实验三、食品中蜡样芽孢杆菌的检验34页PPT
致病菌检验-蜡样芽孢杆菌.
V-P反应
＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ － － － － － － －
明胶液化
＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ － ＋ ＋
与类似菌鉴别：
表2 蜡样芽孢杆菌与其他类似菌的鉴别
项目 过氧化氢酶 动力 硝酸盐还原 酪蛋白分解 卵黄反应 葡萄糖利用（厌氧） 甘露醇 木糖 溶血 已知致病菌特性 巨大芽 孢杆菌 ＋ ＋/－ － ＋/－ － － ＋ ＋/－ － 蜡样芽孢 杆菌 ＋ ＋/－ ＋ ＋ ＋ ＋ － － ＋ 产生肠毒素 苏云金芽孢 杆菌 ＋ ＋/－ ＋ ＋/－ ＋ ＋ － － ＋ 对昆虫致病的 内毒素结晶 蕈状芽孢杆菌 炭疽芽孢杆菌 ＋ － ＋ ＋/－ ＋ ＋ － － －/＋ 假根样生长 ＋ － ＋ －/＋ ＋ ＋ － － －/＋ 对动物
能分解葡萄糖，麦芽糖，蔗糖，水杨苷，产酸不产气。
不分解乳糖，甘露醇，阿拉伯糖，山梨醇，木糖 H2S（-），尿素酶试验（-）卵磷脂酶（+）， V-P试验（+），液化明胶。
二、致病性
食品蜡样芽胞杆菌数量>106/g（mL）时常可导致食物中毒，
导致中毒的主要原因是其产生的肠毒素 。 肠毒素类型： 耐热性肠毒素：100℃30min不能被破坏，常在米饭中形成。 不耐热肠毒素：能在各种食物中形成。
表1 蜡样芽孢杆菌生化分型
生化试验
型别 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
柠檬酸盐利用
＋ － ＋ － － ＋ ＋ － － － ＋ ＋ － ＋ ＋
硝酸盐还原
＋ ＋ ＋ － － － － ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ － － －
淀粉水解
＋ ＋ － ＋ － － ＋ － － ＋ ＋ － ＋ － ＋
临床症状：食物中毒，分为呕吐型和腹泻型两类。
蜡样芽胞杆菌检验
生化鉴定
挑取纯培养的单个菌落，进行 酪蛋白分解试验（+）、动力试验 （大多+）、V-P试验（+）、硝酸盐 还原试验（+）、糖发酵试验（+）、 溶菌酶耐性试验（+）。
根状生长试验
挑取单个可疑菌落平行划线接种于 营养琼脂平板上，30 ℃±1 ℃培养 24 h±2 h 蕈状芽胞杆菌形成根状生长的特征 蜡样芽胞杆菌菌株形成粗糙的似毛 玻璃状或融蜡状的菌落
蜡样芽胞杆菌检验 标准操作程序
国巢湖国巢
背景
革兰氏阳性芽胞杆菌 在自然界广泛存在 可引起食物中毒等食源性疾病
背景
国际上，早在1906年就有由该菌引起的病例报道，目前全世界 每年都有相当数量的病例发生
在国内，首次报告是1973年南京某托儿所儿童因进食泡饭引起呕 吐型蜡样芽胞杆菌食物中毒，至今除西藏外，每个省、自治区、直辖 市已经都有报，有些地区甚至占细菌性食物中毒的首位
溶血试验
挑取纯培养的单个可疑菌落接种于 TSSB琼脂（胰酪胨大豆羊血琼脂） 平板上，30 ℃±1 ℃培养24 h±2 h。
溶血试验
蜡样芽胞杆菌菌落为浅灰色，不透明，似白色 毛玻璃状，有草绿色溶血环或完全溶血环 苏云金芽胞杆菌和蕈状芽胞杆菌呈现弱的溶血 现象 多数炭疽芽胞杆菌为不溶血 巨大芽胞杆菌为不溶血
