超滤法结合大孔吸附树脂法制备复方双中药注射液

第３２卷第４期２０１８年８月南华大学学报(自然科学版)ＪｏｕｒｎａｌｏｆＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＳｏｕｔｈＣｈｉｎａ(ＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ)Ｖｏｌ ３２Ｎｏ ４Ａｕｇ ２０１８收稿日期:２０１８－０３－２２基金项目:湖南省科技计划资助项目(２０１４ＦＪ３１３４)作者简介:罗㊀甜(１９９１－)ꎬ女ꎬ硕士研究生ꎬ主要从事中药的提取和分离方面的研究.Ｅ￣ｍａｉｌ:ｌｕｏｔｉａｎｎ＠１６３.ｃｏｍ.∗通信作者:肖新荣(１９６３－)ꎬ男ꎬ教授ꎬ硕士ꎬ主要从事中药的提取与分离㊁药物中间体的合成相关研究.Ｅ￣ｍａｉｌ:ｘｒｒ６３ｘｉａｏ＠ｑｑ.ｃｏｍＤＯＩ:１０ １９４３１/ｊ ｃｎｋｉ １６７３－００６２ ２０１８ ０４ ０１４超滤法结合大孔吸附树脂法制备复方双中药注射液罗㊀甜ꎬ肖新荣∗ꎬ黄卓贤ꎬ苗㊀青(南华大学化学化工学院ꎬ湖南衡阳４２１００１)摘㊀要:超滤法初步提取双中药银杏叶和绞股蓝中抗心脑血管疾病有效成分ꎬ利用ＡＢ￣８大孔吸附树脂对初提物中银杏黄酮㊁绞股蓝黄酮㊁绞股蓝皂苷等进行进一步纯化ꎬ制备出复方银杏绞股蓝双中药盐酸曲美他嗪注射液.同时ꎬ进行了双中药注射液稳定性研究.研究结果表明ꎬ在超声振荡的条件下ꎬ超滤法提取抗心脑血管疾病有效成分正交实验的最佳条件为:乙醇体积浓度８０％ꎬ固液比１ʒ２０ꎬ超声时间１０ｍｉｎ.ＡＢ￣８大孔吸附树脂纯化的最佳条件为:上样液浓度总黄酮为１.２５２３ｍｇ/ｍＬ~２.５０４７ｍｇ/ｍＬꎬ总皂苷为０.４２９４ｍｇ/ｍＬ~１.２８８３ｍｇ/ｍＬꎬ洗脱剂为体积浓度为７０％的乙醇.纯化后产物中总黄酮㊁总皂苷的平均质量分数分别为３７.３５％㊁１２.７５％ꎬ黄酮与皂苷的比值为２.９３.注射剂稳定性考察结果显示在３０ｄ内－１０ħ㊁２５ħ条件下有效成分的含量变化在５％以内.关键词:银杏叶ꎻ绞股蓝ꎻ超滤ꎻＡＢ￣８大孔吸附树脂ꎻ注射液中图分类号:ＴＱ４６９文献标志码:Ｂ文章编号:１６７３－００６２(２０１８)０４－００９０－０７ＰｒｅｐａｒａｔｉｏｎｏｆＣｏｍｐｏｕｎｄＤｏｕｂｌｅＴｒａｄｉｔｉｏｎａｌＣｈｉｎｅｓｅＭｅｄｉｃｉｎｅＩｎｊｅｃｔｉｏｎｂｙＵｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎＭｅｔｈｏｄａｎｄＭａｃｒｏｐｏｒｏｕｓＡｄｓｏｒｐｔｉｏｎＲｅｓｉｎＭｅｔｈｏｄＬＵＯＴｉａｎꎬＸＩＡＯＸｉｎｒｏｎｇ∗ꎬＨＵＡＮＧＺｈｕｏｘｉａｎꎬＭＩＡＯＱｉｎｇ(ＳｃｈｏｏｌｏｆＣｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄＣｈｅｍｉｃａｌＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇꎬＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＳｏｕｔｈＣｈｉｎａꎬＨｅｎｇｙａｎｇꎬＨｕｎａｎ４２１００１ꎬＣｈｉｎａ)Ａｂｓｔｒａｃｔ:Ｔｈｅｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｗａｓｕｓｅｄｔｏｅｘｔｒａｃｔａｎｔｉ￣ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒａｎｄｃｅｒｅｂｒｏ￣ｖａｓｃｕｌａｒｄｉｓｅａｓｅｓａｃｔｉｖｅｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔｓｏｆｇｉｎｋｇｏｂｉｌｏｂａａｎｄｇｙｎｏｓｔｅｍｍａｐｅｎｔａｐｈｙｌｌｕｍ.Ｔｈｅａｃ￣ｔｉｖｅｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔｓｏｆｇｉｎｋｇｏｆｌａｖｏｎｏｉｄｓꎬｇｙｎｏｓｔｅｍｍａｆｌａｖｏｎｏｉｄｓꎬａｎｄｇｙｎｏｓｔｅｍｍａｓａｐｏｎｉｎｗｅｒｅ第３２卷第４期罗㊀甜等:超滤法结合大孔吸附树脂法制备复方双中药注射液ｆｕｒｔｈｅｒｐｕｒｉｆｉｅｄｂｙＡＢ￣８ｍａｃｒｏｐｏｒｏｕｓａｄｓｏｒｐｔｉｏｎｒｅｓｉｎ.Ｔｈｅｐｕｒｐｏｓｅｏｆｔｈｅｓｔｕｄｙｗａｓｔｏｐｒｅ￣ｐａｒｅｔｈｅｃｏｍｐｏｕｎｄｇｉｎｋｇｏｇｙｎｏｓｔｅｍｍａｐｅｎｔａｐｈｙｌｌｕｍｄｏｕｂｌｅｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌｃｈｉｎｅｓｅｍｅｄｉｃｉｎｅｔｒｉｍｅｔａｚｉｄｉｎｅｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅｉｎｊｅｃｔｉｏｎａｎｄｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｉｔｓｓｔａｂｉｌｉｔｙ.Ｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｔｈａｔｉｎｔｈｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｏｆｕｌｔｒａｓｏｎｉｃｏｓｃｉｌｌａｔｉｏｎꎬｔｈｅｏｐｔｉｍｕｍｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｆｏｒｔｈｅｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｏｆａｃｔｉｖｅｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔｓｉｎｇｉｎｋｇｏｂｉｌｏｂａａｎｄｇｙｎｏｓｔｅｍｍａｐｅｎｔａｐｈｙｌｌｕｍｗｅｒｅａｓｆｏｌｌｏｗｓ:ｗｉｔｈ８０％ｅｔｈａｎｏｌｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎꎬｔｈｅｒａｔｉｏｏｆｓｏｌｉｄｔｏｌｉｑｕｉｄｗａｓ１ʒ２０ꎬａｎｄｔｈｅｕｌｔｒａｓｏｎｉｃｔｉｍｅｗａｓ１０ｍｉｎ.ＴｈｅｏｐｔｉｍｕｍｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｆｏｒＡＢ￣８ｍａｃｒｏｐｏｒｏｕｓａｄｓｏｒｐｔｉｏｎｒｅｓｉｎｗｅｒｅａｓｆｏｌｌｏｗｓ:Ｔｈｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆｔｏｔａｌｆｌａｖｏｎｏｉｄｓｉｎｔｈｅｓａｍｐｌｅｓｏｌｕｔｉｏｎｗａｓ１.