系统适用性试验
高效液相色谱法测定阿司匹林肠溶片中阿司匹林含量
高效液相色谱法测定阿司匹林肠溶片中阿司匹林含量本文采用高效液相色谱法（HPLC-VWD）对阿司匹林肠溶片中成分阿司匹林进行测定，对方法的系统适用性试验、特异性试验、精密度试验、检测限、定量限、线性关系和线性范围考察、重复性试验、准确度试验（加样回收试验）进行验证，证实本方法确实可靠。
本方法可测定浓度在0.999862mg/mL-0.01999724 mg/mL间的阿司匹林，检测下限可达0.1ug/mL。
标签：阿司匹林;HPLC-VWD;方法验证阿司匹林肠溶片的质量标准中，监测阿司匹林肠溶片中的阿司匹林含量是一项重要指标[1]。
本文采用高效液相色谱法测定阿司匹林肠溶片中的阿司匹林，分别对系统适用性试验、特异性试验、精密度试验、检测限、定量限、线性关系和线性范围考察、重复性试验、准确度试验（加样回收试验）进行验证[2]。
一、仪器与材料1.1 样品阿司匹林肠溶片（25mg）市售样品。
1.2 仪器及试药高效液相色谱仪：Thermo Fisher Ultimate 3000（VWD检测器）。
超声仪：上海科导SK7210LHC超声仪，35KHz。
色谱柱：Welch Xtimate C18（5um，150×4.6mm）。
0.45um有机性样品滤膜。
天平：赛多利斯电子天平（BSA224S-CW）（100g，0.01mg;220g，0.1g）;梅特勒-托利多电子天平（MX5）（3g，0.001mg）。
试剂：甲醇，色谱级，德国默克，I866432 601。
乙腈：色谱纯，德国默克，JA050820。
四氢呋喃，色谱纯，德国默克，I826801615。
冰醋酸，分析纯，国药集团化学试剂有限公司，20140326。
水，为GB/T6682中规定的一级水。
阿司匹林，中国食品药品检定研究院，批号：100113-201405，纯度：99.8%。
水杨酸，中国食品药品检定研究院，批号：100106-201104，纯度：99.9%。
乙醇挥发性杂质检查
3.4.1、色谱条件与系统适用性试验以6%氰丙基苯基-94%二甲基聚硅氧烷为固定液；起始温度40℃，维持12分钟，以每分钟10℃的速率升温至240℃，维持10分钟；进样口温度为200℃；检测器温度为280℃。
对照溶液（b）中乙醛峰与甲醇峰之间的分离度应符合要求。
3.4.2、测定法精密量取无水甲醇100μl，置50ml量瓶中，用供试品稀释至刻度，摇匀，精密量取5ml，置50ml量瓶中，用供试品稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液（a）；精密量取无水甲醇50μl，乙醛50μl，置50ml量瓶中，用供试品稀释至刻度，摇匀，精密量取100μl，置10ml量瓶中，用供试品稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液（b）；精密量取乙缩醛150μl，置50ml量瓶中，用供试品稀释至刻度，摇匀，精密量取100μl，置10ml量瓶中，用供试品稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液（c）；精密量取苯100μl，置100ml量瓶中，用供试品稀释至刻度，摇匀，精密量取100μl，置50ml量瓶中，用供试品稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液（d）；取供试品作为供试品溶液（a）；精密量取4-甲基-2-戊醇150μl，置500ml量瓶中，加供试品稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液（a）、（b）、（c）、（d）和供试品溶液（a）、（b）各1μl，分别注入气相色谱仪，记录色谱图，供试品溶液（a）如出现杂峰，甲醇峰面积不得大于对照溶液（a）主峰面积的0.5倍（0.02%）；含乙醛和乙缩醛的总量按公式（1）计算，总量不得过0.001%（以乙醛计）；含苯按公式（2）计算，不得过0.0002%；供试品溶液（b）中其他杂质峰面积的总和不得大于4-甲基-2-戊醇的峰面积（0.03%，以4-甲基-2-戊醇计）乙醛和乙缩醛的总含量%=[(10×A E)/(A T-A E)]+[(30×C E)/(C T-C E)]×100% 公式（1）式中A E为供试品溶液（a）中乙醛的峰面积A T为对照溶液（b）中乙醛的峰面积C E为供试品溶液（a）中乙缩醛的峰面积C T为对照溶液（c）中乙缩醛的峰面积苯含量%=(2B E)/(B T-B E)×100% 公式（2）式中B E为供试品溶液中苯的峰面积B T为对照溶液中苯的峰面积。
2010版中国药典乳糖的高效液相色谱法检测
min
图2 乳糖对照溶液测试谱图
参数表
Compound Retention Time(min) Height
Water
3.76
227233
Lactos e
12.67
1176
Area 2442889 21884
Plate 2560 9046
Tailing 1.66 1.54
Res olution 23.14
3.76
225833
10.31
6802
12.59
1285
Area 2407840 97095 22279
Plate 2573 12605 10862
Tailing 1.67 1.35 1.33
Res olution
19.69 5.37
表1 乳糖样品含量测试结果
Injection N.O.
Reference substance (1 mg/mL)
实验方法
色谱条件
Column: HP-Amino ( 5 µm, 120 Å, 4.6 x 300 mm) Mobile phase: Acetonitrile : Water = 70 : 30 ( v/v ) Flow rate: 1.0 mL/min Detector: RI ( 40 ℃) Column temperature: 45 ℃ Injection volume: 10 µL Instrument: Agilent 1260 HPLC
在有关物质项下，供试品溶液的色谱峰除溶剂峰外 ，没有其他的杂质峰。
3.765 12.665
nRIU 14000 12000 10000 8000 6000 4000 2000
0 -2000
高效液相色谱实验报告
高效液相色谱实验报告高效液相色谱法，基本原理为影响柱效的主要因素是涡流扩散和传质阻抗。
分为液固吸附色谱法，流动相为液体，固定相是固体吸附剂；液分配色谱法，固定相几乎全是化学键合硅胶，又称化学键合相色谱法等。
（二）塔板理论：塔板理论方程式（高斯方程式）：理论塔板式数：理论塔板高度：（三）速率理论： h=a+b/u+cu影响塔板高度的因素：1、涡流扩散 2、纵向扩散 3、传质阻抗二、气相色谱仪：（1）色谱柱：固定相与柱管组成。
填充柱、毛细管柱；分配柱、吸附柱（2）紧固液：低沸点的液体，操作方式下为液态。
甲基硅油、聚乙二醇等选择原则：按相似性、按主要差别、按麦氏差别选择。
（3）载体：化学惰性的多孔性微粒（4）毛细管色谱柱：开管型、填充型（5）检测器：1、浓度型检测器：热导检测器和电子捕捉检测器2、质量型检测器：氢焰离子化检测器中国药典对气相色谱规定：除检测器种类、紧固液品种及特定选定的色谱柱材料严禁任一修改外，其他均可适度发生改变，色谱图于30min内记录完。
第四节高效液相色谱法1、基本原理：影响柱效的主要因素就是涡流蔓延和传质电阻。
分类：1、液固吸附色谱法：流动相为液体，固定相是固体吸附剂。
2、液——液分配色谱法：紧固二者几乎全系列就是化学键再分硅胶，又称化学键再分相色谱法。
按固定相和流动相的极性2又分：正相色谱法和反相色谱法正相色谱法：流动二者极性大于紧固二者极性的色谱法。
用作拆分溶有机溶剂的极性及中等极性的分子型物质，用作所含相同官能团物质的拆分。
极性强组分先流入反相色谱法：……………大于……………………… 用于分离非极性至中等极性的分子型化合物2、高效率液相色谱仪：1、高压输液泵2、色谱柱3、进样阀4、检测器：紫外稀释检测器、荧光检测器、热法折光检测器、电化学检测中国药典对高效液相色谱法规定：除固定相种类、流动相组分、检测器类型不得任意更改外，其余均可适当改变，色谱图于20min内记录完毕。
第五节色谱系统适用性试验和定量分析方法一、系统适用性试验1、色谱柱的理论板数：2、分离度：应大于1.53、重复性3、拖尾声因子：0.95-1.05之间二、定量测定法：1、内标法加较正因子测定供试品中某个杂质或主成分含量2、外标法测量供试品中某个杂质或主成分含量3、加较正因子的主成分自身对照法不加较正因子的主成分自身对照法。
清洁验证（TOC法）
清洁验证（TOC法）中药提取车间、中药制剂车间，以及共线生产多个品种的生产设备，为了保证最大限度降低药品生产过程中污染及交叉污染等风险，根据GMP（2010年版）的要求，必须要制定共线生产设备清洗验证方案。
由此可见清洁验证的重要性。
点击图片，查看详情对容易擦拭且表面平整的设备，采用棉签擦拭法；对不易擦拭取样的设备及管路，采用淋洗法。
根据设备的具体情况，确定可操作的清洗方法，要根据不同的清洗方法，通过测定微生物限度和总有机碳确定残留污染物的限度。
设备清洗使用擦拭法进行清洗验证的，相应的残留物检查，使用棉签擦拭法进行采集检查试样，加总有机碳检查用水溶解稀释后测定总有机碳；设备清洗使用淋洗法进行清洗验证的，相应的残留物检查，采集淋洗液作为检查试样测定总有机碳。
通过验证该分析方法的系统适用性、线性、准确度、重复性，确认该方法适合于设备清洗验证的检测要求，取样回收率验证取样方法的有效性。
