细胞毒性试验培训班用讲义
实验五 小鼠骨髓细胞微核试验 PPT课件
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经口急性毒性 实验
实验目的 实验内容 实验材料 实验步骤 实验结果 结果分析
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2. 实验原理
微核试验是用于染色体损伤和干扰细 胞有丝分裂的化学毒物的快速检测方法。 微核是指存在于细胞中主核之外的一种颗 粒，大小相当于细胞直径的1/20～1/5， 呈圆形或杏仁状，其染色与细胞核一致， 在间期细胞中可以出现一个或多个。一般 认为微核是细胞内染色体断裂或纺锤丝受 影响而在细胞有丝分裂后期滞留在细胞核 外的遗传物质。
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经口急性毒性 实验
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4. 实验步骤
求在接触化学毒物后设立不同的采样时间点。 考虑到以上两方面的原因，建议采用多次染毒 的方法。其中以4次染毒比较方便合理。即每天 染毒一次，连续4天，第5天取样。这样，取样 一次就能覆盖24～72h高峰，如果高峰延迟到 96h也不会漏掉。 4.剂量选择：受试化学毒物的最大剂量除受溶 解度大小所限外，应达到最大耐受量。一般情 况下，应设3～5个或更多剂量组，剂量覆盖的 范围要达到3个数量级以上。同时还应设立阳性 对照组和阴性对照组。阳性对照组可用环磷酰 胺(50-100mg/kg)或丝裂霉素C(10mg/kg)腹腔注 射1次或2次。阴性对照组使用等体积的溶剂。
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经口急性毒性 实验
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6. 注意事项
1.良好的骨髓涂片及良好的染色，是本实 验的关键步骤。 2.熟悉并正确区分跟中骨髓细胞。
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兽医毒理学讲义
兽医毒理学讲义目录第一章绪论···································································- 2 -第一节概论 ·································································- 2 -第二章毒物的生物转运与生物转化········································- 3 -第一节毒物的生物膜转运 ···············································- 3 -第三章毒作用···································································- 7 -第一节毒作用的分类 ·····················································- 7 -第二节毒作用机理 ························································- 7 -第三节影响毒作用的因素 ·············································- 12 -第四章动物性食品中兽药及化学物残留································- 14 -第一节概述······························································- 14 -第五章毒理学的研究与方法···············································- 