２５２３ｍｇ/ｍＬ~２.５０４７ｍｇ/ｍＬꎬｔｈｅｔｏｔａｌｓａｐｏｎｉｎｗａｓ０.４２９４ｍｇ/ｍＬ~１.２８８３ｍｇ/ｍＬꎬｔｈｅｅｌｕ￣ｅｎｔｓｏｌｕｔｉｏｎｗａｓ７０％ｅｔｈａｎｏｌ.Ｔｈｅｐｕｒｉｔｙｏｆｔｏｔａｌｆｌａｖｏｎｏｉｄｓａｎｄｔｏｔａｌｓａｐｏｎｉｎｓｆｒｏｍｐｕｒｉｆｉ￣ｃａｔｉｏｎｗｅｒｅ３７.３５％ꎬ１２.７５％ꎬａｎｄｔｈｅｒａｔｉｏｏｆｆｌａｖｏｎｏｉｄｓａｎｄｓａｐｏｎｉｎｓｗａｓ２.９３.Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｏｆｔｈｅｉｎｊｅｃｔｉｏｎｓｔａｂｉｌｉｔｙｓｈｏｗｓｔｈａｔｔｈｅｃｏｎｔｅｎｔｏｆｔｈｅａｃｔｉｖｅｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔｃｈａｎｇｅｓｗｉｔｈｉｎ５％ｆｏｒ３０ｄａｙｓａｔ－１０ħａｎｄ２５ħ.ｋｅｙｗｏｒｄｓ:ｇｉｎｋｇｏｂｉｌｏｂａꎻｇｙｎｏｓｔｅｍｍａｐｅｎｔａｐｈｙｌｌｕｍꎻｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎꎻＡＢ￣８ｍａｃｒｏｐｏｒｏｕｓａｄ￣ｓｏｒｐｔｉｏｎｒｅｓｉｎꎻｉｎｊｅｃｔｉｏｎ０㊀引㊀言我国目前约有心血管疾病患者２.９亿ꎬ心血管病死亡率居各类疾病死亡率的首位[１].我国心血管药物销售额约占总额的１７％ꎬ研制新的有效的心脑血管药物一直是医药学家研究的热点[２].银杏黄酮类物质具有抗氧化㊁抗动脉粥样硬化㊁促进血液循环等抗心脑血管作用[３￣５].绞股蓝中的有效成分具有降血糖㊁降血脂㊁降血压及双向调节免疫系统的作用[６].银杏叶和绞股蓝两者配伍时对抗心脑血管疾病具有协同的作用.通过绞股蓝对血脂㊁血糖㊁脂质代谢及免疫功能的调节作用弥补单纯银杏叶制剂的不足[７]ꎬ而盐酸曲美他嗪成份ꎬ具有维持心脏和神经感觉器官在缺血和缺氧情况下的能量代谢的作用ꎬ使得心肌梗死和心力衰竭的病理状态得到改善ꎬ降低死亡率[８￣９].目前关于银杏叶和绞股蓝单味中药提取物制剂治疗心脑血管疾病的研究很多[１０￣１１]ꎬ复方双中药银杏绞股蓝注射剂的还未见报道.采用双中药提取㊁纯化ꎬ不仅有效成分的种类和含量明显高于单味中药ꎬ还能减少溶剂用量ꎬ缩短提取时间ꎬ提高提取效率[１２].以传统中医用药银杏绞股蓝配伍为基础[７]ꎬ加入化学药盐酸曲美他嗪ꎬ以期充分发挥中西药联合的协同作用ꎬ制备出副作用少ꎬ作用强的新型抗心血管疾病复方双中药注射液.中药有效成分的提取纯化常用方法包括超临界流体萃取提取法㊁有机溶剂提取法㊁超滤法㊁大孔树脂吸附法等[１３].有研究表明ꎬ天然植物有效成分提取过程中超声辅助提取有助于缩短提取时间ꎬ提高提取效率[１４].本研究借助超声震荡辅助ꎬ采用超滤法初步提取银杏叶和绞股蓝双中药中的抗心血管疾病有效成分ꎬＡＢ￣８大孔吸附树脂法纯化银杏黄酮㊁绞股蓝黄酮㊁绞股蓝皂苷ꎬ将得到的纯化物与化学药盐酸曲美他嗪配伍制备出复方双中药注射液.对超滤法及大孔树脂吸附法的提取㊁纯化条件进行优化ꎬ并对制备的注射液进行稳定性试验.