植物育种学论文

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单倍体育种综述

Research Of Haploid Breeding

【摘要】本文介绍了单倍体育种的概念、研究现状、特点，重点介绍了单倍体产生途径、鉴定与二倍化方法，讨论了单倍体育种技术在作物育种中的应用以及应用前景。【关键词】单倍体育种产生途径应用发展前景Abstract：t he paper introduce the concept,circumstance and characteristics of haploid breeding.The research progress of the haploid,identification method haploid-doubling

method were key introduced in this paper.The application and development prospects of haploid techniques in haploid breeding are discussed.

Key words：haploid breeding progress of haploid application development prospects 0前言

自Chase在1949年提出单倍体技术，即利用自然发生或人工培育的单倍体植株，经过自然或人工加倍获得双单倍体，单倍体已在植物遗传与育种研究中得到广泛应用。单倍体经染色体加倍获得纯合二倍体，从中选育自交系，缩短了育种年限，提高育种效率[1]，加速了育种进程，因此受到育种家们的极大重视。

1概念

单倍体育种是利用各种有效方法产生单倍体后，进行染色体人工或自然加倍，使植株恢复正常育性，迅速获得稳定的新品种的育种方法。

单倍体是指只含一组染色体的个体、组织或细胞。在植物的正常发育过程中，只有减数分裂后形成的大、小孢子及由其形成的雌雄配子体的细胞是单倍体。

2研究现状

育种家们对从单倍体获得纯系的兴趣浓厚，因为利用单倍体技术培育优势杂种，可缩短育种时间。其实，早在1929年,Randolph和Stadler就首次报道了单倍体,产生了在育种中利用单倍体技术的思想,但由于有两个限制因素，即难以获得足够数量的单倍体育种材料和单倍体二倍体化时的困难,导致单倍体技术没有得到广泛应用[2]。

目前，在美国产生玉米纯系的单倍体技术，正被玉米商业育种家广泛地利用[3]。此外瓜类作物单倍体育种中的子房培养、胚抢救和花药培养等均已获得成功,并取得了可喜的进展,但仍然存在诱导频率低[4]、重复性差等问题,而且离建立一套成熟的培养体系和单倍体加倍方法有待继续探讨。

3单倍体育种的优缺点及特点

单倍体育种的优点：①控制杂种后代分离，缩短育种年限。②提高获得纯合材料的效率。③排除显隐性干扰，提高选择的准确性。④与其他的育种方法相结合，提高选择

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效果。⑤为研究细胞学、遗传学理论问题提供素材。

单倍体育种的缺点：①缺乏常规育种各个分离世代的基因重组和交换，减少了优良基因积累的机会。②缺乏各种材料在田间观察评定的机会。③诱导单倍体的技术不完善，花药培养时出愈率、绿苗率不高，好的类型可能丢失。

单倍体的特点：与正常植株相比，单倍体植株细弱、矮小，叶片较薄，花器较小，叶绿体数目较少，体细胞、细胞核、花粉母细胞和淀粉粒都变小，花粉粒小而空瘪，不能正常授粉结实，基本是高度不育。但是，单倍体植株一旦染色体加倍，即可恢复正常的形态、解剖结构、遗传与生理机能，并可获得遗传上纯合二倍体的后代，快速培育优良玉米纯系的好方法。

4单倍体的产生途径

4.1自然发生的单倍体[5]

自然界中大多数生物都是二倍体，而低等植物主要是单倍体，是由配子（孢子）直接产生的，不会出现不育性问题。高等植物自然发生的单倍体，一般是由于生殖过程异常所引起的孤雌或孤雄生殖而来的。

4.2花粉、花药培养诱导单倍体

花粉、花药培养的原理是依据植物每一特化的营养细胞都具有发育成完整植株的“潜在全能性”原理。花药培养是把发育到一定阶段的花药接种到培养基上来改变花粉的发育程序,使其分裂形成细胞团,进而分化成胚状体,产生再生植株或形成愈伤组织,由愈伤组织再分化成植株[6,7]。花粉培养是指把花粉从花药中分离出来,以单个花粉粒作为外殖体进行离体培养的技术[8]。

花粉、花药培养效率受供体植物的基因型、花粉发育时期、培养基及其添加物、预处理方式、供体植物的生长状况等的影响，基因型是影响单倍体培养的主要因素。付迎军[9]等研究表明，不同基因型的玉米花药培养的诱导频率差异非常明显，杂交种的诱导频率要比纯系高。目前，此方法已在小麦[10]、玉米[11,12]、水稻等作物上取得了重大进展，但其缺点是要经过组织培养的过程,先诱导愈伤组织,再分化形成再生植株,但并非每个小孢子都能无性增殖。二倍体化以后,因适应性问题而出现生长或结实的困难。