15 -第六章外来化学物的安全性···············································- 18 -第一节食品安全性毒理学评价 ·······································- 18 -第二节兽药临床前安全性毒理学评价试验指导原则···········- 21 -附：名词解释 ··································································- 23 -第一章绪论第一节概论一、毒理学的目的其目的在于评价工业化学物，环境污染物和其它的物质对人、畜所致的危害。
细胞实验技术课堂PPT第九讲细胞培养总结
D 0.051 2.632 2.681 2.681 2.611 2.484 2.438 2.545 2.502 0.061 0.052 0.057 450
E 0.051 2.652 2.661 2.617 2.448 2.579 2.641 2.665 2.62 0.05 0.051 0.049 450
（二）细胞培养常用试剂
1：水
细胞培养用水必须非常纯净，不含有离子和其他的杂质。 需要用新鲜的双蒸水、三蒸水或超纯水
2：细胞培养基
• 市场上可提供干粉培养基和液体培养基 • 常用的培养基种类
– RPMI-1640、高糖DMEM、低糖DMEM、F12 等
细胞培养基应用选择
• 选择培养基没有一定的标准，有几点建议可供参考： •
储存温度 杀灭细菌
-20℃
G(+)
-20℃
G(+) , G(-)
-20℃ G(+) , G(-), 支原体
-20℃
真菌
-20℃
真菌
（三）、器材和液体的准备
• 细胞培养用的玻璃器材
– 培养瓶、吸管等在清洗干净以后，装在铝盒和铁筒 中，160℃，2小时干烤灭菌后备用
• 手术器材、瓶塞、配制好的PBS液
21 A 0.215 B 0.042 C 0.042 D 0.045 E 0.07 F 0.041 G 0.045 H 0.042
2 0.042 1.979 2.085 2.096 2.26 2.22 2.323 0.044
3
4
G
0.2573 0.1023 0.2913 0.0693 0.2773 0.1063 0.2643 0.1123 0.0013 0.0013
H
细胞毒性试验总结
（一）实验前应明确的问题1. 选择适当的细胞接种浓度.一般情况下,96孔培养板的一内贴壁细胞长满时约有105个细胞.但由于不同细胞贴壁后面积差异很大，因此，在进行MTT试验前，要进行预实验检测其贴壁率、倍增时间以及不同接种细胞数条件下的生长曲线，确定试验中每孔的接种细胞数和培养时间，以保证培养终止致细胞过满。
这样，才能保证MTT结晶形成酌量与细胞数呈的线性关系。
否则细胞数太多敏感性降低，太少观察不到差异。
2。
药物浓度的设定.一定要多看文献,参考别人的结果再定个比较大的范围先初筛。
根据自己初筛的结果缩小浓度和时间范围再细筛。
切记！否则，可能你用的时间和浓度根本不是药物的有效浓度和时间。
3. 时间点的设定。
在不同时间点的测定OD值，输入excel表，最后得到不同时间点的抑制率变化情况，画出变化的曲线，曲线什么时候变得平坦了（到了平台期）那个时间点应该就是最好的时间点（因为这个时候的细胞增殖抑制表现的最明显）.4. 培养时间.200ul的培养液对于10的4~5次方的增殖期细胞来说，很难维持68h，如果营养不够的话,细胞会由增殖期渐渐趋向G0期而趋于静止,影响结果,我们是在48h换液的。
5。
MTT法只能测定细胞相对数和相对活力,不能测定细胞绝对数。
做MTT时，尽量无菌操作，因为细菌也可以导致MTT比色OD值的升高。
6。
理论未必都是对的。
要根据自己的实际情况调整。
7。
实验时应设置调零孔，对照孔，加药孔。
调零孔加培养基、MTT、二甲基亚砜。
对照孔和加药孔都要加细胞、培养液、MTT、二甲基亚砜，不同的是对照孔加溶解药物的介质，而加药组加入不同浓度的药物。