１㊀实验仪器与试剂银杏叶(产地江苏徐州)ꎬ绞股蓝(湖南衡阳国仁堂)ꎬ芸香皂苷(阿拉丁试剂有限公司)ꎬ盐酸曲美他嗪对照品(上海源叶生物科技有限公司)ꎬ人参皂苷Ｒｂ１(阿拉丁试剂有限公司)ꎬ超声波清洗器仪ＧＤ２３０ＨＴＬ(深圳市光点超声波设备有限公司)ꎬ循环水式多用真空泵ＳＨＢ￣ＩＩＩ(郑州长城科工贸有限公司)ꎬ紫外可见分光光度计Ｕ￣３９００(上海棱光技术有限公司)ꎬＡＢ￣８大孔树脂(陕西西安乐博生化科技有限公司)ꎬ超滤膜分离设备为ＬＮＧ￣ＵＦ１８１２￣５０００(上海朗极化工科技有限公司)ꎬ高效液相色谱仪ｅ２６９５(沃特世科技上海有限公司).２㊀实验方法２.１㊀超滤法初步提取银杏绞股蓝中抗心血管疾病有效成分的条件优化称取已粉碎的银杏叶１５ｇ和绞股蓝１０ｇ置于提取容器中ꎬ加入一定量乙醇溶液ꎬ在超滤提取前ꎬ对溶液进行了超声振荡ꎬ其中超声功率６０Ｗ.１９㊀㊀㊀南华大学学报(自然科学版)２０１８年８月采用３因素３水平做正交试验探索最佳实验条件ꎬ因素及水平设计如下所示:乙醇体积浓度６０％㊁７０％㊁８０％ꎬ固液比１ʒ１０㊁１ʒ１５㊁１ʒ２０ꎬ超声时间１０㊁２０㊁３０ｍｉｎ.超声后ꎬ抽滤ꎬ溶液用中空纤维聚氯乙烯(ＰＶＣ)膜进行超滤.参数:超滤温度为３０ħꎬ超滤压力为０.９ＭＰａꎬ得到除去大部分杂质且有效地保留大部分有效成分的超滤液.超滤液经减压浓缩后ꎬ测其中的黄酮㊁皂苷的含量ꎬ得到最佳提取条件.２.２㊀ＡＢ￣８大孔树脂同时纯化黄酮、皂苷采用ＡＢ￣８大孔吸附树脂法来纯化银杏黄酮㊁绞股蓝黄酮㊁绞股蓝皂苷.分别从上样液浓度和洗脱剂浓度两方面来考察ＡＢ￣８大孔树脂纯化条件.２.２.１㊀上样液浓度对吸附效果的影响准确称取７份预处理好的ＡＢ￣８大孔吸附树脂２ｇꎬ分别置于１００ｍＬ具塞锥形瓶中ꎬ各加入３０ｍＬ已制备好的不同浓度的超滤初提物上样溶液ꎬ其中黄酮质量浓度为:３.７５７０㊁３.１３０８㊁２.５０４７㊁２.２５４２㊁１.８７８５㊁１.２５２３㊁０.６２６２ｍｇ/ｍＬꎻ对应的皂苷质量浓度为:１.２８８３㊁１.０７３６㊁０.８５８９㊁０.７７３０㊁０.６４４２㊁０.４２９４㊁０.２１４７ｍｇ/ｍＬ于室温在摇床振荡３ｈꎬ达到吸附平衡后ꎬ分别取上层滤过液１.０ｍＬ于２５ｍＬ容量瓶和１０ｍＬ比色管中ꎬ检测溶液中黄酮和皂苷的含量.２.２.２㊀洗脱剂浓度对纯化效果的影响准确量取已制备好的上样液５份(４５０ｍＬ/份)ꎬ分别以１ＢＶ/ｈ的流速上样ꎬ上样完后静置３ｈꎬ待ＡＢ￣８树脂吸附完全.用蒸馏水冲洗至流出液无色ꎬ以除去水溶性极性杂质如多糖和无机盐ꎬ再分别用体积分数为１０％㊁３０％㊁５０％㊁７０％㊁９０％的乙醇以１ＢＶ/ｈ的流速进行洗脱ꎬ至解吸液无色ꎬ收集解吸液体积为５ＢＶꎬ分别吸取１.０ｍＬ解吸液于２５ｍＬ容量瓶和１０ｍＬ比色管中测定吸光度值ꎬ计算解吸液中总黄酮㊁总皂苷的浓度.并将解吸液进行浓缩干燥ꎬ得到纯化物.准确称取适量纯化物ꎬ溶解定容后ꎬ测定其吸光度值ꎬ计算纯化物中总黄酮㊁总皂苷的含量.２.３㊀复方双中药银杏绞股蓝曲美他嗪注射剂的制备和稳定性考察精密称取双中药精制品１.３３９ｇ(折合黄酮０.５ｇ㊁皂苷０.１７０６ｇ)于干净烧杯中ꎬ加入精密量取的丙二醇４０ｍＬ㊁乙醇６０ｍＬ及二次蒸馏水３５０ｍＬꎬ加热搅拌３０ｍｉｎꎬ冷却ꎻ另取盐酸曲美他嗪０.２０ｇꎬ加入二次蒸馏水溶解后ꎬ倒入上述冷却后的溶液中ꎬ搅拌ꎬ加１.０ｇ亚硫酸氢钠ꎬ补全注射用水至５００ｍＬꎬ搅拌均匀.用０.２２μｍ的滤膜过滤ꎬ灌装融封至５ｍＬ的安瓿瓶中ꎬ高温高压灭菌.