验证目的通过TOC法的验证，确保该方法能够准确可靠地检测出共线生产设备清洗后的残留的污染物，能够符合预期的限度标准。
这是每一位制药行业的同仁都需要注意的。
验证范围适用于中药提取车间、中药制剂车间等共线生产相关设备清洗后，采集样品的TOC测定方法的验证。
所以，TOC方法进行清洁验证，在医药和生物制药行业里，到底应该怎样定义呢？◆根据清洁过程而非产品简化验证方法；◆快速评估清洁过程的清洁能力；◆通过擦拭和淋洗取样法，优化关键清洁参数（TACT，即温度、动作、浓度与时间）；◆估量最坏的情形以及成分复杂的化合物，例如清洁剂；◆加快产品更换速度，更好地按计划生产。
TOC法的独特优势对于TOC法来说，将有机物设为专属物质时，无论其来源是产品、清洁剂、化学品、溶剂，还是副产物及微生物污染，要判断出任何残留物质是否存在，都能够地很好完成这一任务。
只要其分子结构中包含碳，就能够检测出任何的活性制药成分或者清洁用的残留物质。
而检测结果必须低于目标化合物物的限度，提高了清洁验证的严格性。
色谱测定法
正相色谱系统使用极性填充剂，常用的填 充剂有硅胶等。 离子交换填充剂用于离子交换色谱；凝胶 或高分子多孔微球等填充剂用于分子排阻 色谱等；手性键合填充剂用于对映异构体 的拆分分析。
填充剂的性能(如载体的形状、粒径、孔 径、表面积、键合基团的表面覆盖度、含 碳量和键合类型等)以及色谱柱的填充， 直接影响待测物的保留行为和分离效果。 孔径在15nm以下的填料适合于分析分子量 小于2000的化合物，分子量大于2000的化 合物则应选孔径在30nm以上的填料。
3．测定法 (1)内标法加校正因子测定供试品中某个杂 质或主成分含量
按各品种项下的规定，精密称(量)取对照 品和内标物质，分别配成溶液，精密量取 各溶液，配成校正因子测定用的对照溶液。 取一定量注入仪器，记录色谱图。 测量对照品和内标物质的峰面积或峰高， 按下式计算校正因子：
As/cs 校正因子(f) =
(1)色谱柱的理论板数(n)
在规定的色谱条件下，注入供试品溶液 或各品种项下规定的内标物质溶液，记 录色谱图，量出供试品主成分峰或内标 物质峰的保留时间tR(以分钟或长度计， 下同，但应取相同单位)和半高峰宽 (Wh/2)，按 n = 5.54(tR／Wh/2)2 计算色 谱柱的理论板数。
当有样品组分流过流通池时，检测器把 组分浓度转变成电信号，经过放大，用 记录器记录下来就得到色谱图。 色谱图是定性、定量和评价柱效高低的 依据。
1.对仪器的一般要求 所用的仪器为高效 液相色谱仪。仪器应定期检定并符合有关 规定。
(1) 色谱柱 键合硅胶。
最常用的色谱柱填充剂为化学
反相色谱系统使用非极性填充剂，以十八 烷基（C18）硅烷键合硅胶最为常用，辛 基（C8）硅烷键合硅胶和其他类型的硅烷 镑合硅胶(如氰基硅烷键合相和氨基硅烷 键合相等)也有使用。
检验仪器检验方法验证或确认
验方法进行确认，以确保检验数据准确、可靠；
法规要求
• 验证
– 《药品质量标准分析方法验证指导原则》
—《中国药典》2010年版附录XIX A • 确认？
40
定义
• 分析方法验证
– 证明所采用的方法适合于相应的检测要求 —《中国药典》
章（分析仪器的确认），其将实验 室仪器设备分为以下3 类，并推荐 了确认的级别：
• A 类，不具备测量功能，或者通常 只需要校准，供应商的技术标准可 以作为用户需求。例如：超声波清 洗剂，离心机，摇床等。
• B 类：此类仪器具有测量功能，并且 仪器控制的物理参数（如温度，压力 或流速等）需要校准，用户需求一般 与供应商的功能标准和操作限度相同。 例如：熔点仪、分析天平、p H计、折 射仪、滴定仪、干燥箱等。此类仪器 或设备通常需要进行安装确认和运行 确认，并制定相关操作、校验及维护 的标准规程。
6个月
1年 1年
2年
噪音：0.04mAU 漂移：0.5mAU/h
R=0.990 色谱峰面积：1.000% 色谱峰高：2.000%
符合检定规程要求 JJG 705-2002 液相色谱仪检 定规程
分析天平的校验示例
• 称量是分析实验过程中最普遍的操作之一，准确 可靠的分析天平是实验室必不可少的仪器。下面 列举了分析天平校准需要考虑的因素：
• 外部校准