4.3孤雌生殖诱导单倍体

利用异种花粉授粉,刺激未受精卵发育引起孤雌生殖产生单倍体;利用紫外线处理的成熟花粉粒给正常植株授粉,让已无授精能力的花粉去刺激未受精的卵细胞单性发育成单倍体的胚;利用甲苯胺蓝等化学药剂处理花粉产生单倍体，但化学药物诱导孤雌生殖[13~15]常易产生一些影响生理生化和形态上的畸变,其可靠性常受到怀疑。

4.4远缘杂交诱导产生单倍体

在远缘杂交中，可能由于双亲体细胞分裂周期的不同步，导致某一亲本染色体的丢失，从而引起单倍体的发生。亲缘关系较远的花粉一般很难使母本的卵细胞受精，但却能刺激卵细胞单性发育，由此可产生单倍体或经核内复制形成双倍体。

朱庆麟[16,17]等用失活花粉、衰老而丧失授精能力的花粉、无授粉能力的幼嫩花粉及

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异种花粉诱发玉米孤雌生殖诱导率较低，而用向日葵、南瓜和棉花花粉混合给玉米授粉，诱导率比分别授粉都要高。远缘花粉诱导孤雌生殖效果不稳定，不同材料的变异很大[18]。

4.5.化学药剂诱导产生单倍体

利用植物调节剂直接刺激卵细胞，使之分裂诱发孤雌生殖，此法简便易行。药剂诱导产生单倍体已有许多成功报道，如用药剂处理未授粉的花柱、柱头或子房,在玉米、油菜和小麦等作物[19~24]。

4.6延迟授粉诱导产生单倍体

延迟授粉，花粉管即使到达胚囊内，卵细胞由于丧失受精能力而不能受精，但其受花粉管刺激后容易引起分裂，从而进行孤雌生殖形成单倍体植株。去雄后延迟授粉可以大大提高孤雌生殖的诱导率。而且延迟天数对诱导效果影响很大[19,25~27]。其原因可能是授粉促进胚乳的形成，从而保证孤雌生殖幼胚的顺利发育。

4.7辐射诱导

外殖体在培养诱导产生愈伤组织或植物开花前至受精的过程中[28],用射线照射愈伤组织细胞团或将父本花粉经X射线处理后,给去雄的母本受粉,以影响其受精,可诱发单性生殖产生单倍体。

5单倍体的鉴定方法[29,30]

5.1形态特征上鉴定

利用形态特征来鉴定单倍体是一种直观和便捷的方法。在幼苗期可以用目测选出大部分的单倍体。单倍体在正常生长状态下常常比它的标准类型小的多。单倍体植物的特点是:开花较早,延续时间长;花不正常、败育,结的果实少而小;单倍体植株矮小,叶片、花、花药、气孔均较小,花序较紧密、花较多,花丝短,其相应的二倍体则相反。

5.2生理生化特性上鉴定

单倍体减数分裂不正常，花粉败育很高，故通过检查花粉质量来鉴定单倍体是一种较为准确的方法。但对不能无性繁殖而又不能保存植株的一年生种子植物来说，则要等到生育后期，如开花期才能初步鉴定出单倍体。

5.3遗传标记鉴定

遗传标记鉴定方法是目前最可靠有效的单倍体鉴定方法。利用具有在不同遗传背景下能稳定表达的显性性状标记的基因型作供粉种，根据植株显性性状表达与否可将孤雌生殖来源的单倍体或双单倍体与杂交产生的杂合体快速区分开来，从而简化整个孤雌生殖诱导程序。

5.4细胞学鉴定

根据以上三种鉴定方法初步选出单倍体，必须经过细胞学鉴定，检查染色体数目才能真正的确定。如在检查单倍体根尖细胞染色体数时,应注意到由于单倍体植株根尖细

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胞具有二倍化的倾向,细胞中染色体组可能自然加倍,故必要时可对需鉴别的植株的幼叶或花芽细胞进行染色休的计数,或检查孢原组织细胞或花粉母细胞,以确定其倍数性。

6单倍体的二倍化

6.1自然加倍法

自然状态下，单倍体各部分组织的体细胞发生自然加倍的现象是普遍存在的。目前，有关单倍体自然加倍的机制尚不清楚，但从自然加倍的广泛程度来看，可以认为，单倍体回复二倍性是细胞的一种本能反应。

单倍体的自然加倍频率较低，大约5％一10％，有些材料不发生自然加倍。仅仅依靠单倍体的自然加倍难以满足育种实践的要求,必需对其进行人工加倍。单倍体自然加倍受环境影响较大，研究表明：在同一环境条件下基础材料间单倍体加倍率变异不显著，而种植环境间单倍体加倍率变异极显著。