将上述制备好的注射液ꎬ分别放置于－１０ħ㊁常温㊁高温６０ħ条件下ꎬ放置３０ｄꎬ分别在０㊁１㊁５㊁１０㊁３０ｄ取样ꎬ对注射剂的外观㊁可见微粒㊁总黄酮含量㊁总皂苷含量及盐酸曲美他嗪的含量进行考察.２.４㊀抗心血管疾病主成份含量测定２.４.１㊀黄酮的含量测定精密称取芦丁对照品５.０ｍｇꎬ用体积浓度为３０％的乙醇定溶于５０ｍＬ容量瓶中ꎬ配置成质量浓度为０.１ｍｇ/ｍＬ的芦丁标准液.精密吸取０.１ｍｇ/ｍＬ的芦丁标准液０㊁１㊁２㊁４㊁５㊁６㊁８ｍＬ分别置于２５ｍＬ容量瓶中各加入体积浓度为３０％乙醇至１０ｍＬꎻ加入质量浓度５％亚硝酸钠水溶液５ｍＬꎬ摇匀后静置７ｍｉｎꎻ加入质量浓度１０％硝酸铝水溶液０.８ｍＬꎬ摇匀后静置６ｍｉｎꎻ加入质量浓度４％氢氧化钠水溶液６ｍＬꎬ摇匀ꎬ用体积浓度３０％乙醇定容ꎬ静置１０ｍｉｎꎬ以试剂空白作对比ꎬ在５００ｎｍ波长测吸光度ꎬ以芦丁质量浓度Ｃ(ｍｇ/ｍＬ)为横坐标ꎬ吸光度值Ａ为纵坐标绘制芦丁标准曲线.线性回归方程为:Ａ＝０.００２８３＋１５.８１７５ＣꎬＲ２＝０.９９９５２.４.２㊀皂苷的含量测定准确称取人参皂苷标准品Ｒｂ１适量ꎬ加入甲醇溶解ꎬ配制为１ｍｇ/ｍＬ的标准溶液.精密吸取１００㊁２００㊁４００㊁５００㊁６００㊁８００μＬ的标准溶液ꎬ置于１０ｍＬ具塞试管中ꎬ用热风吹干.加入质量浓度５％的香草醛冰醋酸溶液０.２ｍＬ和高氯酸０.８ｍＬꎬ在６０ħ的水浴中保温１５ｍｉｎꎬ流水冷却后用冰醋酸定容至１０ｍＬꎬ摇匀ꎬ在５５０ｎｍ波长处对吸光度进行测定ꎬ以人参皂苷质量浓度Ｃ(ｍｇ/ｍＬ)为横坐标ꎬ吸光度值Ａ为纵坐标ꎬ绘出人参皂苷标准曲线.线性回归方程为:Ａ＝０.０１８６７＋１２.１２３ＣꎬＲ２＝０.９９９１２.４.３㊀盐酸曲美他嗪的含量测定色谱条件:色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂ꎻ流动相Ａ为０.２８７％的无水庚烷磺酸钠溶液－甲醇(６４３ʒ３５７)ꎬ用１０％磷酸调节ｐＨ值至３.０ꎻ流动相Ｂ为甲醇ꎬ检测波长为２４０ｎｍ.曲美他嗪峰的保留时间约为３７ｍｉｎ.进样体积１０μＬꎬ温度３０ħ.精密称取盐酸曲美他嗪对照品４９.６８ｍｇ(约５０ｍｇ)置５０ｍＬ量瓶中ꎬ加水溶解并稀释至刻度ꎬ摇匀.分别精取２㊁４㊁５㊁６㊁７ｍＬ置２５ｍＬ量２９第３２卷第４期罗㊀甜等:超滤法结合大孔吸附树脂法制备复方双中药注射液瓶中ꎬ加水稀释至刻度ꎬ摇匀ꎬ依法测定.以浓度(ｕｇ/ｍＬ)为横坐标ꎬ峰面积为纵坐标ꎬ绘制标准曲线图.线性回归方程为:Ｙ＝１.１８５７ｘ＋０.１７８６ꎻＲ２＝０.９９９９.３㊀实验结果与讨论３.１㊀正交实验探索提取银杏绞股蓝中有效成分的考察结果正交实验结果列于表１所示.正交实验初步探索提取银杏绞股蓝中抗心血管疾病有效成分实验结果显示:影响总黄酮提取效果的因素关系为:Ｂ>Ａ>Ｃꎬ总黄酮的最佳提取条件为Ａ３Ｂ３Ｃ１ꎻ影响总皂苷提取效果的因素关系为:Ａ>Ｂ>Ｃꎬ总皂苷的最佳提取条件为Ａ３Ｂ２Ｃ２.综合考虑固液比对总黄酮提取效果的影响较总皂苷更显著ꎬ因此取Ｂ３ꎻ超声时间对总黄酮和总皂苷的提取率的影响均不显著ꎬ且比较Ｃ１和Ｃ２的Ｋ值ꎬ相差甚微ꎬ考虑经济效益和缩短生产周期角度来看最佳超声时间为Ｃ１.则最佳提取条件为Ａ３Ｂ３Ｃ１ꎬ即乙醇体积浓度８０％ꎬ固液比１ʒ２０ꎬ超声时间１０ｍｉｎ.