高效液相色谱法测定糖苷类表面活性剂产品中糖类物质的含量

高效液相色谱法测定糖苷类表面活性剂产品中糖类物质的含量张军;杨秀全;周媛;孙永强;李运玲【摘要】建立了同时测定糖苷类表面活性剂产品中单糖和多糖含量的高效液相色谱法.采用Zorbax Eclipse Plus C18色谱柱(4.6 mm×100 mm,3.5μm)分离,甲醇-水梯度洗脱,流速1.0 mL/min,蒸发光散射检测器检测.用葡萄糖和麦芽三糖为对照品,外标两点法同时测定糖苷产品中单糖和多糖的含量.结果表明,单糖和多糖的检出限分别约为1.5和2.0μg/L,回收率分别为100.4%和99.1%.与既有方法相比,此方法可以同时分析产品中残留原料糖和副产物多糖的含量,且在分析非还原性单糖方面具有独特优势.%A HPLC method for simultaneous determination of contents of monose and polysaccharides in glucoside-based surfactant products was established. The method adopts evaporative light-scattering detector and Zorbax Eclipse Plus C18 column (4. 6 mm × 100 mm,3. 5μm)with methanol and water as the mobile phase at a rate of 1. 0 mL/min. The contents of saccharides were calculated by external standard two-point method using glucose and maltotriose as control samples. Results show that the detection limit of monose and polysaccharides is 1. 5 and 2.0 μg/L respectively while the recovery is 100. 4% and 99. 1% res pectively. As comparing with the conventional methods,this method displays unique superiority in determination of non -reducing monose and the residual glucose from raw material for preparation of glucoside-based surfactants as well as the by-products polysaccharides can be determined simultaneously.【期刊名称】《日用化学工业》【年(卷),期】2017(047)004【总页数】5页(P232-236)【关键词】糖基表面活性剂;单糖;多糖;高效液相色谱法【作者】张军;杨秀全;周媛;孙永强;李运玲【作者单位】中国日用化学工业研究院,山西太原 030001;中国日用化学工业研究院,山西太原 030001;中国日用化学工业研究院,山西太原 030001;中国日用化学工业研究院,山西太原 030001;中国日用化学工业研究院,山西太原 030001【正文语种】中文【中图分类】TQ423.2糖苷类表面活性剂以其安全绿色、生物相容性好的特性为人们所熟知，这类产品以葡萄糖作为亲水基团，主要生产原料都来自于可再生资源，是真正源自天然的绿色安全的新型表面活性剂品种，主要用于餐具洗涤剂、洗手液等密切接触人体的日化产品中，同时也是婴幼儿洗浴产品的首选原料之一，是21世纪以来真正称得上“世界级”的表面活性剂品种。

近年来全世界糖苷类表面活性剂的用量快速上升，我国年消耗量已超过5万t [1]。

糖苷类表面活性剂一般以天然脂肪醇或醇醚和葡萄糖为原料合成，在反应完毕后会有少量原料糖残留，同时在主反应进行的过程中还存在葡萄糖自聚生成多糖的副反应，而残糖和多糖的存在会影响产品的质量。

所以，产品中的残糖和多糖含量需要作为中控指标进行严格控制。

文献报道的残糖含量测定方法以菲林试剂法[2]和比色法为主[3]，但这类方法容易受到其他因素干扰，方法专一性不强。

关于多糖含量测定，曾有报道采用乙醇抽提后称重的方法进行检测[4]，但检测灵敏度和精确度不高，后有以此方法为基础，采用苯酚-硫酸法对多糖进行定量测定的报道[5]，但同样存在误差较大、测定时间较长的问题。

高效液相色谱法(HPLC)经过色谱柱分离后对样品中的糖含量进行测定，具有快速、专一的优点，但目前的文献报道无法同时对残糖和多糖含量进行测定[6，7]，且缺乏合适的多糖对照品，仅采用面积归一法进行定量，测定方法有待改进。

本文对HPLC同时快速、准确测定产品中残糖和多糖的含量进行较深入探究，考察方法的条件对直链、支链烷基糖苷和醇醚糖苷等产品的适应性，以期为糖苷类表面活性剂的工艺升级和质量评估提供参考。

1.1 主要仪器与试剂Agilent 1260 Infinity高效液相色谱系统，配蒸发光散射检测器(ELSD)，美国安捷伦公司；KQ3200DB超声波清洗器，昆山超声仪器有限公司；Zorbax Eclipse Plus C18色谱柱(4.6 mm×100 mm，3.5 μm)，美国安捷伦公司；Sartorious电子天平，北京赛多利斯天平有限公司；0.45 μm微孔滤膜，天津津腾实验设备有限公司。

葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖，w≥98%，国药集团化学试剂有限公司；甲醇，色谱纯，美国迪马公司；实验用水为三级水；烷基糖苷APG1214、支链烷基糖苷、醇醚糖苷AEG500E，市售工业品。

1.2 分析方法1.2.1 试样配制方法对照品溶液配制：精密称取一定量的葡萄糖，作为单糖测定的对照品，加水溶解定容，配制质量浓度为0.4 g/L的葡萄糖溶液，再分别稀释得到0.2，0.1，0.08，0.05和0.02 g/L的葡萄糖溶液；麦芽三糖溶液同法操作配制，作为多糖测定的对照品。

