肺癌干细胞标志物

肺癌干细胞的分选
肺癌干细胞的分选主要采用两种方法：一种是应用细胞表面特异性标记进行 分选，另一种是根据SP表型进行肿瘤干细胞的分选。Kim等[9] [10]应用流式 细胞仪分选支气管肺泡干细胞，首先准备新鲜的肺单个细胞，然后用细胞裂 解液去除红细胞，CD45+ 细胞代表造血干细胞，Pecam+ 细胞代表内皮细胞， 去除这两类细胞，选Sca-1+ 细胞，去除CD34- 的细胞群，得到Sca1+/CD45- /Pecam- /CD34+的支气管干细胞群。细胞表面标志物是分选肺癌 肿瘤干细胞的关键，腺癌肿瘤干细胞亦存在与BASCs相似的表面标志物，如 CD34+ 等。如董强刚等即是采用FACS对A549和SPC-A肺腺癌细胞株进行了 TSC的研究[11]。结果在A549和SPC-A肺腺癌细胞株中发现一个新颖的癌细 胞亚群，其表型特征为CD24 IGF—IR ，具有高侵袭性和高致瘤性并具有自 CD24 主生长特性，能够在无血清条件下长期培养，认为其是肺腺癌干细胞。人们 发现造血干细胞具有将荧光染料泵出细胞外的特性，即SP特性[12]。目前利 用这一特性进行纯化成为一种常用的分离方法。Maria等[13]应用FACS和 DNA染料Hoechst33342，从肺癌细胞系(H460，H23，HTB-58，A549， H441，H2170)中分离出占细胞总数1/1000-1/5000的SP细胞，体外培养可形 成新的SP和non-SP细胞群，将H441、H460、A549的SP接种NOD /SCID小 鼠，可观察到其SP的成瘤能力分别是non-SP的10倍、15倍和50倍。研究结 果还表明：(1)所有6种肺癌细胞系中SP的ABCG2均明显增高;(2)SP比non-SP 具有更强的多药耐药性;(3)SP细胞均处于细胞周期的静止期(G0);(4)SP中端粒 末端转移酶水平显著高于non-SP。以上结果表明，SP细胞群中富含肿瘤干细 胞。但目前尚未明确分离出肿瘤干细胞，此方面还需进一步研究。
肺癌干细胞的发现
2005年，Kim等[9]采用荧光激活细胞分选(FACS)从支气 管和肺泡导管交界处分离出一群细胞表面标志为Sca-1+ CD45- Pecam- CD34+ 的细胞，并命名为支气管肺泡干 细胞((bronchioalveolar-stem cells，BASCs)。BASCs 表 现出明显的自我更新特性，能够分化成其他类型肺上皮细 胞。研究发现，BASCs 在支气管、肺泡损伤和上皮细胞 体内修复更新时发挥作用，当体内支气管和肺泡损伤时发 生增殖;BASCS能够分化为终末细支气管上皮细胞(Clara 细胞)、I型肺泡上皮细胞(AT I细胞)和Ⅱ型肺泡上皮细胞 (ATⅡ细胞)，表明其具有自我更新和多向分化潜能，故认 为鼠肺末梢支气管癌的发生和BASCs有关这个结果为人肺 癌干细胞的研究提供了一个重要依据。
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干细胞 (stem cells) 是一类未分化的原始细胞，具有多潜 能分化及自我更新两个主要生物学特性。肿瘤干细胞与干 细胞相比具有很多相似点：(1) 均具有自我更新和分裂增 殖能力[6];(2) 存在相似的生长调控机制，如Notch 、Wnt 和Bmi21等信号通路[7];(3) 均具有端粒酶活性，干细胞和 大多数恶性肿瘤细胞中都有很高的端粒酶活性以及扩增的 端粒重复序列[8];(4) 具有类似的细胞表面标志物，如 CD133，ABCG2等;(5) 干细胞具有迁移的特性，而肿瘤 干细胞则具有转移的能力。因此，肿瘤干细胞与干细胞的 诸多相似之处使得寻找肿瘤干细胞特异性细胞群成为现在 研究热点，而其研究的难点在于肿瘤干细胞特异性细胞表 面标志物的鉴定。
• 1998年 Doyle[25]首次从耐药的乳腺癌细胞中分离出来一 种乳腺癌耐药蛋白(BCRP) -ATP 结合转运蛋白G超家族成 员2(ABCG2)，属于ABC 转运蛋白家族成员之一。目前已 发现部分肿瘤干细胞的标志中包含ABCG2/ Bcrp1，并且 有些研究直接运用ABCG2/Bcrp1作为干细胞或肿瘤干细 胞的标志物来分离或鉴定干细胞或肿瘤干细胞[26][27][28]。 张宇飞等[29]研究发现ABCG2阳性表达与肺癌的侵袭有密 切关系，同时ABCG2 表达与非小细胞肺癌分化程度也相 关，推测ABCG2 与较高的恶性生物学行为也有关。