• 由具有校准资质的外部机构进行的校准， 外部机构如国家权威机构（中国计量研究 院，各省市计量院）；国外校准机构（例 如瑞士 S G S校准机构，德国D K D 和PTB 校准机构）; 或有资质的仪器生产商的实验 室等。
分析方法确认与验证管理规程
一、目的：规范药品检验方法确认与验证的管理，证明采用的方法适合相应的检测要求及在实验室条件下的适用性，保证检验结果准确、可靠。
二、适用范围：适用于中药和化学药品（包括物料和产品）的理化分析方法和仪器分析方法的确认与验证。
不适用于中药和化学药品（包括物料和产品）微生物分析方法的确认与验证。
三、相关职责：QC班组长：QC班组长根据检验方法的来源确定开展方法确认或验证。
由其本人或者其他有经验的检验人员起草方案；负责确认或验证方案的培训；安排有经验的人员参与方法确认或验证过程实施；对确认或验证过程中出现的偏差要严格按照相关管理规程的程序执行，如需要提出变更申请；对确认或验证工作中出现的问题及时纠正并记录；总结确认或验证报告。
QC主管：负责审核检验方法确认或验证方案，并对方案的执行过程进行追踪；负责组织偏差的调查，变更的审核；负责总结报告的审核。
化验室QA：监督各项目按照已制定的方案进行；参与确认或验证过程中的偏差调查；对提出的变更进行评估，确认变更的是否成立，跟踪变更实施。
QA主管：负责审核检验方法确认或验证方案，确保其法规符合性；参与偏差的调查，变更的审核；负责总结报告的审核。
验证专员：审核检验方法确认或验证方案；审核总结报告；负责验证证书的发放；负责方法确认或验证方案、记录和报告的整理、存档。
质量管理负责人：批准检验方法确认或验证方案；批准方案实施过程中出现的偏差和变更；批准总结报告。
四、制定依据：《药品GMP指南》（质量控制实验室与物料系统）、《药品生产质量管理规范》（2010年修订）、《中国药典》（2020年版）、《化学药物质量控制分析方法验证技术指导原则》、ICH分析方法验证：正文和方法学Q2（R1 ）、中国药品检验标准操作规范（2010年版）（原子吸收分光光度法）。
五、内容：1、术语1.1方法验证方法验证系指根据检验项目的要求，预先设置一定的验证内容和验证标准要求，并通过设计合理的实验来验证所采用的分析方法是否符合检验项目的要求。
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拖尾因子
• T=W0.05h/2dl • W0.05峰高处的峰宽 • dl为峰极大至前言之间 的距离 • 峰高定量时,T应在 0.95~1.05之间
dl
W0.05h
12
相对标准偏差RSD
• 标准连续进样至少５次或６次，计算峰面积的重 复程度。 • USP和EP要求：当规定的RSD≤2.0%时，标准溶 液需要重复进样５次；当规定的RSD≥2.0%时， 标准溶液需要重复进样６次，如残留溶剂测定， RSD≤15%。2ຫໍສະໝຸດ 统适用性试验2005-09
3
引用法规
• 各国药典要求：USP/EP/BP/JP/CP
• FDA、欧美客户审计检查色谱记录必查内容 实验室检查易出问题的地方
最易被国内企业忽视的问题
4
系统适用性试验概念
• GC和HPLC完整分析的一部分； • 确认色谱系统的分离度和重现性； • 是用规定的对照溶液或测试溶液对仪器进行试验 和调整，应达到方法规定的要求；或规定状态下 的色谱柱的最小理论塔板数N 、分离度R 、拖尾 因子Ｔ、及相对标准偏差RSD符合要求。 • 其评价的是检测中仪器、电信号、分析操作及样 品等方面的综合特性。
除非系统适用性试验满足要求，否则样品分析无效。 • Sample analyses obtained while the system fails requirements are unacceptable. 系统适用性试验失败，样品分析结果是不能接受的。
16
USP要求
• 除了在样品分析前进行系统适用性试验外，在进 样中间、样品分析完成后，要进行系统精密度评 价。 • 参考处理办法：SOP定义，如首5-中-2-末1。 • 间隔：3-4批(6-8次进样)或3个小时(参考)。 • 计算RSD以评价：首5-中7-…-+2-末1。 • RSD≤2.0%(含量测定)。
20
13
系统适用性试验的要求