8。
避免血清干扰。
用含15％胎牛血清培养液培养细胞时，高的血清物质会影响试验孔的光吸收值.由于试验本底增加，会试验敏感性。
因此，一般选小于10％胎牛血清的培养液进行。
在呈色后，尽量吸净培养孔内残余培养液.(二）实验步骤贴壁细胞：1. 收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度,每孔加入100ul，铺板使待测细胞调密度至1000—10000孔,（边缘孔用无菌PBS填充）。
医疗器械工程导论5细胞毒性评价
细胞形态学的检测方法
直接观察
光镜 电镜检测技术
• 透射电镜 • 扫描电镜
组织学染色 免疫细胞化学染色
免疫荧光染色方法 ABC免疫染色方法
细胞活力的检测方法 细胞遗传学的检测方法 有关分子生物学技术
生物学评价
直接观察
相差倒置显微镜
无需制样
体外细胞培养评价技术
细胞形态学的检测方法
直接观察
光镜 电镜检测技术
• 透射电镜 • 扫描电镜
组织学染色 免疫细胞化学染色
免疫荧光染色方法 ABC免疫染色方法
细胞活力的检测方法 细胞遗传学的检测方法 有关分子生物学技术
生物学评价
免疫细胞化学染色
将细胞培养技术与免疫学技术结合
Color Cell/Tissue
Substr. Color
P1成骨细胞(6d)免疫细胞化学染色.× 200
P1成骨细胞(6d)免疫细胞化学染色.× 40
cytotoxicity of Si-substituted HA composite
Immunofluorescence Stain
多光子激光共聚焦显微镜观察结果 正常成骨细胞（细胞骨架） HA/TCP材料表面结构
体外细胞培养评价技术
细胞形态学的检测方法
直接观察
光镜 电镜检测技术
• 透射电镜 • 扫描电镜
组织学染色 免疫细胞化学染色
免疫荧光染色方法 ABC免疫染色方法
细胞活力的检测方法 细胞遗传学的检测方法 有关分子生物学技术
生物学评价
细胞活力检测
染料 克隆（集落）形成试验 四唑盐（MTT）比色试验 Alamar Blue比色试验 碱性磷酸酶测定（ALP） 乳酸脱氢酶测定（LDH） 细胞蛋白质含量测定法 细胞蛋白质合成测定法
2013《细胞培养》实验讲义
《细胞培养》实验讲义实验一细胞培养室无菌环境的建立和实验器具的清洗、包装和灭菌一、原理：防止污染是决定细胞培养成功的首要条件。
由于体外细胞缺乏抗感染能力，因此无菌技术在细胞培养中显得尤为重要。
二、目的要求：通过实验，培养学生良好的卫生观念，确立细胞培养的无菌意识；掌握细胞培养室的消毒及灭菌方法；掌握培养用品的高温消毒方法。
通过细胞培养室和主要设备的无菌环境建立，逐步掌握无菌操作概念。
掌握细胞培养室、培养箱和超净台的消毒方法；掌握玻璃器皿、金属器械、橡胶制品的清洗、包装和灭菌方法。
三、实验材料：细胞培养室环境、培养箱、超净台、边台、紫外线灯、70％酒精等等；玻璃培养瓶、玻璃滴管、手术器械、圆筒、铝制饭盒等电动高压锅、烘干箱、超声洗涤机、酸液及酸缸、纯水仪等四、操作方法：1、环境消毒细胞培养室环境消毒用紫外线灯照射30～60分钟以上才能进入其内工作。
培养箱箱体内壁和隔板可用70％酒精擦拭。
超净台操作野主要用紫外线消毒。
2、器械清洗（1）玻璃器皿的清洗：浸泡→刷洗→浸酸→冲洗（详见课件）（2）塑料器皿冲洗反复利用塑料器皿需经清水浸泡后流水冲洗；流水冲洗→晾干→2％氢氧化钠浸泡过夜→清水冲洗→2～5％盐酸浸泡30min→清水冲洗→蒸馏水漂洗3遍→晾干后包装，以备灭菌。
（3）胶塞等橡胶类用品的处理新胶塞（含有大量滑石粉）：用清水冲洗→ 2％NaOH煮沸15min→清水冲洗→2～5％盐酸煮沸15min→清水冲洗5次以上→蒸馏水漂洗5遍以上→蒸馏水煮沸10min →倒掉废水，余热烘干胶塞备用（或经101.3 kPa高压灭菌）；旧胶塞：用清水浸泡→ 2％NaOH煮沸10～20min →清水冲洗→1％盐酸煮沸30min→清水和蒸馏水漂洗5遍以上→蒸馏水煮沸10min →倒掉废水，余热烘干胶塞备用（也可经101.3 kPa高压灭菌）。
