌｔｕｒｅｄｔｏｐｒｏｄｕｃｅ８一ｇｌｙｃｏｓｉｄａｓｅｂｙｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ．Ｔｈｅｅｆｆｅｃｔｓｏｆ￣ｅｔｏｍ，ｉｎｃｌｕｄｉｎｇｃａｒｂｏｎｓｏｕｒｃｅ，ｎｉｔｒｏｇｅｎｓｏｕｒｃｅ，ｃａｒｂｏｎ・ｎｉｔｒｏｇｅｎｒａｔｉｏ，ｐＨｖａｌｕｅ，ｌｏａｄｉｎｇｖｏｌｕｍｅ，ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ，

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２００９年３月第２４卷第３期中国粮油学报

ＪｏｕｒｎａｌｏｆｔｈｅＣｈｉｎｅ鸵ＣｅｒｅａｌｓａｎｄＯｉｌｓＡｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ

Ｖｄ．２４．Ｎｏ．３Ｍａｒ．２００９

里氏木霉１３一葡萄糖苷酶水解大豆异黄酮糖苷的工艺研究

许晶孙艳梅张永忠

（东北农业大学理学院应用化学系，哈尔滨１５００３０）

摘要研究了里氏木霉口一葡萄糖苷酶的酶学性质，及其水解大豆异黄酮糖苷能力。该酶反应的最适温度为５０℃，最佳ｐＨ为５．０；此酶在ｐＨ４．５。５．５之间和低于６０℃下酶较稳定，在８０℃基本无活力。采用里氏木霉８一葡萄糖苷酶水解的方法，将大豆异黄酮糖苷转化为苷元，以染料木苷水解率为检测指标。通过正交试验确定了该酶水解大豆异黄酮的工艺条件为反应温度５０℃、水解时间９０ｍｉｌｌ、水解介质ｐＨ４．５、加酶量２０

ｕ，大豆异黄酮中染料木苷的水解率为９９％。关键词里氏木霉ｐ一葡萄糖苷酶大豆异黄酮糖苷酶水解中图分类号：ＴＳ２０１．１文献标识码：Ａ文章编号：１００３—０１７４｛２００９１０３—００３ｌ—０４

大豆异黄酮是大豆中含有的一类重要的生物活性物质，具有很多的生物活性功能，在保健食品和医药中有广泛的应用［１‘４Ｉ。大豆中天然存在的大豆异黄酮共有１２种，可以分为两类，即游离型的苷元（心ｙａｍ）和结合型的糖苷（Ｇｌｙｃｏｓｉｄｅｓ）。大豆中的大豆异黄酮９ｒ７％以上是以糖苷形式存在，苷元所占比例很少，仅占总量的２％一３％［５－６Ｊ。近年来的研究表明，在１２种大豆异黄酮中，只有游离型的苷元具有较高的生物活性【７｜。国内市场上，大豆异黄酮保健品中活性成分多为糖苷形式，活性因子含量不足，具有较高生物活性作用的异黄酮深加工产品尚属空白［８—９Ｊ。目前，游离型苷元——染料木黄酮和黄豆苷元

的制备常常采用水解办法。大豆异黄酮糖苷在酸性或碱性条件下糖苷键可断裂，分解为大豆异黄酮苷元和葡萄糖。碱性条件水解所得大豆异黄酮苷元很不稳定，容易降解。酸水解的效率很高，可是有很多人对于酸性条件下大豆异黄酮苷元的稳定性表示怀疑，且酸水解副产物多应用于食品或药品中存在潜在的不安全因素。国外主要研究酶水解，酶水解条件温和，多采用弱酸性的缓冲溶液，大豆异黄酮苷元

基金项目：黑龙江省“十一五”重大科技攻关项目（ＧＡ０６８４０２—４）；大豆生物学教育部重点实验室主任基金项目（ＳＢ０５Ａ０６）收稿口期：２００８—０２—０１作者简介：许品，女。１９７９年出生，硕士，讲师，食品化学通讯作者：张永忠。男。１９５３年出生，教授，硕士生导师。食品化学

不易变性，是工业上制备富含大豆异黄酮苷元的保健食品或药品的十分有前途的途径。通过研究里氏木霉ｐ一葡萄糖苷酶的酶学性质及里氏木霉ｐ一葡萄糖苷酶水解大豆异黄酮糖苷的技术工艺，将大豆异黄酮糖苷水解成大豆异黄酮苷元［１００ｌＪ，这对于增强大豆异黄酮的生物活性，提高其生物利用度，解决市场中大豆异黄酮产品中活性因子含量不足等问题，都具有十分重要的意义。应用里氏木霉ｐ一葡萄糖苷酶水解大豆异黄酮糖苷的化学反应方程式为：