按上述最佳提取条件ꎬ进行３组平行实验ꎬ得到的提取液中总黄酮的平均质量浓度为１.５０２８ｍｇ/ｍＬꎬ总皂苷的平均质量浓度为０.５１４２ｍｇ/ｍＬ.表１㊀正交实验结果Ｔａｂｌｅ１㊀Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｏｆｏｒｔｈｏｇｏｎａｌｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ实验序号Ａ乙醇浓度/％Ｂ固液比Ｃ时间/ｍｉｎ黄酮浓度/(ｍｇ ｍＬ－１)皂苷浓度/(ｍｇ ｍＬ－１)１(１)６０(１)１ʒ１０(１)１０(１)０.７３３６０.２９３９２(１)７０(２)１ʒ１５(２)２０(２)０.９５９６０.４１９３３(１)８０(３)１ʒ２０(３)３０(３)１.３６４３０.５１０９４(２)６０(１)１ʒ１５(２)３０(３)１.０３２４０.４３９１５(２)７０(２)１ʒ２０(３)１０(１)１.４３３８０.４３５８６(２)８０(３)１ʒ１０(１)２０(２)０.８９３９０.５０７６７(３)６０(１)１ʒ２０(３)２０(２)０.８９９６０.３７５６８(３)７０(２)１ʒ１０(１)３０(３)０.８１１８０.２８６５９(３)８０(３)１ʒ１５(２)１０(１)１.４７１７０.５２１６总黄酮Ｋ１２.６６５６２.４３９３３.６３９１Ｋ２３.２０５２３.４６３７２.７５３１Ｋ３３.７２９９３.６９７７３.２０８５Ｒ１.０６４３１.２５８４０.８８６０总皂苷Ｋ１１.１０８６１.０８８０１.２５１３Ｋ２１.１４１６１.３８００１.３０２５Ｋ３１.５４０１１.３２２３１.２３６５Ｒ０.４３１５０.２９２００.０６６０３.２㊀ＡＢ￣８大孔树脂分离纯化黄酮、皂苷考察结果３.２.１㊀上样液浓度对吸附效果的影响上样液中总黄酮的初始浓度对吸附率及吸附量的影响如图１所示.ＡＢ￣８大孔树脂对黄酮吸附率随着浓度的增加先上升后下降ꎬ而吸附量是一直呈上升趋势.说明上样液浓度过高时ＡＢ￣８大孔树脂树脂对黄酮成分的吸附达饱和ꎬ造成上样液中有效成分浪费.因此上样浓度不宜太高ꎬ综合考虑吸附量和吸附率ꎬ选择总黄酮浓度在１.２５２３~２.５０４７ｍｇ/ｍＬ范围内上样ꎬ吸附率均能达到７０％以上.上样液中总皂苷的初始浓度对吸附率及吸附量的影响如图２所示.ＡＢ￣８大孔树脂对皂苷的吸附率随着浓度的增加先上升后下降ꎬ而吸附量是一直呈上升的趋势的.说明上样液浓度过高时ＡＢ￣８大孔树脂对皂苷成分的吸附达饱和ꎬ造成上样液中的有效成分浪费.因此上样浓度不宜太高ꎬ综合考虑吸附量和吸附率选择总皂苷浓度在０.４２９４~１.２８８３ｍｇ/ｍＬ范围内上样ꎬ吸附率均能达到７０％以上.３.２.２㊀洗脱剂浓度对纯化效果的影响乙醇浓度对解吸㊁纯化效果的影响如图３和图４所示.３９㊀㊀㊀南华大学学报(自然科学版)２０１８年８月图１㊀上样液中总黄酮的初始浓度对吸附率及吸附量的影响Ｆｉｇ.１㊀Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｏｆｉｎｉｔｉａｌｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆｔｏｔａｌｆｌａｖｏｎｏｉｄｓｏｎａｄｓｏｒｐｔｉｏｎｒａｔｅａｎｄａｄｓｏｒｐｔｉｏｎｃａｐａｃｉｔｙ图２㊀上样液中总皂苷的初始浓度对吸附率及吸附量的影响Ｆｉｇ.