6.2单倍体的化学加倍

人工加倍最有效的方法是利用化学药剂破坏细胞有丝分裂的纺锤丝，使两个子细胞染色体在有丝分裂后期不移向两极，人为改变分裂细胞染色体倍性，实现染色体化学加倍。秋水仙素是目前最常用的化学加倍剂，加倍方法主要有浸种法、浸根法、注射法、浸芽法和培养基掺入法等。

浸种法是用适当浓度的秋水仙素对种子进行适当时间的浸泡，浸泡浓度和浸泡时间都会影响处理结果。

浸根法是在幼苗的适当时期，对幼苗根系进行浸泡。浸根法的加倍效果比较好，但是需要育苗、处理、移栽等，用药量大，而且移栽后的成活率比较低，成本较高。

注射法是用注射器将适当浓度的秋水仙素注射到单倍体内，浓度用量和注射时期都会影响处理结果。注射法可以直接在田间生长的单倍体上进行，不必要进行育苗和移栽，用药量少，适合于大量材料的处理。

浸芽法是将种子在实验室内发芽后，用一定浓度的秋水仙素涂抹幼芽生长点。该方法可在苗床内进行，不损伤根系，成活率高，是一种较实用的加倍方法培养基掺入法是将愈伤组织临时转入加有低浓度秋水仙素的培养基中，从而使愈伤组织的单倍体细胞加倍成二倍体，这样再分化出来的花粉植株也是二倍体。通过这种途径的单倍体加倍率远远于直接处理单倍体植株。

7单倍体技术在育种上的应用

7.1单倍体技术在玉米育种中的应用

单倍体技术培育玉米自交系在美国正被玉米商业育种家广泛地利用。在我国,最早开展此项研究的中国科学院遗传研究所,通过采用孤雌生殖技术,在不到20年的时间里已育成3000多个孤雌生殖纯系,其中综合性状优良或个别性状突出,可直接或间接用于育种的近350个,选出多个优良组合参加省级和国家级区试。遗单6号、科玉10号、秦单5号已通过审定,并在生产上进行推广[31,32]。

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7.2单倍体技术在瓜类育种中的应用

在瓜类作物中,自发产生单倍体的频率极低[33],为了获得单倍体,研究者们尝试了用花药培养、未授粉子房离体培养、辐射花粉诱导的孤雌生殖等手段诱导单倍体。据报道,目前南瓜属、葫芦属、西瓜属和苦瓜属等5个属均已获得了单倍体,有的已在育种中应用[34]。

7.3单倍体技术在小麦育种中的应用

自1988年Laurie等首次利用小麦与玉米杂交获得小麦单倍体植株以来，国内外已有许多报道。小麦与玉米杂交，利用玉米染色体的消失而产生小麦单倍体是一种新的单倍体育种途径。在小麦育种中，通过双单倍体在一个世代中就可以得到纯合重组体，这对于缩短育种年限、提高育种效率是很有意义的。由于这种方法是在杂交两周左右直接进行幼胚培养，无染色体自然加倍，产生的植株均是单倍体，而单倍体只有加倍成为双倍体后，才能正常结实而稳定遗传下去，使单倍体育种变为现实。

7.4单倍体技术在水稻育种中的应用

水稻单倍体育种已经受到各国育种学家的普遍重视，并已取得了显著成效。单倍体育种技术对水稻育种而言是一种多、快、好、省的方法，我国在1974年成功研制的一种水稻花药N4培养基，从而突破了水稻单倍体的主要技术难关。目前，用单倍体育种技术以培育出了水稻“单3”、“单4”、“单8”新品系，其中，单4品系具有株型收敛，适合密集，高产、喜肥抗倒伏，抗病性较强等特点，亩产千斤以上，农艺性状均优于当地推广品种[35,36]。

8发展前景

单倍体育种技术的应用前景十分诱人，与传统的杂交相比，单位体育种技术缩短育种年限，而且，离体培养直接得到纯合株,有利和不利的隐性突变基因都可以得到表达,进行离体诱变和抗性突变体筛选,可使选择效率大大提高。

单倍体育种技术与种质扩增和育种材料进行重组与改良，使其积累足够的有利基因位点，然后利用单倍体技术获得性状优良的纯系，将会极大地发挥单倍体育种技术的优势，极大提高玉米育种的效率，并且双单倍体群体在遗传学研究上具有重要的研究价值,可应用于遗传图谱的构建、基因定位及克隆[37]。

我认为，随着单倍体育种技术的不断完善，在未来，单倍体育种技术可以和品种设计、分子育种、转基因技术等结合起来，使单倍体育种技术发挥更大作用。而现在，主要研究方向是提高单倍体诱导率和提高单倍体加倍技术。

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