测定核酸含量的几种方法
核酸的检验实验报告
一、实验目的1. 了解核酸的基本概念和生物学意义。
2. 掌握核酸提取、纯化和鉴定方法。
3. 熟悉紫外分光光度法测定核酸含量的原理和操作。
4. 通过实验验证核酸的特性和功能。
二、实验原理核酸是生物细胞中携带遗传信息的生物大分子，主要由核苷酸组成。
根据碱基排列顺序的不同，核酸分为DNA和RNA两种。
DNA主要存在于细胞核中，RNA主要存在于细胞质中。
1. 核酸提取：通过破碎细胞，使核酸从细胞内释放出来。
2. 核酸纯化：通过层析等方法，去除杂质，获得纯净的核酸。
3. 核酸鉴定：通过电泳、紫外分光光度法等方法，对核酸进行定性和定量分析。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：- 鲜鸡肝组织- 氯化钠- 氯化镁- 磷酸盐缓冲液- 乙醇- 异丙醇- 0.1% 溴酚蓝- 1% 琼脂糖- 核酸提取试剂盒- 紫外分光光度计- 凝胶成像系统- 离心机2. 实验试剂：- Tris-HCl缓冲液- EDTA- 氢氧化钠- 氯化钠- 乙醇- 异丙醇- 0.1% 溴酚蓝- 1% 琼脂糖四、实验步骤1. 核酸提取- 将鲜鸡肝组织剪碎，加入适量Tris-HCl缓冲液和EDTA，用玻璃棒搅拌。
- 加入等体积的氯仿/异戊醇（24:1），剧烈振荡。
- 12,000 rpm离心10分钟，取上清液。
- 加入等体积的95%乙醇，沉淀核酸。
- 12,000 rpm离心5分钟，弃去上清液。
- 加入适量70%乙醇洗涤沉淀，12,000 rpm离心5分钟。
- 弃去上清液，用无菌去离子水溶解沉淀。
2. 核酸纯化- 将核酸溶液加入琼脂糖凝胶电泳槽，进行琼脂糖凝胶电泳。
- 用凝胶成像系统观察电泳结果，将目的条带切割下来。
- 将切割下来的核酸条带用胶回收试剂盒纯化。
3. 核酸鉴定- 将纯化的核酸溶液用紫外分光光度计测定其含量。
- 将核酸溶液进行电泳，观察条带，确定核酸类型。
五、实验结果与分析1. 核酸提取：通过实验，成功提取出鸡肝组织中的核酸。
2. 核酸纯化：通过琼脂糖凝胶电泳，成功纯化出核酸。
实验十三 动物组织核酸的分离、鉴定和含量测定
二苯胺显色法原理
DNA在酸性条件下加热，其嘌呤碱与脱氧核糖间 的糖苷键断裂，生成嘌呤碱、脱氧核糖和脱氧嘧啶 核苷酸，而2-脱氧核糖在酸性环境中加热脱水生成 ω-羟基-γ-酮基戊糖，与二苯胺试剂反应生成蓝色物 质，在595nm波长处有最大吸收。DNA在 40~400μg范围内，光吸收与DNA的浓度成正比。 在反应液中加入少量乙醛，可以提高反应灵敏度。
DNA标准曲线的制作和样品测定
管 试 剂 0 对照 DNA标准溶液,ml 0.0 蒸馏水，ml 二苯胺试剂,ml OD595 2.0 4.0 1 0.4 1.6 4.0 2 0.8 1.2 4.0 3 1.2 0.8 4.0 4 1.6 0.4 4.0 5 2.0 0 4.0 号 样品1 2.0 0 4.0 样品2 2.0 0 4.0
动物组织核酸的分离纯化及鉴定
1. 猪肝DNA和RNA的分离 2. 核糖和脱氧核糖的显色实验
3. 核酸的定量和纯度测定
核酸是一类生物高分子化合物，存在于一切生物体内， 是组成细胞的重要成分。它以与蛋白质结合的形式—— 核蛋白存在于细胞中，是生命的基本物质之一，具有储 存、复制生物体遗传信息的功能，也是蛋白质合成不可 缺少的物质，因此它对于生物体的生长、遗传、变异等 现象起着重要的决定作用。核酸分为两大类——核糖核 酸(RNA)和脱氧核糖核酸(DNA) 。 核酸完全水解产生嘌呤和嘧啶等碱性物质、戊糖（核糖 或脱氧核糖）和磷酸的混合物。核酸部分水解则产生核 苷和核苷酸。每个核苷分子含一分子碱基和一分子戊糖， 一分子核苷酸部分水解后除产生核苷外，还有一分子磷 酸。核酸的各种水解产物可用层析或电泳等方法分离鉴 定。
DNA和RNA的结构
组成核酸的戊糖有两种。DNA所含的糖为 β-D2-脱氧核糖；RNA所含的糖则为β-D-核糖。
第十二章 核酸的研究方法.