弧Ｈ

染料木黄酮（咎删幽ｅｉｒＩ）

黄豆苷元（“ｄｚｅｍ）

ｌ材料与方法１．１试验材料１．１．１试剂对硝基苯酚一１３一Ｄ吡喃葡萄糖苷（ｐ—ＮＰＧ）、黄豆苷元、染料木苷、黄豆苷、染料木黄酮：美国ｓｉ驰

　万方数据３２中国粮油学报２００９年第３期公司；３０％大豆异黄酮粉：黑龙江双河松嫩大豆生物工程有限责任公司；，里氏木霉｜３一葡萄苷酶：上海宝丰生化试剂公司；甲醇为色谱纯，其余试剂均为国产分析纯。１．１．２仪器ＨＺＳ—Ｈ水浴振荡器：哈尔滨东明医疗仪器厂；７５５ｐｃ紫外／可见分光光度计：上海天美科学仪器有限公司；Ａｇｉｌｅｎｔ一１１００液相色谱仪、Ａｇｉｌｅｎｔ—Ｇ１３１４Ａ泵、Ａｇｉｌｅｎｔ—Ｇ１３１４Ａ紫外检测器、Ａｇｉｌｅｎｔ一１１００Ｃ１８柱（３．９×１５０ｍｍ）色谱柱：美国安捷伦公司。１．２试验方法１。２。ｌ里氏木霉Ｂ一葡萄糖苷酶酶学性质酶反应最适温度：酶液在ｐＨ为５．０，反应时间为１０ｍｉｎ时，分别在４０、４５、５０、５５、６０和６５℃下测定酶比活力【１２］，确定酶反应的最适温度。酶反应的最佳ｐＨ：酶液在温度为５０℃，反应时间为１０ｍｉｎ时，分别在ｐＨ值为４、４．５、５．０、５．５和６．０条件下测定酶比活力，确定反应最佳ｐＨ。酶的热稳定性：分别将酶液置于温度为３０、４０、５０、６０、７０和８０℃的恒温水浴中加热６０ｍｉｎ。在反应温度５０℃，ｐＨ为５．０，反应时间为１０ｍｉｎ的条件下测定酶比活力。分别以各温度下保温过的酶液在不加底物Ｐ—ＮＰＧ的情况下作为空白，进行比色分析，分析酶的热稳定性。酶的ｐＨ稳定性：用磷酸氢二钠一柠檬酸缓冲溶液分别将酶液的ｐＨ值调为４．０、４．５，５．０、５．５和６．０，于５℃下放置２４ｈ。在反应温度为５０℃，ｐＨ为５．０，反应时间为１０ｍｉｎ的条件下测定酶比活力。分别将各ｐＨ值下的酶液于５℃下放置２４ｈ，以不加底物Ｐ—ＮＰＧ的酶液作空白，进行比色分析，分析酶的ｐＨ稳定性。１．２．２大豆异黄酮的测定液相色谱条件：流动相为：甲醇：水＝３５％一４５％梯度洗脱（０～３０ｍｉｎ），色谱柱：Ａｇｉｌｅｎｔ一１１００Ｃ１８柱（３．９Ｘ１５０ｍｍ），柱温：室温，流速：１．０～２．０ｍＬ／ｍｉｎ，检测波长：２６０ｎｎｌ，进样量：５止。标准曲线的绘制：分别准确称取标准品染料木苷（ｇｅｎｉｓｔｉｎ）和黄豆苷（ｄａｉｄｚｉｎ）各１嘴，用甲醇（色谱级）分别定容到１０ｍＬ容量瓶中，制成标准储备液。然后分别从各标准储备液中吸取一定量，用甲醇稀释到１、２、３、４、５ｔ，ｇ／ｍＬ待测。以峰面积（Ｙ）为纵坐标，大豆异黄酮浓度（ｘ）为横坐标，对各组分浓度与峰面积关系进行回归分析，分别绘制标准曲线。１．２．３里氏木霉ｐ一葡萄糖苷酶水解大豆异黄酮糖苷根据对里氏木霉ｐ一葡萄糖苷酶酶学性质研究的结果，设计四因素五水平的正交试验，考察各因素对酶水解的影响。因染料木黄酮活性比黄豆苷元活性高，国外采用染料木黄酮含量的高低为标准评价大豆异黄酮产品的品质，所以最终以染料木苷水解率为检测指标，确定里氏木霉Ｇ一葡萄糖苷酶水解的最佳水解条件。正交试验设计见表１。表１正交试验因素水平表冈素ＡＢＣＤ