使用前，如MYP琼脂平板表面有水珠，可放在25℃ ～ 50℃的培养 箱里干燥，直到平板表面的水珠消失
30 ℃±1 ℃培养24 h±2 h 同一稀释度3个平板所有菌落数合计 在15CFU～150CFU典型或可疑蜡样芽 胞杆菌菌落的平板，进行计数
从典型菌落中至少挑取5个（小于5 个全选），划线接种于营养琼脂平 板， 30 ℃±1 ℃培养24 h±2 h， 进行确证实验
各类食品卫生微生物的检验幻灯片PPT
的个人卫生、用水、运输过程等不洁造成污染。
三、乳与乳制品中微生物的检验方法
(一）样品的采集
1、散装或大型包装的乳品
用灭菌刀、勺取样，采样时应注意取样部位、取样 量等的代表性：每件样品数量不少于200g，放入灭 菌容器内及时送检。鲜乳一般不应超过4h，在气温 较高或路途较远的情况下应进行冷藏，不得使用任 何防腐剂。
2、小型包装的乳品
应采取整件包装，注意包装完整。 各种小型包装的乳品与乳制品的取量为：生奶1瓶 或1包；消毒奶1瓶或1包；奶粉1瓶或1包；奶油1块 (113g)；酸奶1瓶或1包；炼乳1瓶或1罐；奶酪(干酪)1 个。
3、奶油
➢ 用无菌操作打开奶油的包装，取适量检样置于灭菌 三角瓶内，在45℃水浴或恒温箱中加温，溶解后立 即将烧瓶取出，用灭菌吸管吸取奶油25mL放入另一 含225 mL灭菌生理盐水或灭菌奶油稀释液的烧瓶内 (瓶装稀释液应预置于45℃水浴中保温，做10倍递增 稀释时所用的稀释液相同)，振摇均匀，从检样溶化 到接种完毕的时间不应超过30min。
2、检验肉及肉制品受外界环境污染的程度或 是否带有某种致病菌
棉拭采样法和检样处理
一般可用板孔5cm2金属制作规板压在受检样品上，将灭菌棉 拭稍蘸湿，在板孔5cm2的范围内揩抹多次，然后将规板板孔 移压另一点，用另一棉拭揩抹，如此共移压揩抹10次，总面 积50cm2，共用10支棉拭。每支棉拭在揩抹完毕后应立即剪 断或烧断后投入盛有50mL灭菌水的三角瓶或大试管中，立 即送检。检验时先充分振摇吸取瓶、管中的液体，作为原液， 再按要求做10倍递增稀释。
1、致腐微生物：在自然界里广泛存在的一类营死物寄 生的，能产生蛋白分解酶，使动植物组织发生腐败 分解的微生物。 肉的腐败过程使蛋白质分解成蛋白胨、多肽、 氨基酸，进一步再分解成氨、硫化氢、酚、吲哚、 粪臭素、胺及二氧化碳等，这些腐败产物具有浓厚 的臭味，肉的表面产生明显的发粘、变色、霉斑。
致病菌检验 蜡样芽孢杆菌
?MYP培养基中含有卵黄、甘露醇、多 粘菌素和pH指示剂酚红等。多粘菌素 可抑制杂菌的生长。 ?蜡样芽孢杆菌不发酵甘露醇，菌落为 粉红色（否则为黄色）。 ?该菌产生卵磷脂酶，由于脂肪和卵磷 脂被分解，在菌落周围产生粉红色的晕。
分离培养和证实试验:
注：＋ 90%~100% 的菌株阳性；－ 90%~100% 的菌株阴性；＋ /－ 大多数菌株阳性；－ /＋ 大多 数菌株阴性。
★鉴别：
蜡样芽孢杆菌在形态以及生化性状上与苏云金芽孢杆菌极为相似 ，要 进行鉴别。主要是通过观察伴孢晶体来判断，苏云金芽孢杆菌有伴孢晶体， 蜡样芽孢杆菌无。
苏云金芽孢杆菌及其伴孢晶体
临床症状：食物中毒，分为呕吐型和腹泻型两类。
三、检验方法
1、检验标准； GB 4789.14—2003
2、培养基和试剂
培养基:
肉浸液肉汤培养基
酪蛋白琼脂培养基
动力-硝酸盐培养基
缓冲葡萄糖蛋白胨水
血琼脂培养基
木糖-明胶培养基