２㊀Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｏｆｉｎｉｔｉａｌｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆｔｏｔａｌｓａｐｏｎｉｎｓｏｎａｄｓｏｒｐｔｉｏｎｒａｔｅａｎｄａｄｓｏｒｐｔｉｏｎｃａｐａｃｉｔｙ图３㊀乙醇浓度对解吸效果的影响Ｆｉｇ.３㊀Ｅｆｆｅｃｔｏｆｅｔｈａｎｏｌｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｎｔｈｅｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ图４㊀乙醇浓度对纯化效果的影响Ｆｉｇ.４㊀Ｅｆｆｅｃｔｏｆｅｔｈａｎｏｌｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｎｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ㊀㊀由图３结果显示随着乙醇浓度的增大ꎬ解吸液中总黄酮及总皂苷的浓度也逐渐增大ꎬ但是图４结果显示纯化物中总黄酮及总皂苷的含量是先上升后下降.说明９０％的乙醇会解吸出更多的杂质ꎬ如色素㊁糖类㊁生物碱等ꎬ使纯化产物中总黄酮及总皂苷的纯度降低.综合考虑黄酮㊁皂苷的解吸率及纯化物中黄酮㊁皂苷的纯度ꎬ选择体积浓度７０％的乙醇作为解吸洗脱.此外由图３和图４可知体积浓度１０％的乙醇洗脱液中基本不含黄酮及皂苷成分ꎬ可选择体积浓度１０％的乙醇作为解吸前的除杂洗脱.３.２.３㊀纯化前后总黄酮㊁总皂苷含量对比纯化前后总黄酮㊁总皂苷的含量对比如图５所示.图５㊀纯化前后总黄酮、总皂苷的含量对比Ｆｉｇ.５㊀Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆｔｏｔａｌｆｌａｖｏｎｏｉｄｓａｎｄｔｏｔａｌｓａｐｏｎｉｎｓｂｅｆｏｒｅａｎｄａｆｔｅｒｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ将最佳提取条件得到的超滤提取液㊁最佳吸附洗脱条件得到的解吸液分别进行旋蒸浓缩㊁干４９第３２卷第４期罗㊀甜等:超滤法结合大孔吸附树脂法制备复方双中药注射液燥ꎬ得到双中药提取物粗品及双中药提取物精制品.精密称取等量的上述两种样品ꎬ溶解定容后ꎬ测定总黄酮㊁总皂苷的浓度ꎬ计算含量ꎬ并进行比较.结果如图５所示中双中药提取物粗品中总黄酮含量为９.１２％ꎬ总皂苷含量为３.０８％ꎬ经ＡＢ￣８大孔树脂纯化后的双中药提取物精制品中总黄酮含量为３７.３５％ꎬ总皂苷含量为１２.７５％ꎬ纯度较提取物粗品提高了４.１倍.这是由于通过ＰＶＣ超滤膜去除大部分杂质ꎬ再经过旋转蒸发浓缩去除乙醇后上样于大孔树脂柱ꎬ膜分离技术降低了杂质堵塞树脂空隙的可能性ꎬ使纯化效果明显提高.３.３㊀复方双中药银杏绞股蓝曲美他嗪注射剂稳定性考察结果注射液稳定性试验结果列于表２所示.表２㊀注射液稳定性试验结果Ｔａｂｌｅ２㊀Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｏｆｉｎｊｅｃｔｉｏｎｓｔａｂｉｌｉｔｙｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ条件时间/ｄ外观性状总黄酮含量/(ｍｇ ｍＬ－１)总皂苷含量/(ｍｇ ｍＬ－１)曲美他嗪含量/(ｍｇ ｍＬ－１)－１０ħ０淡黄色澄清透明液体１.