六.DNA的化学合成 将待活化的核苷酸上的某些游离基团保 护（封闭）起来，使反应按设计的方向 进行。5'-OH用二对甲氧三苯甲基 （DMT）保护，碱基上的氨基用苯甲酸 保护。 对3 ' -OH用氨基亚磷酸化合物进行活化。
A 第一个核苷酸的3 ' -OH与固相（树脂）结合在一起， 它的5'-OH与活化的单体之间形成一个亚磷酸三酯，活 化单体上的5'-OH及碱环上的氨基等由于受到保护而不 会参与反应。 B 亚磷酸三酯经碘氧化形成磷酸三酯 C 加入二氯乙酸除去生长链中的5'-OH上的保护剂DMT， 至此DNA链已延伸了一个核苷酸单位，并可投入下一 轮反应。 D 整个DNA片段合成完毕后，用苯硫酚除去5'-OH上的 保护剂DMT，用浓氢氧化铵将DNA片段与固相树脂断 开，使DNA得以洗脱下来。再用浓氢氧化铵在加热条 件下使碱基上的保护剂除去。最后除去氢氧化铵，在 真空中抽干。
这三个热反应过程的重复称为一个循环(cycle)
PCR主要由高温变性、低温退火和适温延伸三个步骤反 复的热循环构成： 即在高温（95℃）下，待扩增的靶 DNA双链受热变性成为两条单链DNA模板；而后在低温 （37～55℃）情况下，两条人工合成的寡核苷酸引物与 互补的单链DNA模板结合，形成部分双链；在Taq酶的最 适温（72℃）下，以引物3’端为合成的起点，以单核苷 酸为原料，沿模板以5’→3’方向延伸，合成DNA新链。 这样，每一双链的DNA模板，经过一次解链、退火、延 伸三个步骤的热循环后就成了两条双链DNA分子。如此 反复进行，每一次循环所产生的DNA均能成为下一次循 环的模板，每一次循环都使两条人工合成的引物间的 DNA特异区拷贝数扩增一倍，PCR产物得以2n的批数形 式迅速扩增，经过25～30个循环后，理论上可使基因扩 增109倍以上，实际上一般可达106～107倍。
动物组织和细胞中核酸的提取和测定_
实验九动物组织和细胞中核酸的提取和测定第一部分动物组织和细胞中DNA和RNA的提取【实验目的】学习从组织和细胞中提取DNA和RNA的方法【实验原理】1.从动物组织和细胞中提取DNADNA存在于细胞核中。
提取DNA的方法首先需要温和裂解细胞及溶解DNA的技术，接着需采用化学和酶学方法，除去杂蛋白、RNA及其他的大分子。
本实验在EDTA（螯合二价阳离子以抑制Dnase）存在的情况下，用蛋白酶K消化真核细胞和组织，用去垢剂（如SDS，十二烷基磺酸钠）溶解细胞膜并使蛋白质变性。
核酸通过有机溶剂抽提得以纯化，污染的RNA通过RNase消化清除。
这个方法可产生十微克至数百微克的DNA，适用于标准琼脂糖凝胶上的Southern分析，可用作PCR反应的模板，以及用于构建基因组DNA文库。
2.从动物组织和细胞中提取RNARNA存在于细胞质及核中，是一种极易降解的核酸分子。
为了快速从细胞中分离完整的RNA，许多方法都用到了高浓度的强变性剂硫氰酸胍使细胞破裂。
高浓度的硫氰酸胍还使细胞内的各种RNA 酶失活，使释放出的RNA不被降解。
细胞裂解后存在于裂解溶液内的有RNA，核DNA，蛋白质和细胞残片，通过酚，氯仿等有机溶剂处理，离心，使RNA最终与其它细胞组分分离开来。
【实验材料】1.实验器材研钵和研棒，匀浆机，橡胶刮棒，低温冷冻离心机，恒温水浴，宽口移液管，锤子，塑料袋，涡旋。
2.实验试剂(1)裂解缓冲液：10mmol/L Tris-Cl(PH8.0)，0.1mol/L EDTA(PH8.0)，0.5%(m/V)SDS，20µg/mg无Dnase 的胰RNase，裂解缓冲液的前三种成分可预先混合并于室温保存。
RNase在用前适量加入。
(2)溶液D(变性液)：4mol/L硫氰酸胍，25mmol/L柠檬酸钠.2H20，0.5%(m/V)月桂基肌酸钠，0.1mol/L β-巯基乙醇，将250g硫氰酸胍、0.75mol/L(PH7.0)柠檬酸钠17.6ml和26.4ml10%(m/V)月桂基肌酸钠溶于293ml水中.加入搅拌子于磁力搅拌器上65℃混匀,直至完全溶解。
第15章 核酸的研究方法