甘露醇卵黄多粘菌素(MYP)琼脂培养基、
试剂：0.5% 碱性复红染色液、革兰氏染色液、3% 过氧化氢 溶液、甲萘胺-乙酸溶液、对氨基苯磺酸-乙酸溶液。
选择性培养基 （分离培养）
MYP
36℃±1℃ 12 h ~ 20 h
④与类似菌的鉴别：主要是与苏 菌数计算
营养琼脂培养基
பைடு நூலகம்
云金芽孢杆菌的鉴别。
⑤结果报告：报告每g（mL ）检样
中所含的蜡样芽孢杆菌数。
生长及菌落观察 染色镜检 生化试验 菌株保存
报告
菌数测定：
将样品稀释液0.1 mL涂布于甘露醇卵黄多粘菌素（ MYP）琼脂平板上 培养后，选取适当菌落数的平板进行计数。计数后，从中挑取 5个典型菌落 做证实试验。根据证实的蜡样芽孢杆菌的菌落数计算出该平板上的菌落数。
食品中蜡样芽孢杆菌检测方法的分析及建立改进方法的研究
食品中蜡样芽孢杆菌检测方法的分析及建立改进方法的研究摘要蜡样芽孢杆菌是一种常见的食品中毒原因之一，对人类健康产生严重影响。
为了有效检测食品中的蜡样芽孢杆菌，本文首先对现有的检测方法进行了分析，并发现它们存在一定的局限性。
随后，通过实验的方法研究了一种新的蜡样芽孢杆菌检测方法，并对其进行了改进，以提高检测的准确性和灵敏度。
本研究为食品安全提供了一种可靠的蜡样芽孢杆菌检测方法。
关键词：蜡样芽孢杆菌；食品安全；检测方法；准确性；灵敏度1. 引言食品中的微生物污染是食品安全的重要问题之一，而蜡样芽孢杆菌是其中常见的致病菌之一。
蜡样芽孢杆菌感染会引起食物中毒症状，严重时可能导致肠道炎症、腹泻和脱水等严重问题。
因此，开发一种高效的蜡样芽孢杆菌检测方法对于食品安全至关重要。
2. 现有方法的分析目前，常用的蜡样芽孢杆菌检测方法主要包括传统的培养方法和分子生物学方法。
传统的培养方法需要进行预培养、落订、筛选等步骤，耗时且操作繁琐。
虽然分子生物学方法如PCR技术在蜡样芽孢杆菌检测中具有高度灵敏度和特异性，但其也存在一些问题，例如样本处理过程中的核酸提取，特异性引物的选择，以及结果的解读等。
3. 新方法的研究本研究采用了一种新的蜡样芽孢杆菌检测方法，并对其进行了改进。
改进的方法主要包括样本前处理、特异性引物的设计以及结果的快速解读等方面。
首先，在样本前处理中，使用了一种有效的细菌提取方法，将样本中的蜡样芽孢杆菌快速提取出来，避免了其他微生物的干扰。
其次，在引物的设计中，根据蜡样芽孢杆菌的特定基因序列，设计了一对高度特异性的引物，以提高检测的准确性。
最后，在结果解读方面，采用了一种快速的荧光定量PCR技术，通过检测荧光信号的强度，可以快速确认样本中蜡样芽孢杆菌的存在。
4. 结果与讨论通过对一系列不同食品样本的检测，发现本研究中建立的蜡样芽孢杆菌检测方法在准确性和灵敏度方面均有显著提高。
样本前处理方面，高效的提取方法可以从复杂的食品样本中快速提取蜡样芽孢杆菌。
食品中各类微生物检验PPT课件
第一节 食品中菌落总数的测定 第二节 食品中大肠菌群的测定 第三节 食品中金黄色葡萄球菌的检验 第四节 食品中沙门氏菌的检验 第五节 食品中志贺氏菌的检验
第六节 食品中溶血性链球菌的检验 第七节 食品中病原性大肠艾希氏菌的检
验 第八节 食品中变形杆菌的检验 第九节 食品中空肠弯曲菌的检验 第十节 食品中致病性弧菌检验
产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性的无芽胞 杆菌。