水平（温度／℃）（时间／ｍｉｎ）（加酶量／ｕ）（ｐｎ值）

１４０３０４４．０２４５６０８４．５３５０９０１２５．０４５５１２０１６５．５５６０１５０２０６．Ｏ

里氏木霉８一葡萄糖苷酶水解糖苷型大豆异黄酮效率的研究方法：准确称取１．８ｍｇ含有约３０％大

豆异黄酮的粉末作为水解底物，用２０Ｕ

８一葡萄糖苷

酶，在温度为５０℃，ｐＨ为４．５条件下，加缓冲溶液调整反应液体积，使反应溶液总量为３０ｍＬ，水浴震荡（８０ｒ／ｒａｉｎ），水解９０ｍｉｎ后，将反应液在８０一９０℃加热５ｍｉｎ，使酶灭活。经ＨＰＬＣ检测以染料木苷水解

率为检测指标，确定最佳水解条件。１．２．４酶水解大豆异黄酮水解率的确定水解率＝鸪蔫黼麓瑟鬻

Ｘ１００％２结果与讨论２．１里氏木霉｜３一葡萄糖苷酶酶学性质的研究温度和ｐＨ值对里氏木霉８一葡萄糖苷酶比活力的影响如图１和图２所示；该酶的热稳定性和ｐＨ稳定性如图３和图４所示。由图可看出里氏木霉ｐ一葡萄糖苷酶的最适温度为５０℃，最佳ｐＨ为５．０。此酶在低于６０℃下酶较稳定，４０℃加热６０ｍｉｎ，酶比

活力下降４％；５０℃加热６０ｍｉｎ，酶比活力下降１０％；６０℃加热６０ｍｉｎ后，酶比活力下降２９％；在７０℃加热后，酶比活力仅剩９％；在８０℃酶基本无活力。可

６．６．６．Ｒ６·

笔

５．５．

３５４０４５５０５５６０６５７０温度／℃

图１温度对里氏木霉Ｂ一葡萄糖苷酶比活力的影响

　万方数据第２４卷第３期许晶等里氏木霉ｐ一葡萄糖苷酶水解大豆异黄酮糖苷的工艺研究

３３

见，该里氏木霉ｐ一葡萄糖苷酶的热稳定性较好。该酶在４．５～５．５之间酶活基本稳定，可保存酶比活力８５％１２２１－，且在ｐＨ为５．ｏ时酶活最高。因此保存酶

时可将ｐＨ调至５．０。

６·５－

．Ｒ５·烬５．

筮５．５·４．３．０４．０５．Ｏ６．０７．Ｏ

ｐＨ值

圈２ｐＨ值对里氏本霉ｐ一葡萄糖苷酶比活力的影响

长赡墨

２０３０４０５０６０７０∞９０温度／＇１３

圈３里氏木霉８一葡萄糖苷酶热稳定性曲线

２Ｒ耋ｔ

０ｐＨ值图４里氏木霉ｐ一葡萄糖苷酶ｐＨ稳定曲线２．２大豆异黄酮的标准曲线用高效液相色谱法测定黄豆苷、染料木苷得到

标准曲线见表２。表２大豆异黄酮的标准曲线组分Ｘ线形范围标准荫线相关系数黄豆苷ｉ一５ｔ，ｅ，／ｍＬＹ＝３９．０３４Ｘ一１．４０２Ｏ．９９７９

染料木苷１～５ｔ，ｅ，／ｍＬＹ＝３５．３０９Ｘ一２．０２３０．９９８６

２．３里氏木霉ｐ一葡萄糖苷酶水解大豆异黄酮糖苷效率根据对水解时间、溶液ｐＨ值、水解温度以及加酶量进行四因素五水平的正交试验，各因素水平和正交试验结果见表３、表４和表５。通过极差分析结果可以看出，影响里氏木霉ｐ一葡萄糖苷酶水解大豆异黄酮效率的主次因素依次为

Ｂ（水解时间）＞Ｃ（加酶量）＞Ｄ（ｐＨ值）＞Ａ（温度）。表明水解时间和加酶量是影响糖苷型大豆异黄酮水解的主要因素，而ｐＨ值和温度是次要因素。从方差

分析也可得到同样结论，Ｂ（水解时间）和ｃ（ＪＪｎ酶量）两因素对水解率的影响达到显著水平。从上述分析

表３正交试验方案及结果

表４里氏木霉口一葡萄糖苷酶水解试验极差分析袭５方差分析表注：Ｆｏ．岱（４，４）＝６．３９Ｆｏ川（４，４）＝１６　万方数据