（4）金属器械的清洗新购金属器械：汽油纱布擦去油脂，清水冲洗→酒精棉擦拭，晾干；用过的金属器械：清水煮沸消毒→擦拭干净→包装好高压灭菌消毒。
肿瘤细胞迁移实验(细胞划痕法)讲义
抗肿瘤药物5-氟尿嘧啶对肿瘤细胞迁移的影响（细胞划痕法）实验导读瘤组织的增殖失控、瘤细胞的分化异常、瘤细胞具有侵袭和转移的能力是恶性肿瘤最基本的生物学特征，而侵袭和转移又是恶性肿瘤威胁患者健康乃至生命的主要原因。
因此研究肿瘤侵袭和转移的规律及其发生机制，对恶性肿瘤的防治有重要意义。
肿瘤转移是指恶性肿瘤细胞从原发部位侵入淋巴管、血管或体腔，至靶组织或靶器官，长出与原发瘤不相连续而组织学类型相同的肿瘤。
前者称为原发瘤，后者称为转移瘤或继发瘤。
图1 肿瘤转移示意图根据肿瘤异质性理论，大多数恶性肿瘤最初虽属单克隆起源，但它在不断增殖演进至临床明显的肿瘤时，由于瘤细胞遗传性状的不稳定性(来自基因突变或缺失等)而不断地变异，造成该肿瘤内瘤细胞亚群表型的多样性，诸如瘤细胞的侵袭性、生长速率、转移能力，核型乃至对激素的反应性和抗肿瘤药物的敏感性等，这些瘤细胞亚群具有被此不同的特性即所谓异质性。
异质性与肿瘤转移直接有关的就是癌细胞的转移潜能，癌细胞的转移潜能有高低之分，具有高转移潜能的筋细胞易发生转移。
肿瘤细胞的运动性，来源于细胞运动“接触抑制”的概念。
通过体外培养正常和恶性结缔组织细胞，发现正常纤维母细胞在移动过程中引起的皱栖脑膜与其他细胞的表面接触时，往往产生细胞膜活动的抑制和移动中细胞的缩短，然后停止。
当纤维母细胞生长过程中在培养皿上融合形成一单层时，细胞运动即显著受到抑制。
间变的肉瘤细胞则缺乏接触抑制，瘤细胞的运动不会被正常纤维母细胞所抑制。
针对肿瘤转移这一复杂的过程，人们研制了各种抗转移药物，如血小板凝集抑制剂、血管生成抑制因子、内皮稳定因子、干扰素－α以及其他化学药物。
细胞划痕法是测定了肿瘤细胞的运动特性的方法之一。
其借鉴体外细胞致伤愈合实验模型，在体外培养的单层细胞上，划痕致伤，然后加入药物观察其抑制肿瘤细胞迁移的能力。
下图即为划痕实验的示意图，图中可见，在细胞层上出现一道空痕（A），当加入药物后，由于药物的作用使细胞迁移受到抑制(B)，而未加入药物的细胞保持了原有的迁移能力，在一段时间后通过迁移将划痕掩盖(C)。
动物细胞工程试验讲义(学生版)
实验一细胞培养用品的清洗、消毒与灭菌体外人工培养的细胞缺乏抗感染能力，所以能否防止污染是决定培养成败的关键。
即便使用设备完善的实验室，若实验者粗心大意，技术操作不规范，也会导致细胞污染。
无菌技术原理是阻止无菌的、未被污染的物体与任何有菌的、被污染的物体相接触。
任何直接或间接地与培养细胞相接触的物体必须经过严格的清洗和消毒程序。
1.实验目的掌握细胞培养中所使用的器械的清洗与消毒方法。
2.实验原理清洗时采用化学药剂清除物体表面污垢的方法，它是借助清洁剂对物体表面污染物或覆盖层进行化学转化、溶解、剥离以达到脱脂、除锈和去污的效果。
消毒是指杀死病原微生物（但不一定能杀死细胞芽孢）的方法。
通常用化学方法来达到消毒的作用。
灭菌可除去或杀灭物体中全部微生物。
应根据微生物的种类、污染状况、被污染物体的性质与状态，选择单独或组合灭菌方法。
能否达到灭菌的目的，通常要采用无菌实验法进行判定。
对灭菌操作时采用的温度、压力等能否适合灭菌的条件，必须得到十分的确认。
在灭菌条件选定后，还要进行灭菌效果的确认，以保证使用的各种灭菌条件适合于要杀灭的目标菌。
灭菌的程度受灭菌的时间与灭菌剂强度的制约。
灭菌常用的方法有化学试剂灭菌法、射线灭菌法、干热灭菌法、湿热灭菌法和过滤除菌法等。
可根据不同的需求，采用不同的方法，如培养基灭菌一般采用湿热灭菌法，空气灭菌则采用过滤除菌法。
3．实验准备仪器设备：超净工作台、超声清洗器、高压灭菌锅、干燥箱、过滤器、紫外灯、0.22um 微孔滤膜、电磁炉、电子分析天平、铝箔、试管刷等。