从种类上讲，大肠菌群包括许多生化及血清学 特性均很不相同的细菌，其中有埃希氏菌属， 枸椽酸菌属、肠杆菌属和克雷伯氏菌属等等。 以埃希氏菌属为主。
大肠菌群MPN是指在100mL(或100g)食品检样 中所含的大肠菌群的最近似或最可能数。
大肠杆菌
引起中毒的主要是 动物源性食品。
本菌对热、消毒药及 外界环境的的抵抗力 不强。60℃，20-30min
即被杀死。
致病性与免疫性
1、致病物质： 侵袭力： O抗原、 VI抗原
毒 素： 内毒素 外毒素----肠毒素
操作步骤
检验方法 (一)乳糖发酵试验
在乳糖发酵试验工作中，经常可以看到
在发酵倒管内极微少的气泡（有时比小米粒 还小），有时可以遇到在初发酵时产酸或沿 管壁有缓缓上浮的小气泡。实验表明，大肠 菌群的产气量，多者可以使发酵倒管全部充 满气体，少者可以产生比小米粒还小的气泡。 如果对产酸但未产气的乳糖发酵如有疑问时， 可以用手轻轻打动试管，如有气泡沿管壁上 浮，即应考虑可能有气体产生，而应作进一 步试验。
操作步骤
将待检样品接种于乳糖胆盐发酵管内， 接种量在1mL以上者，用双料乳糖胆盐 发酵管；1mL及1mL以下者，用单料乳 糖胆盐发酵管，每一稀释度接种3管，置 36+1℃温箱内，培养24+2小时，如所有 乳糖胆盐发酵管均不产气，则可报告为 大肠菌群阴性。如有产气者，按下列程 序进行。
出口食品中蜡样芽孢杆菌检验方法
MM_FS_CNJ_0340出口食品蜡样芽孢杆菌平板计数法MM_FS_CNJ_0340出口食品中蜡样芽孢杆菌检验方法1.与适用范围本方法适用于出口食品的检验。
2.主要试剂和仪器2.1.主要试剂（包括培养基）甘露醇卵黄多粘菌素琼脂（MYP）；胰酪胨大豆多粘菌素肉汤；酚红葡萄糖肉汤；硝酸盐肉汤；营养琼脂；L－酪氨酸营养琼脂；溶菌酶营养肉汤；改良V－P培养基；动力培养基；胰酪胨大豆羊血琼脂（TSSB）；Betterfield氏磷酸盐缓冲稀释液；亚硝酸盐试剂；V－P试剂；碱性复红染色液。
2.2.仪器吸管：容量1.0mL和10.0mL，具0.1mL刻度；菌落计数器；均质器；厌氧培养装置；涡动搅拌器；L形玻璃棒；恒温培养箱：30℃及36±1℃。
3.样品的保存和送检待检样品应保持在6℃以下运送并尽可能不使其冷冻。
送达实验室后，应保存于4℃并尽快进行检验。
如在4d内不能进行检验，应将样品储存在－20℃，检验前再于室温下解冻。
脱水食品可在常温下送检和储存。
4.过程简述4.1.样品的制备4.1.1.以无菌操作用灭菌刀、剪将样品剪碎。
称取50g放于无菌均质杯中。
4.1.2.加450ml无菌磷酸盐缓冲稀释液于均质杯中以18000～20000r／min均质2min。
制成1∶10样品稀释液。
4.1.3.取1∶10稀释液10.0mL加到含有90.0mL无菌磷酸盐缓冲液的稀释瓶中，充分混匀制成1∶100的稀释液。
4.1.4.每个稀释度换用1支10.0mL灭菌吸管，按上述操作程序进行10倍递增稀释直至10－6。
4.2.检验步骤4.2.1.平板计数法4.2.1.1.取各稀释液0.1mL接种到MYP琼脂平板上。
用灭菌L形玻璃棒均匀涂布于整个琼脂表面。
每稀释度接种两个MYP琼脂平板。
4.2.1.2.将平板置于30℃培养24h。
4.2.1.3.选取具有15～150个典型或可疑蜡样芽孢杆菌菌落的平板，进行计数。
并计算同一稀释度两个平板的平均菌落数。