肿瘤细胞培养成纤维细胞排除法介绍
肿瘤细胞的培养
肿瘤细胞的培养一、体外培养肿瘤细胞的生物学特性体外培养的肿瘤细胞与体内正常细胞相比，在形态、遗传性状等方面都有显著的不同，而生长在体内的肿瘤细胞与在体外培养的肿瘤细胞也并非完全相同。
1、永生性永生性又称不死性，即在体外培养的肿瘤细胞一旦被建成细胞系，瘤细胞便可无限增值而不凋亡。
体外培养中的肿瘤细胞系或细胞株都表现有这种形状，体内肿瘤细胞是否如此尚无直接证明。
从今年建立细胞系或细胞株的过程说明，如果永生性是体内肿瘤细胞所固有的，肿瘤细胞应易于培养；而事实上，多数肿瘤细胞初代培养是并不那么容易，大多数也出现类似二倍体细胞培养中的停滞期。
在经过纯化成单一化瘤细胞后，在增值若干代后，才能顺利传代生长下去，获得永生性。
从而说明体外肿瘤细胞的永生性有可能是体外培养后获得的。
2、形态和形状培养中癌细胞无特异形态，镜下观察时大多数肿瘤细胞比二倍体细胞清洗，核膜、核仁轮廓明显，核糖体颗粒丰富。
电镜观察癌细胞表面的微绒毛多且细密，微丝走形不如正常细胞规则。
3、侵袭性侵袭性是肿瘤细胞的扩张型增值行为，体外培养的癌细胞仍持有这种性状。
当与正常组织混合培养时，它能侵入其他组织细胞中，并有穿透人工隔膜生长的能力。
4、生长增殖肿瘤细胞在体内具有不受控增殖性，在体外培养中仍如此。
癌细胞在低血清中（2%~5%）仍能生长，而正常二倍体细胞在体外培养中如不加含有促进细胞增殖生长因子的血清就不能增殖，因为肿瘤细胞有产生促增殖因子的能力。
正常细胞发生转化后，出现能在低血清培养基中生长的现象，这已成为检测细胞恶变的一个指标。
正常细胞在体外汇合时，细胞间会发生接触抑制。
而癌细胞或培养中发生恶性转化后的细胞能消除接触抑制，能相互重叠向三维空间发展，形成堆积物，因而肿瘤细胞在软琼脂（半固体琼脂）中形成集落的能力比正常细胞强。
5、细胞遗传大多数肿瘤细胞的遗传学性质发生改变，如失去二倍体核型、呈一倍体或多倍体等。
6、异质性所有肿瘤都是由具有不同的增殖能力、遗传性、起源、周期状态等性状的细胞组成，即肿瘤的异质性。
肿瘤相关成纤维细胞鉴定方法-概述说明以及解释
肿瘤相关成纤维细胞鉴定方法-概述说明以及解释1.引言【1.1 概述】本文旨在介绍肿瘤相关成纤维细胞的鉴定方法。
肿瘤是一种常见的疾病，对人类健康产生了极大的威胁。
成纤维细胞作为一种重要的细胞类型，对肿瘤的发生和发展起着重要的调节作用。
因此，准确鉴定肿瘤相关成纤维细胞对于深入研究肿瘤的发病机制以及寻找新的治疗策略具有重要意义。
本文将首先介绍成纤维细胞的重要性，包括其在正常生理条件下的维持组织结构和功能的作用，以及在肿瘤中的调节效应。
接着，将详细介绍目前已经发展出的肿瘤相关成纤维细胞的鉴定方法，包括基于细胞表面标记物的鉴定方法、基于转录组学的鉴定方法以及基于细胞功能的鉴定方法。
每种方法都有其特点和优劣势，因此深入了解这些方法对于进行准确的成纤维细胞鉴定具有重要意义。
最后，文章将总结目前的研究进展，指出肿瘤相关成纤维细胞鉴定方法在临床治疗和预后评估中的应用前景，并展望未来可能的研究方向。
通过本文的介绍，希望能够增加研究人员对于肿瘤相关成纤维细胞的认识，并为肿瘤的个体化治疗提供新的思路和方法。
总之，本文将以概述的方式介绍肿瘤相关成纤维细胞鉴定方法，旨在促进对肿瘤发生发展机制的深入理解，为肿瘤的精准诊疗提供新的思路和策略。
1.2 文章结构文章结构部分的内容可以是：文章结构：本文分为引言、正文和结论三个部分。
引言部分旨在概述本文的内容和目的，并介绍了肿瘤相关成纤维细胞鉴定方法的重要性。
正文部分主要包括成纤维细胞的重要性和肿瘤相关成纤维细胞的鉴定方法。
结论部分对本文进行了总结，并展望了未来可能的研究方向。
引言部分的概述主要介绍了成纤维细胞在生物体内的重要性。