实验材料：玻璃器皿（三角瓶、烧杯、量筒、试剂瓶）塑料器皿（离心管、吸头等）、眼科剪刀、眼科镊、金属饭盒、报纸等。
主要试剂：75%乙醇、盐酸、0.2%的新洁尔灭、高锰酸钾、重铬酸钾、浓硫酸、次氯酸钠(NaClO)、洗涤剂、蒸馏水、去离子水等。
4．试验方法4.1 玻璃器皿的清洗（1）浸泡：初次使用和培养用的玻璃器皿都需要先用清水浸泡，水要完全进入器皿中，不要留有气泡。
A特殊毒性实验_PPT幻灯片
2、哺乳动物细胞基因突变试验
62
体外培养细胞的基因正向突变试验。原理是在加 入和不加入代谢活化系统的条件下，使细胞暴露 于受试物一定时间，然后将细胞再传代培养，突 变细胞在含有6—硫代鸟嘌呤或三氟胸苷的选择性 培养液中能继续分裂并形成集落。基于突变集落 数，计算突变频率以评价受试物的致突变性。突 变频率是指观察到的突变细胞数与存活细胞数的 比值。
移码突变。
35
（一）以DNA为靶的直接诱变
（3）碱基类似物的（base analogue）取代 取代后的碱基类似物出现异构互变,发生错误配对而造成碱基置换。 例如：5-溴脱氧尿嘧啶（5-BU）取代T，2- 氨基嘌呤（2-AP）取代G。
36
37
胸腺嘧啶
38
（一）以DNA为靶的直接诱变
（4）改变或破坏碱基化学结构
修复过程中的酶
复制 46
47 切除修复
§4 突变的后果
体细胞突变
仅影响接触致突变物 的个体，不影响下一 代。
肿瘤、畸形、动脉粥 样硬化、糖尿病及衰 老等。
48
生殖细胞突变 可影响下一代，甚至
人类的基因。 基因突变对人类的影
响程度分为五类。
49
① 对机体无影响，如同义突变； ② 导致对健康无影响的正常人体生化组成的遗传学变异； ③ 导致遗传易感性的改变； ④ 导致遗传性疾病； ⑤ 致死性突变，造成配子死亡、死胎及自发流产等。
55
（1）什么是细菌回复突变试验？ 以营养缺陷型的突变体菌株为指示生物检测基因突变的体
外试验。 常用的菌株有组氨酸营养缺陷型鼠伤寒沙门氏菌和色氨酸
营养缺陷型的大肠杆菌。
细胞生物学实验讲义
细胞生物学实验讲义细胞内DNA和RNA的显示一、目的要求1、掌握显示细胞内DNA和RNA的方法。
2、熟悉细胞内DNA和RNA的分布位置。
二、实验原理核酸是酸性的，它们对于碱性染料派洛宁和甲基绿具有亲和力。
利用这两种染料的混合液处理细胞，可使其中的DNA和RNA呈现出不同的颜色，这种颜色上的差异由DNA 和RNA聚合程度的不同所引起，因为甲基绿分子上有两个相对的正电荷，它与聚合程度较高的DNA分子有较强的亲和力，可使DNA分子染成蓝绿色；而派洛宁分子中仅一个正电荷，可与低聚分子RNA相结合使其染成红色。
这样细胞中的DNA和RNA可被区别开来。
三、器材与试剂1、器材：光学显微镜、载玻片、盖玻片、染色缸、染色架、注射器。
2、材料：鸡血。
3、试剂：0.2mol/L醋酸缓冲溶液、2%甲基绿染液、1%派洛宁染液、甲基绿·派洛宁混合染液。
4、试剂的配制（1）2mol/L醋酸缓冲溶液：用2ml注射器抽取 1.2ml冰乙酸加入到98.8ml蒸馏水中，混匀。
再称取醋酸钠（NaAC·3H2O）2.72g 溶于100ml蒸馏水中，使用时按2：3的比例混合两液即成。
（2）2%甲基绿染液：称取 2.0g去杂质甲基绿溶于100ml0.2mol/L的醋酸缓冲溶液中即成。
甲基绿粉中往往混有影响染色效果的甲基紫，它们必须预先除去，其方法是将甲基绿溶于蒸馏水中，放在分液漏斗中加入足量的氯仿（三氯甲烷）用力振荡，然后静置，弃去含甲基紫的氯仿，再加入氯仿重复数次，直至氯仿中无甲基紫为止，最后放入40C温箱中干燥后备用。
（3）1%派洛宁染液：称取1g派洛宁（吡罗红）溶于100ml0.2/L醋酸缓冲溶液中混匀。
（4）甲基绿派洛宁混合染液：将2%的甲基绿液和1%的派洛宁液以5：2的比例混合均匀即可。
该液应现配现用，不宜久置。
四、内容与方法1、取鸡血一小滴在干净的载玻片一端，用另一载玻片的一端紧贴血滴，待血液沿其边缘展开后，以30~400角向玻片的另一端推去，制成较薄的血涂片，室温下晾干。