０００７０.３４０９０.４０１４１淡黄色澄清透明液体０.９９７６０.３３６８０.４００４５淡黄色澄清透明液体０.９７８６０.３４０１０.３９６３１０淡黄色澄清透明液体０.９８１８０.３３８５０.３９８２３０淡黄色澄清透明液体０.９７３８０.３２８６０.３８９２常温０淡黄色澄清透明液体１.０００７０.３４０９０.４０１４１淡黄色澄清透明液体０.９９９２０.３４１７０.４０２１５淡黄色澄清透明液体０.９９７６０.３３９３０.４０１７１０淡黄色澄清透明液体０.９９１３０.３３６００.４０１５３０淡黄色澄清透明液体０.９８８１０.３３０２０.３９８７６０ħ０淡黄色澄清透明液体１.０００７０.３４０９０.４０１４１淡黄色澄清透明液体０.９９１３０.３２６９０.４０２９５淡黄色澄清透明液体０.９０４３０.３１７９０.３７８４１０黄色澄清透明液体０.８４４３０.２８８２０.３６８６３０黄色澄清透明液体０.７４９４０.２５１００.３６１３㊀㊀稳定性考察结果为:－１０ħ条件下３０ｄ内注射液外观性状没有明显变化ꎬ为淡黄色澄明液体ꎬ有效成分含量变化在５％以内ꎬ基本稳定.常温条件下３０ｄ内注射液外观性状没有明显变化ꎬ为淡黄色澄明液体ꎬ有效成分含量变化在５％以内ꎬ基本稳定.６０ħ条件下３０ｄ内注射液颜色逐渐加深但没有出现混浊ꎬ有效成分含量变化为:５ｄ后含量下降较为明显ꎬ３０ｄ后为起始量的７４％.因此本品在６０ħ条件下不稳定ꎬ应避免高温放置.在－１０ħ和２５ħ条件下有效成分含量变化在５％以内ꎬ符合«２０１５版中国药典稳定性指导原则».４㊀结㊀论本文应用超滤法对银杏叶和绞股蓝中的有效成分进行粗提ꎬ再通过大孔树脂吸附法同时纯化总黄酮和总皂苷.经超滤膜粗提和大孔树脂吸附分离纯化黄酮与皂苷ꎬ简化提取分离工艺ꎬ使制备含银杏黄酮㊁绞股蓝黄酮㊁绞股蓝皂苷的原料药的过程更为简便.应用上述纯化后得到原料药制备复方银杏绞股蓝盐酸曲美他嗪注射液ꎬ探讨其处方组成及制备方法并进行稳定性实验.结果表明:１)正交试验探索提取银杏叶和绞股蓝有效成分的最佳条件为:乙醇体积浓度８０％ꎬ固液比１ʒ２０ꎬ超声时间１０ｍｉｎꎻ２)ＡＢ￣８大孔吸附树脂纯化银杏黄酮㊁绞股蓝黄酮㊁绞股蓝皂苷的最佳条件为:上样液中黄酮质量浓度为１.２５２３~２.５０４７ｍｇ/ｍＬꎬ皂苷质量浓度为０.４２９４~１.２８８３ｍｇ/ｍＬ.体积浓度１０％的乙醇作为解吸前５９㊀㊀㊀南华大学学报(自然科学版)２０１８年８月的除杂洗脱ꎬ７０％的乙醇作为洗脱剂ꎬＡＢ￣８大孔树脂纯化后得到的原料药总黄酮总皂苷的平均质量分数分别为３７.３５％㊁１２.７５％ꎬ黄酮与皂苷的比值为２.９３ꎻ３)注射剂稳定性考察结果显示本品应避免高温６０ħ放置ꎬ在－１０ħ和２５ħ条件下有效成分的含量变化在５％以内ꎬ符合«２０１５版中国药典稳定性指导原则».参考文献:[１]陈伟伟ꎬ高润霖ꎬ刘力生ꎬ等.«中国心血管病报告２０１７»概要[Ｊ].中国循环杂志ꎬ２０１８ꎬ３３(１):１￣８. 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