• 在各品种项下对系统适用性试验有明确要求的， 测定结果应满足该方法或药典各品种项下的规定。 • 在各品种项下对系统适用性试验未有明确要求的， 测定结果应满足该方法或药典版本通则的要求。 如R>1.5，RSD不大于2.0%。
14
USP的要求
• 调节操作条件以满足系统适用性要求是允许的； • 除非在专题中特别说明，系统适用性参数以待测组分测定；为了评价 系统的精密度，需要在进样前、进样中(以一定的时间间隔)、进样后 进适当的控制样品评价； • 评价的样品：标准溶液或已知含量的样品； • 如仪器或关键试剂有明显改变，在进样前应先进行系统适用性试验； • No sample analysis is acceptable unless the requirements of system suitability have been met. sample analyses obtained while the system fails requirements are unacceptable.
5
目的及使用范围
• 色谱：主要是GC和HPLC
• 其评价的是检测中仪器、电信号、分析操作及样 品等方面的综合特性。
• 针对色谱特点：漂移、影响因素多。
6
评价参数
• 理论塔板数N
以被分析物主峰或规定的色谱峰计算柱效，以确 定色谱峰的尖锐程度，尤其在痕量组分测定中尤 为重要。
7
• 理论塔板数（N）
cGMP标准下实验室系统 达标培训
1
内容目录
• • • • • • • • • 系统适用性试验 标准品及工作标准品的管理 超限结果的调查(OOS) 药品稳定性研究(包括长期、 加速、 破坏性) 分析仪器的内部校验 分析仪器的验证 分析方法的验证 FDA/EMEA现场检查的准备及应对 中国企业应对FDA/EMEA检查的经验交流
( dP＝10μ N＝5万 ) ( dP＝5μ N＝10万 ) dP— 柱 填 料 的 颗 粒直径 tR--保留时间 W1/2——半峰宽
tR N＝5.54 W 1/ 2
2
8
分离度R
• 分离度是评价相邻峰分离程度，或内标峰与主峰 的分离程度，便于定量分析时确定测定结果的准 确性。
17
色谱条件的调节要求(1)
• 除非药典或方法中有明确要求，HPLC色谱条件如色谱柱 柱长、内径、流动相、流速、柱温、进样量、检测器的灵 敏度；GC的色谱柱长度、内径、载体牌号内径、粒度内 径、固定液涂布浓度、载气流速、柱温、进样量、检测器 的灵敏度等均可适当调整，以满足系统适用性试验的要求。 (CP) • HPLC的固定相种类、 流动相组分、 检测器类型及波长； GC的检测器类型、固定液品种及特殊的色谱柱材料，均 不得任意改变。(CP)
9
分离度（R>1.5）
• tR2相邻两峰中后一峰 的保留时间 • tR1相邻两峰中前一峰 的保留时间 • W1及W2为此相邻两 峰的峰宽
2(t R 2－t R1 ) RS＝ W 1＋W 2
10
拖尾因子Ｔ
• 拖尾因子Ｔ是评价色谱的对称性，便于保证峰积 分时的测量精度，尤其采用峰高法计算含量时。
11
15
原则
• 使用GC和HPLC进行含量分析，分析者首先应完成方法规定的系统适 用性试验；只有确信系统适用性试验满足方法规定的要求后，才能进 行样品的分析检验。 • No sample analysis is acceptable unless the requirements of system suitability have been met.
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色谱条件的调节要求(２)
• USP:流动相比例可以调整，色谱柱长度、 内径、 粒度、 进样量不得改变。 • 以上可改变的色谱条件，其变动幅度，除非有特殊要求， 可参照EP4规定的变动幅度适当变化。 • 但，变动要考虑接受程度。
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483表关于系统适用性试验
• • • • • • • 首次5张图谱不连续 图谱时间不连续 系统适用性试验 没进行或进行不充分 对策： SOP中有详细规定 有记录 图谱有计算