核酸的核苷酸序列测定(4) 核酸的核苷酸序列测定
Sanger DNA测序原理 测序原理
核酸的核苷酸序列测定(5) 核酸的核苷酸序列测定
(二)DNA的化学法测序 二 的化学法测序
化学法测序由Maxam和Gilbert于1977年所发明。其基本原理 和 年所发明。 化学法测序由 于 年所发明 是用特异的化学试剂作用于DNA分子中不同碱基，然后用哌啶切 分子中不同碱基， 是用特异的化学试剂作用于 分子中不同碱基 断反应碱基的多核苷酸链。 种不同的特异反应 种不同的特异反应， 断反应碱基的多核苷酸链。用4种不同的特异反应，就可以使末端 标记的DNA分子切成不同长度的片断，其末端都是该特异的碱基。 分子切成不同长度的片断， 标记的 分子切成不同长度的片断 其末端都是该特异的碱基。 经变性胶电泳和放射自显影得到测序图谱。 经变性胶电泳和放射自显影得到测序图谱。
寡核苷酸链释放
PCR:聚合酶链式反应 聚合酶链式反应(1) 聚合酶链式反应
由引物决定的DNA扩增片断 扩增片断 由引物决定的
①加热使DNA双链分开 加热使 双链分开 加入寡聚DNA引物片 ②加入寡聚 引物片 段，冷却
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
重复步骤③ 重复步骤③
③升温至TaqDNA聚 升温至 聚 合酶最适温度， 合酶最适温度，使子 链自引物向前延伸
核酸的凝胶电泳
(一) 琼脂糖凝胶电泳 一 以琼脂糖作为支持物,电泳的迁移率决定于以下因素 以琼脂糖作为支持物 电泳的迁移率决定于以下因素: 电泳的迁移率决定于以下因素 (1) 核酸分子大小 (2) 胶浓度 (3) DNA的构象 的构象 (4) 电压 (5) 碱基组成 (6) 温度 (二) 聚丙烯酰氨凝胶电泳 以聚丙烯酰氨作支持物,单体丙烯酰氨在加入交联剂后, 以聚丙烯酰氨作支持物,单体丙烯酰氨在加入交联剂后, 就成聚丙烯酰氨.由于这种凝胶的孔径比琼脂糖胶要小, 就成聚丙烯酰氨.由于这种凝胶的孔径比琼脂糖胶要小,所以 可用于分析相对质量小于1000bp DNA片段和RNA的电泳 1000bp的 片段和RNA的电泳. 可用于分析相对质量小于1000bp的DNA片段和RNA的电泳.
实验十三动物组织核酸的分离鉴定和含量测定(精)
实验目的：
学习并掌握紫外分光光度法和定糖二苯胺显色法பைடு நூலகம்
测定DNA含量和纯度的基本原理
DNA测定的方法原理
紫外分光光度法（此法要求核酸纯度很高，1个Abs 相当于50ug/ml双螺旋DNA,除了定量测定以外还可 进行核酸纯度的检测，A260/A280比值，纯的DNA为 1.8，RNA为2.0，样品中含有蛋白质和苯酚时， A260/A280 比值降低。） 定糖法（DNA糖部分为脱氧核糖，RNA糖部分为核糖， 分别可以进行二苯胺显色法和地衣酚显色法） 定磷法（核酸的磷酸部分）
二苯胺显色法原理
DNA在酸性条件下加热，其嘌呤碱与脱氧核糖间的 糖苷键断裂，生成嘌呤碱、脱氧核糖和脱氧嘧啶核苷 酸，而2-脱氧核糖在酸性环境中加热脱水生成ω-羟基 -γ-酮基戊糖，与二苯胺试剂反应生成蓝色物质，在 595nm波长处有最大吸收。DNA在40~400μg范围内，光 吸收与DNA的浓度成正比。在反应液中加入少量乙醛， 可以提高反应灵敏度。
实验内容
DNA：1ml SC溶液溶解上次提取的DNA样品，然后转移到 50ml离心管中，用9ml0.01M NaOH溶液溶解。 A260测定:以H2O作为空白，取上清测A260值后确定稀释 倍数，使A260值在2.0左右（DNA此时的浓度约为 100ug/ml。（由于二苯胺法的测定范围是40400ug/mlDNA，所以DNA浓度如果太小会影响测定结果） 核酸含量（ug/ml）=样品A260X稀释倍数/0.02 (0.022) A280测定： A260/A280比值计算。纯的DNA为1.8，RNA为 2.0。如果样品中混有RNA，则比值大于1.8；如果样品中 混有蛋白质，则比值小于1.8。
核酸含量的测定——紫外吸收法