也有 报道[30]显示，在肺腺癌和鳞癌组织原发灶及转移灶中大 部分细胞ABCG2/ Bcrp1表达阳性，而在肺大细胞癌和小 细胞癌中不表达，不符合肿瘤干细胞在癌组织中均有表达 的特性，因而ABCG2/ Bcrp1单独不适合作为肺癌干D133也被称为prominin-1，是细胞表面蛋白超家族中的一员，具有独特的 结构：一个细胞外区的N-端，5个跨膜区域，有两个大的细胞外loop环，一个 59个氨基酸的细胞内尾，8个N-糖基化区[14] 。CD133 首先在乳腺癌、脑胶 质瘤、肝癌、结肠癌、前列腺癌等多种实体瘤中被发现[15][16]。Hible等[17] 在非小细胞肺癌内皮祖细胞中发现CD133分子表达，肿瘤中的内皮祖细胞可 能来源于肺癌的肿瘤干细胞。曹宝山等[18]应用荧光激活细胞分选方法检测和 分选肺癌细胞株A549和H460中的SP和非SP细胞，并检测出SP细胞中 CD133的表达，明确了CD133作为肺癌干细胞分子标志的可行性。而钱莘等 CD133 CD133 [19]却发现肺腺癌组织中存在CD133+细胞和CCA+ SP-C+ 双阳性细胞，且其 都具备干细胞特性;还发现CD133是一种在肺组织中广泛表达的蛋白，在癌组 织或正常肺组织中无显著性差异。与此同时，Meng X等[20]研究结果显示， A549和H446癌细胞中CD133+和CD133+具有相似的形成癌细胞菌落能力， 还有自我更新、增值、分化、侵袭和耐药性的能力。因此，CD133不能单独 作为鉴定肺癌干细胞的表面标志物，但能够联合其它表面标志物的作用进行 筛选，以提高诊断分选的精确度与特异性。
其它常见的肺癌干细胞标志物有CD34和CD44抗 原。CD34 主要表达于多功能造血干细胞、定向 祖细胞以及血管内皮细胞。CD44抗原是一条糖基 化的跨膜多肽链，接受细胞外基质糖基化、透明 质酸化信息的受体。Liu D等[31]应用双参数分析 法研究正常肺组织和肺癌组织中CD44和CD34的 表达，认为CD34和CD44为肺癌幼稚细胞的分子 标志物。亦有文献报道称，CD34和CD44 表达于 肺癌细胞表面，与肿瘤的发生、发展、复发和转 移关系密切，提示其可能的肺癌干细胞源性。
肺癌干细胞标志物的研究进展
创新医学网医学编辑部
概要
• 目前全球范围内新发肺癌患者每年已经超过100 万例[1]。在中国其死亡率也居恶性肿瘤死亡率之 首。据国家卫生部全国肿瘤防治研究办公室统计， 2000～2005 年，中国肺癌的发病患者数约增加 了12万，预计未来中国很可能成为世界肺癌第一 大国，其将成为对我国人民健康危害最严重的肿 瘤。然而到目前为止，肺癌仍然无法根治。但肿 瘤干细胞学说的创立与研究使肺癌的根治成为了 可能，现就目前肺癌干细胞标志物的研究进展作 一系统性总结。
肿瘤干细胞
肿瘤干细胞学说已不再是一个新的概念，早在150 年前就 有病理学家(如Cohnheim，Durante) 提出肿瘤可能起源于 少数组织干细胞[2]。肿瘤干细胞学说表明肿瘤中存在一小 部分具有干细胞性质的细胞群体，即肿瘤干细胞[3]。 1994年， John Dick实验室在急性髓系白血病(AML)患者 外周血中发现CD34+CD38- 的细胞具有无限增殖能力[4]， 将这些细胞移植到SCID裸鼠体内产生的细胞与病人最初 的白血病细胞形态相同，从而证实了AML 干细胞的存在。 这是人类首次识别并分离的肿瘤干细胞株。随后，Singh [[i]]在包括成神经管细胞瘤、星形细胞瘤、室管膜细胞瘤、 神经节、神经胶质瘤在内的一系列脑部肿瘤组织中分选出 一群CD133+的肿瘤干细胞。后来，在肝肿瘤、前列腺癌 等肿瘤中也陆续发现了肿瘤干细胞。
CD147分子是肿瘤细胞表面的基质金属蛋白酶(MMPs)的一种诱导剂， 属于免疫超家族成员，广泛分布于人体、家禽和啮齿动物的造血组织， 在癌组织中呈高表达[21]。MMPs是一组结构和功能相关的锌离子依 赖性内肽酶，CD147能够通过刺激其分泌诱导肿瘤的浸润及血管发生， 在肿瘤转移的降解步骤中发挥重要促进作用。Leinonen T等[22]应用 免疫组化染色方法检测肺癌组织中MMP-2和CD147的表达，发现其 在肺癌细胞和细胞间质中均为高表达，CD147的表达与MMP-2的表 达呈正相关，而且CD147的表达与切除肿瘤患者的复发率成正相关， 与患者的存活率成负相关。张惠忠等[23]研究也发现，在非小细胞肺 [23] 癌组织中CD133与CD147均高表达，而且两者之间的表达呈正相关性， 提示CD133和CD147在肿瘤的发生、发展中有某种协同机制。李波等 [24]采用免疫组织化学和RT-PCR方法对NSCLC中CD147的表达进行 了分析，结果显示CD147在肺鳞癌和腺癌中均高表达，且CD47的表 达强度与T N M分期、有无淋巴结转移等有关，证实CD147与非小细 胞肺癌的侵袭、转移密切相关，其可以作为评价非小细胞肺癌恶性程 度的重要指标。