成纤维细胞是一种常见的真核细胞类型，广泛存在于不同组织和器官中，对于维持组织结构的稳定和修复起着重要作用。
然而，肿瘤相关成纤维细胞的功能和特性与正常成纤维细胞存在差异，其在肿瘤发生、发展和治疗中具有重要的调节作用。
因此，准确鉴定肿瘤相关成纤维细胞是探索肿瘤发展机制和开展有效治疗策略的基础。
肿瘤药敏检测技术
基因检测指导靶向用药结 果不理想下可作为备选方 案
日本进入医保 中国临床应用较多
用药指南未规定 临床应用较少
国外伴随诊断市场 快速增长；进入用 药指南和医保
用药指南未规定
2
一、药敏检测技术需求分析
➢ 临床需求——精准医疗下肿瘤用药指导：药物敏感性、耐药性、副作用等
13
二、药敏检测技术路线
• 2D细胞模型——ATP-TCA生物荧光药敏检测
荧光素酶改造 • 改造目标：提高灵敏度、稳定性 • 改造流程可如下所示：
合成北美萤火虫 荧光素酶基因
设计点突变引物，定 向突变荧光酶潜在的 多个活性相关位点
通过蛋白工作站，纯 化生产重组荧光酶
筛选得到灵敏度和 稳定性高的克隆
四唑蓝比色法 (MTT)
简便、快捷、费用低
敏感性较差，最低仅能检测500个细胞；量程 较小，有效量程在2.0以内。
ATP生物荧光法
敏感性好（可检测最少10个细 胞）、可评价率高、快速检测、
精密度好、具备产业化条件
——
野生型荧光素酶通常稳定性较低，如在体外 37℃放置3分钟即失活。
海创生物的ATP-TCA技术核心： 1、化学结构改良的ATP荧光素酶，稳定表达荧光强度 2、肿瘤选择性培养基
微镜对胶滴中细胞的染色情况进行扫描 ，通过图像软件设定
亮度阈值，排除染色较浅的成纤维细胞, 计算肿瘤细胞形成
清除血细胞、死细胞、 的克隆的OD值， 计算出药物的抑制率。
非细胞杂质
实例2：使用达瑞生物的DR6690进行图像采集和分析
收集活细胞重新分散后与胶原 凝胶混合，制成胶滴
胶滴培养一定时间
胶原可外购，如 Sigma、Fluka的I型胶 原蛋白
肿瘤细胞培养
第6章肿瘤细胞得培养肿瘤细胞培养就是研究癌变机理、抗癌药得敏感性、肿瘤细胞与癌分子生物学特性得重要手段。
癌细胞就是比较容易培养得细胞，当前所建立得细胞系中癌细胞就是最多得。
应用体外细胞培养技术进行肿瘤研究具有许多优点：(1)可免受机体内环境因素得影响，避免了个体差异性，便于探索各种物理、化与生物因素对肿瘤细胞生命活动得影响。
(2)既便于从细胞水平上研究肿瘤细胞得结构与功能，又便于从基因及分子水平上研究癌变得发生机理；(3)可长期传代、保存，便于观察肿瘤细胞生物学特性与遗传行为得改变。
(4)可用于快速筛选抗癌药物与研究耐药机理。
(5)研究周期短，比较经济。
但就是它也有缺点，如长期培养可使细胞生物学特性发生改变;体外实验所得得结果不能完全代表体内得情况，应与体内试验结合研究更为合理等。
一、肿瘤细胞培养得生物学特性1、形态与性状形态不规则,细胞界限淸晰，伸展较差,核膜、核仁轮廉明显，核仁多、核浆丰富、折光性强, 电镜观察细胞表而微绒毛多而细密，与肿瘤细胞具不左向运动与铺着不依赖性有关、2、生物特性癌细胞在无血淸或低血淸(2%~ 5 %)时仍能生长,营养要求不奇，因能自分泌促增殖因子, 在软琼脂培养时单个细胞能形成集落，生长方向性消失，再加上失去了接触抑制，癌细胞数量增多时可呈多层重叠生长，细胞饱与密度大，有丰富得三极有丝分裂，分裂指数髙，细胞倍增周期短。
3、永生性永生性也称不死性,在体外培养中表现为可无限制传代而不凋亡(Apoptos i s ),体外培养得肿瘤细胞系(株)都表现有这种特性。
但体外培养得永生性与体内肿瘤得恶性(包括侵润性) 就是两种性状，受不同基因调控得，因恶性肿瘤多数在体外培养时并不那么容易获得成功，生长增殖能力并不旺盛，有时只能传若「代,说明体外培养得永生性可在体外培养后获得得。