核酸含量的测定——紫外吸收法[原理]核苷、核苷酸、核酸的组成成分中都有嘌呤、嘧啶碱基，这些碱基都具有共轭双键 （ -C-C=C-C=C-），在紫外光区的250-280nm 处有强烈的光吸收作用，最大吸收值在260nm 左右。
常利用核酸的紫外吸收性进行核酸的定量测定。
核酸的摩尔消光系数ε(P)表示为每升溶液中含有1摩尔原子磷的光吸收值。
RNA 的ε(P)260nm （）为7 700～7 800，RNA 的含磷量约%，因此每毫升溶液含1μg RNA 的光吸收值相当于～。
小牛胸腺DNA 钠盐的ε(P) 260nm （）为6 600，含磷量为%，因此每毫升溶液含1μg DNA 钠盐的光吸收值相当于。
测出260nm 处的光吸收值，可计算出核酸的含量。
当核酸变性降解时，其紫外吸收强度显著增加，称为增色效应。
蛋白质也有紫外吸收，通常蛋白质的吸收高峰在280nm 波长处，在260nm 处的吸收值仅为核酸的1/10或更低，因此对于含有微量蛋白质的核酸样品，测定误差较小。
若待测的核酸制品中混有大量的具有紫外吸收的杂质，则测定误差较大，应设法除去。
不纯的样品不能用紫外吸收值作定量测定。
从A 260/ A 280的比值可判断样品的纯度。
纯RNA 的A 260/ A 280≥；DNA 的A 260/ A 280≥。
当样品中蛋白质含量较高时，则比值下降。
RNA 和DNA 的比值分别低于和时，表示此样品不纯。
pH 对核酸紫外吸收性有影响，所以在测定时要固定溶液的pH 值。
本实验采用常用的比消光系数法来测定核酸含量。
[方法和步骤]1、测定取洁净离心管甲乙两支，分别准确加入 DNA/RNA 样液，然后向甲管加入蒸馏水，向乙管加入过氯酸-钼酸铵沉淀剂，摇匀后置冰箱内30min ，使沉淀完全。
3000r/min 离心10min ，各吸取上清液转入相应的甲乙两容量瓶内，定容至50mL 。
以蒸馏水作空白对照，使用紫外光度计分别测定上述甲乙两稀释A 260值。
核酸含量的测定——紫外吸收法
核酸含量的测定——紫外吸收法[原理]核苷、核苷酸、核酸的组成成分中都有嘌呤、嘧啶碱基，这些碱基都具有共轭双键 （ -C-C=C-C=C-），在紫外光区的250-280nm 处有强烈的光吸收作用，最大吸收值在260nm 左右。
常利用核酸的紫外吸收性进行核酸的定量测定。
核酸的摩尔消光系数ε(P)表示为每升溶液中含有1摩尔原子磷的光吸收值。
RNA 的ε(P)260nm （pH7.0）为7 700～7 800，RNA 的含磷量约9.5%，因此每毫升溶液含1μg RNA 的光吸收值相当于0.022～0.024。
小牛胸腺DNA 钠盐的ε(P) 260nm （pH7.0）为6 600，含磷量为9.2%，因此每毫升溶液含1μg DNA 钠盐的光吸收值相当于0.020。
测出260nm 处的光吸收值，可计算出核酸的含量。
当核酸变性降解时，其紫外吸收强度显著增加，称为增色效应。
蛋白质也有紫外吸收，通常蛋白质的吸收高峰在280nm 波长处，在260nm 处的吸收值仅为核酸的1/10或更低，因此对于含有微量蛋白质的核酸样品，测定误差较小。
若待测的核酸制品中混有大量的具有紫外吸收的杂质，则测定误差较大，应设法除去。
不纯的样品不能用紫外吸收值作定量测定。
从A 260/ A 280的比值可判断样品的纯度。
纯RNA 的A 260/ A 280≥2.0；DNA 的A 260/ A 280≥1.8。
当样品中蛋白质含量较高时，则比值下降。
RNA 和DNA 的比值分别低于2.0和1.8时，表示此样品不纯。
pH 对核酸紫外吸收性有影响，所以在测定时要固定溶液的pH 值。
本实验采用常用的比消光系数法来测定核酸含量。
[方法和步骤]1、测定取洁净离心管甲乙两支，分别准确加入 1.0mL DNA/RNA 样液，然后向甲管加入1.0mL 蒸馏水，向乙管加入1.0ml 过氯酸-钼酸铵沉淀剂，摇匀后置冰箱内30min ，使沉淀完全。
3000r/min 离心10min ，各吸取上清液0.5mL 转入相应的甲乙两容量瓶内，定容至50mL 。