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•
盖法
哪些产品需要进行细胞毒性 试验？
与人体接触或植入体内的医疗器械都需 要进行细胞毒性试验。 接触部位： 1）表面：皮肤、粘膜、损伤表面 2）外部接入：血路间接、组织/骨/牙、 循环血液 3）体内植入：组织/骨、血液
试验材料：细胞系
推荐使用ATCC CCL1(NCTC clone 929)[小鼠成纤维细胞]或ATCC CCL2 (Hela)[人上皮细胞]。如能证明试验的重现性 和精确性，也可选用其他细胞系。优先采用已 建立的细胞系并应从认可的贮源获取。试验应 使用无支原体污染细胞。 用选定的细胞系和培养基制备试验所需的 细胞。使用冻存细胞时, 如加有细胞保护剂应 除去, 使用前至少传代培养一次。
国内标准简介
• 1987年，卫生部标准WS5-1-1987 《医用热 硫化甲基乙烯基硅橡胶》：琼脂覆盖法 • 1996年，GB/T16175-1996 《医用有机硅材 料生物学评价试验方法》：细胞增殖度法 • 1997年，卫生部第81号文《生物材料和医疗 器械生物学评价技术要求》：推荐了琼脂覆盖、 分子滤过、细胞生长抑制三种方法。 • 1997年，GB/T 16886.5-1997等同采用国际 标准ISO 10993-5：1992
有几类细胞毒性试验方法？
GB/T 16886.5－2003/ISO 109935:1999中推荐了三类细胞毒性试验： 1）浸提液试验 2）直接接触试验 3）间接接触试验（包括琼脂扩散试 验、滤膜扩散试验）
常用的细胞毒性试验方法
• 1）浸提液试验（四唑盐（MTT）比色法 或MTT法）：哺乳动物细胞的线粒体酶可 将黄绿色的MTT降解形成蓝紫色的物质， 用二甲基亚砜（DMSO）将其溶解成溶液， 用酶标仪测定其浓度，从而定量测定细胞 的存活比例。该试验用于细胞毒性定量评 价。对该试验有干扰的供试品不适于本试 验。 2）间接接触试验：琼脂扩散法或琼脂覆
细胞复苏步骤
1）准备一杯40度的温水。 2）将细胞从液氮罐中取出迅速放入温水中， 晃动使之溶解，注意过程控制在半分钟内。 3）离心，弃上清，加入新鲜培养基，接种 至新培养瓶中。
试验材料：仪器
超净工作台、CO2培养箱、冰箱、倒置光 学显微镜、光学显微镜、蒸汽灭菌器、液 氮瓶、抽滤瓶、电热恒温水浴锅、96孔培 养板、可调式微量加样器、酶标仪纯水机、 液氮罐、天平、离心机等。
试验步骤:MTT法
e) 每个培养间期后,每孔加入MTT溶液20µl，置 含5％二氧化碳的二氧化碳培养, 在37℃±2℃ 温度下培养5小时。 f) 弃去孔内液体，每孔分别加入200µl DMSO， 将培养板放置10分钟，水平振摇使孔内溶液颜 色均匀。 g) 用酶标仪测定吸光度，可采用双波长测定， 选用的波长可为570nm和630nm。
有关法规
1，法规：医疗器械监督管理条例（国务院令 第276号） 2，规章：医疗器械生产监督管理办法（局令 第12号） 医疗器械生产企业质量体系考核办法（局令第 22号） 医疗器械分类规则（局令第15号） 3，规范性文件：关于发布医疗器械注册产品 标准编写规范的通知
有关标准
1，行业标准 YY/T 0127.9 口腔材料生物试验方法： 细胞毒性试验（琼脂覆盖及分子滤过法） YY/T 0268 用于口腔的医疗器械生物 相容性临床前评价 第1单元：评价与试验 项目选择 YY 0325 一次性使用无菌导尿管
细胞毒性试验
2008-092008-09-22
什么是细胞毒性试验？
细胞毒性试验是一类在离体状态下 模拟生物体生长环境，检测医疗器械和 材料接触机体组织后生物学反应的体外 试验。它是医疗器械生物学评价体系中 最重要的检测指标之一，也是几乎各种 用途的医疗器械或材料临床应用前的必 选项目。国内外无论哪项医疗器械生物 学评价标准中都把细胞毒性试验列为首 位，作为首选项目。
试验步骤:MTT法