另外，体外培养得许多细胞系，如N 1H3T3、Rat -1 10T1/2等均具有永生性而无恶性。
但两者有相关性，永生性可能就是细胞恶性变得某一阶段。
各种细胞传代方法
das1977 wrote:【专题讨论】我还做过骨髓间充质干细胞（MSC）的原代及传代培养，下面谈谈我的传代步骤：1. 弃去旧培养液。
2.D-Hank's液轻缓漂洗细胞两遍，尽量洗去残余血清，弃去D-Hank's液。
3 加0.25%胰酶（以盖满瓶底为标准）于37度条件下消化，倒置相差显微镜下观察，以细胞突起回缩，细胞间隙增大，细胞近乎缩成圆形为准。
4.直接加含血清的LG-DMEM培养基（或血清)终止消化。
5.用弯头吸管均匀有序的吹打细胞，动作不宜过猛，防止起泡产生。
5. 离心5分钟（1000转/分钟），去上清。
6.加入D-Hank's液吹打混匀，再离心一遍。
7. 用含10％小牛血清的DMEM培养液重悬细胞，按1：2传代。
8.补加培养液至所用瓶容积的1/10为准。
9.送孵箱培养。
我也在做骨髓间充质细胞的培养，细胞培养的新手。
大鼠骨髓经ficoll分层后培养。
一周换液2次。
三周后，可以传代了。
然后大约7天可以传代一次。
跟das1977的方法稍微有点不同。
1. 弃去旧培养液。
2.预热的PBS液轻缓漂洗细胞两遍，尽量洗去残余血清，弃去PBS3 加0.25%胰酶,0.05%EDTA于37度条件下消化，约两到三分钟，倒置相差显微镜下观察，细胞缩成圆形漂浮为准。
我还用手轻轻击打培养皿的两侧，希望可以加速其消化。
实验室里的人都这么干，我就有样学样了。
：）4.直接加含10%的LM-aMEM培养基（或血清)终止消化。
5.我没有吹打细胞这个过程哦。
下次试试看。
但是结果还是不错的。
5. 离心5分钟（1200转/分钟），去上清。
6.加入PBS液吹打混匀，再离心一遍。
7. 用培养液重悬细胞，按1：2传代。
有一次贪心，按1：4传代，结果细胞数太少了，没有一瓶长好的。
5555。
下次不能贪心了。
8. 补加培养液。
75cm2的，加10-15ml9.送孵箱培养。
我还培养了C2C12(购自ATCC),传代方法基本一致。
肿瘤细胞培养
一、组织培养肿瘤细胞生物学特性肿瘤细胞与体内正常细胞相比，不论在体内或在体外，在形态、生长增值、遗传性状等方面都有显著的不同。
生长在体内的肿瘤细胞和在体外培养的肿瘤细胞，其差异较小，但也并非完全相同。
培养中的肿瘤细胞具以下突出特点：（－）形态和性状培养中癌细胞无光学显微镜下特异形态，大多数肿瘤细胞镜下观察比二倍体细胞清晰，核膜、核仁轮廓明显，核糖体颗粒丰富。
电镜观察癌细胞表面的微绒毛多而细密，微丝走行不如正常细胞规则，可能与肿瘤细胞具有不定向运动和锚着不依赖性有关。
（二）生长增殖肿瘤细胞在体内具有不受控增殖性，在体外培养中仍如此。
正常二倍体细胞在体外培养中不加血清不能增殖，是因血清中含有很细胞增殖生长的因子，而癌细胞在低血清中（2％～5％）仍能生长。
已证明肿瘤细胞有自泌或内泌性产生促增殖因子能力。
正常细胞发生转化后，出现能在低血清培养基中生长的现象，已成为检测细胞恶变的一个指标。
癌细胞或培养中发生恶性转化后的单个时，形成集落（克隆）的能力比正常细胞强。
另外癌细胞增殖数量增多扩展时，接触抑制消除，细胞能相互重叠向三维空间发展，形成堆积物。
（三）永生性永生性也称不死性。
在体外培养中表现为细胞可无限传代而不凋亡（Apoptosis）。
体外培养中的肿瘤细胞系或细胞株都表现有这种性状，体内肿瘤细胞是否如此尚无直接证明。
因恶性肿瘤终将杀死宿主并同归于尽，从而难以证明这一性状的存在。
体外肿癌细胞的永生性是否能反证它在体内时同样如此？也尚难肯定。