待测样品溶液配制：取糖苷样品0.4～1.0 g，精确至0.000 1 g，加水50.00 mL，称定质量，超声15 min，放至室温中加水补足损失的质量，摇匀即得样品溶液。

1.2.2 色谱条件在Zorbax Eclipse Plus C18色谱柱(4.6 mm×100 mm，3.5 μm)上，以甲醇-水为流动相，流速为1 mL/min，梯度洗脱，洗脱程序：0～5 min为10%甲醇，5～25 min内由10%甲醇线性变为95%甲醇，25～30 min为95%甲醇。

ELSD参数：蒸发温度为80 ℃，氮气流量为1.5 SLM。

在1.2.2色谱条件下，对照品和样品的色谱图见图1。

虽然目标峰的保留时间较短，但由于ELSD的检测过程为先蒸发后检测(将包括溶剂在内的流动相全部蒸发后再通过检测池)，几乎不会有溶剂峰存在，受到干扰的可能性较小。

2.1 色谱柱的选择糖苷类表面活性剂属中等极性物质，糖类则属于强极性物质，所以需要选择适用范围较宽的色谱柱进行分析。

笔者曾对烷基糖苷在氨基柱和HILIC柱上的保留行为进行对比考察，结果见图2中a和b。

氨基柱和HILIC柱的填料性质更接近正相色谱，极性越大的物质保留越强，用来分析糖类则一般需要在80%～90%的乙腈体系中才能得到较理想的分离效果[8，9]。

图2a为使用氨基柱分离烷基糖苷的色谱图，流动相为80%乙腈水溶液；图2b为使用HILIC柱分离烷基糖苷的色谱图，流动相为90%乙腈水溶液。

从图2中可以看出，烷基糖苷在氨基柱和HILIC柱上的保留行为基本接近，绝大部分糖苷类物质都先于葡萄糖出峰，但由于浓度较高形成极高的平头峰，且拖尾一直延续到葡萄糖峰位置，这样就使得浓度很低的葡萄糖峰几乎被糖苷主体峰全部掩盖，所以很难得到满意的测定结果。

对比图1c，虽然葡萄糖峰和多糖峰的保留时间较短，但与糖苷类物质分得很开，且彼此的分离度良好，可以保证稳定的测定结果，所以本文最终选择Zorbax Eclipse Plus C18色谱柱作为分离色谱柱。

2.2 对照品的选择糖苷类表面活性剂产品中含有的单糖来自原料，多糖则由单糖自聚生成。

单糖聚合后按聚合度(Dp)可分为麦芽糖(Dp=2)、麦芽三糖(Dp=3)、麦芽四糖(Dp=4)等，所以需要选择合适聚合度的对照品来对产品中的单、多糖含量进行评价。

本文对葡萄糖、麦芽糖(含葡萄糖)、麦芽三糖的色谱保留进行考察，并与糖苷样品相比较，结果见图3。

由图3可以看出，葡萄糖与麦芽三糖可完全分离，但麦芽糖的色谱峰则与葡萄糖和麦芽三糖皆有交叉。

与糖苷样品色谱图相比较，多糖峰与麦芽三糖峰重合度最高，所以选择麦芽三糖作为多糖测定的对照品。

需要指出的是，糖苷样品中的多糖实际聚合度无法直接判断，也未见有相关研究的文献报道，但ELSD检测原理基于物质质量和散射光强度，对同类物质给出基本一致的响应[10]，所以用麦芽三糖作为外标对照品测定多糖含量，结果是相对比较准确的。

2.3 流动相的选择以葡萄糖和麦芽三糖为实验对象，分别考察乙腈-水和甲醇-水作为流动相对单、多糖的分离能力。

实验证明，乙腈-水的洗脱能力强于甲醇-水，但对于单糖和多糖的分离选择性却不及后者。

用溶剂选择性三角色谱理论来解释[11]，以酸性角、碱性角和偶极性角为3个顶点，甲醇偏向酸性角，而乙腈则偏向偶极性角，即偏向酸性角的醇类溶剂更有利于单糖和多糖的分离。

2.4 检测器参数考察ELSD的漂移管参数设置对信噪比影响很大。

对于糖类物质而言，在一定范围内提高蒸发温度(漂移管温度)可以大幅提升目标峰的响应值，但经考察发现，当蒸发温度高于80 ℃后，对糖峰信号的增益已非常微弱，信噪比基本保持不变，所以本文选择80 ℃作为检测器的运行温度。

2.5 方法学考察2.5.1 标准曲线线性和检出限按1.2.1所述质量浓度配制葡萄糖和麦芽三糖对照品溶液，按1.2.2所述色谱条件分别进样分析。

以对照品质量浓度的对数值(x)和峰面积的对数值(y)作线性回归，葡萄糖的线性方程为y=1.561 2x+4.246 8 (R=0.999 3)，麦芽三糖的线性方程为y=1.306 5x+3.907 7 (R=0.999 4)。

2个回归方程的线性相关系数皆大于0.999。

分别逐级稀释对照品溶液，以3倍信噪比计算方法的检出限，结果表明葡萄糖的检出限约为1.5 μg/L，多糖的检出限约为2.0 μg/L。

2.5.2 精密度和稳定性分别进样0.1 g/L的葡萄糖对照品溶液和麦芽三糖对照品溶液，各自进样6次，分别计算峰面积的相对标准偏差(RSD)，结果表明葡萄糖为1.3%，麦芽三糖为1.5%，精密度良好。