c) 弃去原培养液，每孔加入100µL的空白对照液， 阴性对照液，阳性对照液，100％ 和50％浓 度的试验样品浸提液。每组至少设8孔。 注：浸提原液或以培养基作稀释剂的系列浸 提稀释液。 采用0.9%氯化钠注射液浸提时, 建议在稀释浸 提液时使用浓缩的(如2倍或 5倍)培养基。 d) 置含5％二氧化碳的二氧化碳培养箱, 在 7℃±2℃温度下进行培养。培养间期可分 为24h、48h、 72h。
国外标准简介
• 1979年，美国国家标准局和牙科协会 （ANSI/ADA41-1979）首先发布“口腔材 料生物学评价标准”，其中规定用51Cr标记法 检测供试品的细胞毒性。 • 1984年，国际标准化组织（ISO）颁布的 ISO/TR 7405:1984《牙科材料生物学评价》 中推荐了琼脂覆盖、分子滤过和51Cr标记三种 试验方法。 • 1989年，ISO专门成立TC194技术委员会， 制定了ISO 10993 《医疗器械生物学评价》 系列标准。 在ISO 10993-5：1992中，提出 了三类细胞毒性试验方法，即浸提液试验、直 接接触试验和间接接触试验。
试验材料：耗材
培养瓶、培养板、吸管、冻存管、离心管、 滤器等。 与供试品接触的所有器具置压力蒸汽灭菌 器内 121℃灭菌 20分钟。
试验材料：试剂
培养基（MEM、DMEM、IMEM、 RPMI1640等）、血清（小牛血清、新生牛血 清、胎牛血清、马血清等）、消化液、L-谷氨 酰胺、抗生素液、NaHCO3 溶液、二甲基亚砜、 平衡盐溶液。 含血清或不含血清培养基应符合选定细胞系的 生长要求。 注: 培养基中允许含有对试验无不利影响的抗 生素。
有关标准
2，推荐性标准 GB/T 16886.1 医疗器械生物学评价 第1部分： 评价与试验 GB/T 16886.5 医疗器械生物学评价 第5部 5 分：细胞毒性试验（体外法） GB/T 16886.12 医疗器械生物学评价 第12部 分：样品制备与参考样品 GB/T 14233.2 医用输血、输液、注射器具 检验方法 第二部分：生物试验方法 GB/T 16175 医用有机硅材料生物学评价试 验方法
细胞毒性试验的目的和意 义
（一）目的：评价医疗器械和材料致细胞毒性反 应的潜在性，并预测最终生物体应用时的组织 细胞反应。通过体外细胞培养技术，可检测供 试品接触细胞后细胞发生生长抑制、功能改变、 溶解、死亡或其它毒性反应。 （二）意义：可在短期内较经济、简便地筛选出 批量供试品的细胞毒性，它为体内法（动物试 验）的进行与否提供了先决条件，对新型医疗 器械和生物材料的研制和应用提供了重要保证。
试验材料：供试液与对照
供试液：应按产品标准规定制备样品浸提液。 阴性对照：选用经确认过的不产生细胞毒性 反应的材料，例如高密度聚乙烯。 阳性对照：选用经确认过的可重现细胞毒性 反应的材料，例如含有有机锡添加剂的聚氯乙 烯。
试验步骤:MTT法
a) 培养细胞直至达到其对数生长期末细胞趋于 融合，用细胞消化液消化分散细胞，用细胞培 养液配制成1×104个/mL的细胞悬液。取96 孔培养板，每孔中加入100µL的细胞悬浮液。 轻化碳培养箱内, 在 37℃±2℃温度下培养24小时。
试验步骤:MTT法
h) 结果计算： i) 结果判断： 根据RGR值，判定试验样品的细胞毒性。 阴性对照组反应不大于1级。 1 阳性对照组反应至少为3级。 阴性对照组和阳性对照组反应不符合规定时应重 新试验。
试验周期及费用
1）以MMT法为例：一般需要 1－2周。 注意： 用选定的细胞系和培养基制备试验所需的 细胞。使用冻存细胞时, 如加有细胞保护剂 , 应除去, 使用前至少传代培养一次。 2）根据国家发展和改革委员会、财政部文件 （发改价格[2003]213号），细胞毒性试 验的收费标准为2000元/项。
YZB标准中常见的问题
• 不写明采用什么方法进行试验。 • 只写无细胞毒性，无级别要求。 • 无供试液的浸提条件。
试验原则
体外细胞试验方法较多，且各有其特点， 各试验方法之间很难达到完全一致。因此在选 择试验方法时，须根据“最接近应用状况”的 原则，尽可能合理地选择供试品与细胞的接触 方式和检测生物学终点评价方法。