从近年建立细胞系或株的过程说明，如果永生性是体内肿瘤细胞所固有的，肿瘤细胞应易于培养。
事实上，多数肿瘤细胞初代培养时并不那么容易。
生长增殖并不旺盛；经过纯化成单一化瘤细胞后，也大多增殖若干代后，便出现类似二倍体中的停滞期。
过此阶段后才获得永生性，顺利传代生长下去。
从而说明体外肿瘤细胞的永生性有可能是体外培养后获得的。
从一些具有永生性而无恶性性的细胞系，如NIH3T3、Rat－1、10T1/2等细胞证明，永生性和恶性（包括浸润性）是两种性状，受不同基因调控，但却有相关性。
肝内胆管细胞癌相关成纤维细胞的分离、纯化及鉴定
肝内胆管细胞癌相关成纤维细胞的分离、纯化及鉴定杨柳晓;高强【摘要】目的:探讨肝内胆管癌相关成纤维细胞(iCAFs)的分离、纯化和鉴定方法,为后续研究奠定基础.方法:在无菌条件下,留取肝内胆管细胞癌(iCCA)组织标本,充分剪碎后置入含Ⅳ型胶原酶和透明质酸酶的消化液中恒温振荡,将所得的单细胞悬液进行免疫磁珠分选纯化,分离出肿瘤相关成纤维细胞(CAFs)并培养.通过观察细胞形态,并经免疫荧光和流式细胞仪测定,鉴定其是否为iCAFs.结果:iCAFs呈长条形或纺锤形,胞质透明,折光明显,胞核单个、呈圆形或卵圆形,细胞突起相互交错重叠形成网格状排列、密集时呈现“峰-谷”样表现;免疫荧光检测显示,α平滑肌肌动蛋白(+)、波形蛋白(+)、复合型角蛋白抗体(一);流式细胞仪检测示,α平滑肌肌动蛋白(+),同时CD34和CD45均为(一).结论:酶消化法联合免疫磁珠分选可有效分离出高纯度的iCAFs,为进一步研究iCAFs的相关功能研究提供了良好的平台.【期刊名称】《中国临床医学》【年(卷),期】2016(023)002【总页数】5页(P131-135)【关键词】肝内胆管细胞癌;肿瘤相关成纤维细胞;分离;鉴定【作者】杨柳晓;高强【作者单位】复旦大学附属中山医院重症医学科,上海200032;复旦大学附属中山医院肝外科,上海200032【正文语种】中文【中图分类】R735.9肿瘤微环境中的成纤维细胞被活化后可以通过自分泌和(或)旁分泌途径为上皮提供促癌信号、参与肿瘤血管的形成，促进肿瘤侵袭转移[1]。
这类具有特殊表型及功能、存在于肿瘤间质中的成纤维细胞群即被称为肿瘤相关成纤维细胞(carcinoma-associated fibroblasts, CAFs)。
研究[2]证实，CAFs的聚集和活化可以影响多种实体肿瘤的发生、发展及侵袭。
肝内胆管细胞癌(intrahepatic cholangiocarcinoma, iCCA)是一种具有丰富间质成分的原发性肝癌，其肿瘤间质中富含的CAFs与肝内胆管细胞癌的发生发展密切相关[3]。
细胞的形态
获取脑组织后，仔细剥除脑膜、血管和纤维成分，置 Hanks液中漂洗一、二次。 2、置于30—50倍体积的Hanks液中，此时脑组织比较 柔软，反复吹打即制成细胞悬液。 3、把悬液注入离心管室温中直立5—10分钟后，细胞 或细胞团快自然下沉，脂肪等杂物易漂浮，可吸除上 层、反复二、三次，即可排除脂肪成分和其它碎块并 获较多细胞成分。 4、在沉降物中加入适量培养液，通过纱网过滤，计数 并调整细胞密度。 5、接入培养瓶或皿中，置5%CO2温箱中培养。 该细胞适应环境过程较长，接种后贴壁较慢。贴壁后 短期内也可能不见细胞分裂现象，然而一旦生长后即 能迅速进入旺盛的增殖状态。细胞传代可以0.25%胰酶 消化处理。
神经细胞分散培养
（一） 选材 常用胚胎动物或新生鼠神经组织。鸡 胚常用胚龄6-8d，新生鼠或胎鼠（12-14d）或人胚 胎。不过也有认为与组织相关。如大白鼠胚胎以 19d为宜，小鼠以18d为宜，大鼠纹状体以10d为宜； 若纹状体与黑质联合培养的大鼠胚，则黑质以13d， 纹状体18-21d为宜；小脑以20-21d小鼠胚胎，所获 蒲氏细胞成活率高，颗粒细胞正在分化；脊髓与 DRG联合培养，常用4-7d鸡胚或12-14d小鼠胚胎， 取材易，神经成活率高。
Cultured neuron
Cultured microglia
大鼠肝细胞的培养(成年)
培养液: Koga 培养液, 最好加入Williams 和 Waymouth MB752/1) 消化液:型胶原酶300U/mg, 使用浓度为 0.025% 方法: 1 灌流法分离肝细胞：门静脉和下腔 插管静脉插管 2、用预灌流液(8.3 mg/ml NaCl,0.5 mg/ml KCl,2.4 mg/ml HEPES,pH 7.4)灌流8分钟
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
肿瘤细胞培养成纤维细胞排除法介绍
1．机械刮除法：
是用不锈钢丝末端插有橡胶刮头（用胶塞剪成三角形插以不锈钢丝）、或裹少许脱脂棉制成，装入试管中高压灭菌后备用（也可用特制电热
烧灼器刮除）。
刮除程序为：
（1）标记：镜下观察，用不脱色笔在培养瓶皿的背面圈下生长肿瘤细
胞的部位；
（2）刮除：弃掉培养液，把无菌胶刮伸入瓶皿中，肉眼或显微镜窥视下，刮除无标记空间；
（3）用Hanks液冲洗一两次，洗除被刮掉的细胞；
（4）注入培养液继续培养，如发现仍有成纤维细胞残留，可重复刮除
至完全除掉为止
2．反复贴壁法：
根据肿瘤细胞比成纤维细胞贴壁速度慢的特点，并结合使用不加血清
的营养液，把含有两类细胞的细胞悬液反复贴壁，使两类细胞相互分离，操作方法与传代相同。
（1）待细胞生长达一定数量后，倒出旧培养液，用胰酶消化后，Hank
s 冲洗2次，加入不含血清的培养液，吹打制成细胞悬液；
（2）取编号为此A、B、C三个培养瓶；首先把悬液接种入A培养瓶中。
置温箱中静止培养5～20分钟后，轻轻倾斜培养瓶，让液体集中瓶角后
慢慢吸出全部培养液，再接种入B培养瓶中后；向A瓶中补充少许完全
培养液置温箱中继续培养；
（4）培养B瓶中细胞5～20分钟后，接处理A的方法，把培养液注入C培
养瓶中；再向B瓶中补加完全培养基。
当三个瓶内都含有培养液后，均在温箱中继续培养。
如操作成功，次
日观察可见A瓶主要为成纤维细胞，B瓶两类细胞相杂，C瓶可能主要为
癌细胞。
必要时可反复处理多次，直至癌细胞纯化为止。
3．消化排除法：
此法曾用于乳癌细胞的培养，具体程序是：
（1）先是用0.5%胰蛋白酶和0.02％EDTA（1：1）混合液漂洗培养细胞
一次，然后再换成新的混合液继续消化，并在倒置显微镜下窥视和不
时摇动培养瓶，到半数细胞脱落下来后，便立即停止消化；
（2）把消化液吸入离心管中，离心去上清，吸入另瓶中，加培养液置
温箱中培养；向原瓶内也补加新的培养液继续培养。
用此法处理后，
成纤维细胞比肿瘤细胞易先脱落。
经过几次反复处理，可能把成纤维
细胞除净。
4．胶原酶消化法：
本法是利用成纤维细胞对胶原酶较为敏感的特点，通过消化进行选择。
（1）可用0.5mg/ml的胶原酶消化处理，边消化边在倒置显微镜下窥视，当发现成纤维细胞被除掉后，即终止消化；
（2）用Hanks洗涤处理一次后，更换新培养液，继续培养，可获纯净
肿瘤细胞。
如成纤维细胞未被除净，可再次重复。
5．其它方法：
有人发现聚丙烯酰胺有抑制成纤维细胞生长的作用；也有人用聚蔗糖
制备成比重1.025～1.085的密度梯度离心液，加入细胞悬液后，在23℃中 800g离心 10分种。
在比重1.025～1.050层为成纤维细胞，在比重1. 050～1.085层为上皮细胞，再经过分离进行培养。
最近也有人应用特
殊化学物如 SOD抑制成纤维细胞生长的方法。
选用上述任何一种方法，都需进行试验，取得必要经验，找出适合的
条件，才能获得好的效果。