菌种扩大培养
发酵工程第五章
发酵工程
3.一级种子培养 培养基：水解糖2.5%，尿素0.5%，玉米 浆 2.5%，K2HPO4 0.1%, ph7.0
培养条件：在种子罐中培养, 32℃培养7-10个小时
培养基的特点：长菌体，更接近于发酵培养基
发酵工程
最终发酵 培养基成分：水解糖2.5%；尿素0.5%，玉米
对于不产芽孢和孢子的微生物，实验室阶 段的种子扩培最终是获得一定数量和质量的菌 体。
如： 谷氨酸的种子培养。
发酵工程
b.对于产孢子的微生物 获得一定数量和质量的孢子 在固体培养基上产生大量孢子
获得一定数量和质量的菌丝体 在液体培养基中生产大量菌丝
发酵工程
2.2培养基选择的原则
培养基的选择应该是有利于菌体的生长，对 孢子培养基应该是有利于孢子的生长。
发酵工程
根据文献记载，多数微生物，如病毒、 细菌、放线菌、酵母菌、丝状真菌等 都能冻干保藏。许多菌种用此法可保 藏10年以上。
发酵工程
5. 液氮超低温保藏法
几乎所有微生物及动物细胞等均可采用液 氮超低温保藏。只有少量对低温损伤敏感 的微生物例外。
发酵工程
液氮超低温保藏过程是将菌种悬浮液封存 于圆底安瓿管或塑料的液氮保藏管(材料应 能耐受较大温差骤然变化)内，放到-150～ -196℃的液氮罐或液氮冰箱内保藏。操作 过程中一大原则是“慢冻快融”。
发酵工程
为了减轻冷冻损伤程度，可采用保护剂。 如甘油和二甲亚砜。
发酵工程
注意：
液氮冷冻保藏管应严格密封。若有液氮渗 入管内，在从液氮容器中取出时，管中液 氮的体积将膨胀680倍，具很强的爆炸力， 必须特别小心。
第三章发酵工程与食品产业第四节 菌种的活化与扩大培养
2. 种子罐级数的确定
依据: 依据 菌种的性质和菌体生长速度及发酵设备的合理应用 种子制备目的: 形成一定数量和质量的菌体。 种子制备目的 形成一定数量和质量的菌体。 发酵的目的: 发酵的目的 获得大量的发酵产物 并达到一定生长阶段后形成的， 产物是在菌体大量形成 并达到一定生长阶段后形成的， 需要在大型发酵罐内才能进行。 需要在大型发酵罐内才能进行。同时若干发酵产物的产生 菌其不同生长阶段对营养和培养条件的要求有差异。因此， 菌其不同生长阶段对营养和培养条件的要求有差异。因此，将 两个目的不同、 两个目的不同、工艺要求有差异的生物学过程放在一个大罐 内进行，既影响发酵产物的产量，又会造成动力和设备的浪费。 内进行，既影响发酵产物的产量，又会造成动力和设备的浪费。
2.2 生产车间种子制备
1.种子罐种子制备 种子罐种子制备 种子罐种子制备的工艺过程，因菌种不同而异，一般 种子罐种子制备的工艺过程，因菌种不同而异， 可分为一级种子、二级种子和三级种子的制备。 可分为一级种子、二级种子和三级种子的制备。 1) 孢子 或摇瓶菌丝)被接入到体积较小的种子罐中，经培 孢子(或摇瓶菌丝 被接入到体积较小的种子罐中 或摇瓶菌丝 被接入到体积较小的种子罐中， 养后形成大量的菌丝，这样的种子称为一级种子. 养后形成大量的菌丝，这样的种子称为一级种子 把一级种子转入发酵罐内发酵，称为二级发酵。 把一级种子转入发酵罐内发酵，称为二级发酵。 2) 如果将一级种子接入体积较大的种子罐内，经过培养形 如果将一级种子接入体积较大的种子罐内， 成更多的菌丝，这样制备的种子称为二级种子. 成更多的菌丝，这样制备的种子称为二级种子 将二级种子转入发酵罐内发酵，称为三级发酵。 将二级种子转入发酵罐内发酵，称为三级发酵。 同样道理，使用三级种子的发酵，称为四级发酵。 同样道理，使用三级种子的发酵，称为四级发酵。
发酵工程(2)第二章 工业微生物菌种的选育与扩大培养
华根霉 ( Rhizopus chinentis )
酿酒所必须的重要霉菌，也是 酸性蛋白酶和腐乳生产中的重要菌 种。
2、毛霉 ( Mucor )
鲁氏毛霉 ( Mucor rouxianus ) 能糖化淀粉且能生成少量酒精；能产生
6、醋酸菌 (Acetobacter)
➢ 不形成芽孢，G－，好气性 ➢ 可生产醋酸.
7、棒状杆菌 (Corynebacterium) ➢ 是谷氨酸和其他氨基酸的高产菌.
8、短杆菌 (Brevibacterium)
氨基酸、核苷酸工业生产中常用的菌种，也是酶法 合成生产辅酶A的菌种.
9、黄单胞菌 (Xanthomonas)
5、假丝酵母 (Candida)
➢能形成假丝，液体培养时能 形成浮膜。 ➢可生产SCP、甘油、脂肪酶。
6、红酵母 (Rhodotorula)
➢有明显的红色或黄色色 素，很多种因生荚膜而形 成粘质状菌落。 ➢可由菌体提取大量脂肪、 -胡萝卜素。
7、棉病针孢酵母 ( Nematspora gossypii )
2、葡萄汁酵母 (Saccharomyces uvarum)
与酿酒酵母相似，主要的区别在于葡萄汁酵母能发酵 棉子糖和蜜二糖。
3、汉逊酵母 (Hansenula)
此属酵母多能产生乙酸乙酯，从而增加产品的香 味，可用于酿酒和食品工业。
4、球拟酵母 (Toruiopsis)
此属酵母有些种能产生不同比例的甘油、赤藓 糖、阿拉伯糖；有的能利用烃类生产蛋白质。
复筛 不纯 第四次平板分离
第三次菌种保藏
第四次原种斜面
初步工艺条件摸索
再复筛
酵母菌扩大培养方法
酵母菌扩大培养方法一、酵母菌扩大培养的重要性。
1.1 酵母菌在很多领域都非常重要啊。
像做面包的时候，没有酵母菌，那面包就不会蓬松柔软，就像一块硬邦邦的石头，简直是“味同嚼蜡”。
酿酒的时候呢，酵母菌更是关键角色，没有它，哪来的美酒飘香啊。
所以，为了满足生产或者实验等需求，我们就得进行酵母菌的扩大培养。
1.2 扩大培养就好比是给酵母菌“扩充队伍”。
原本少量的酵母菌，经过扩大培养，数量增多了，就能更好地发挥它们的作用。
这就像盖房子，原本只有几个小工，慢慢扩充成一个大的建筑队，这样就能更快更好地把房子盖起来。
二、准备工作。
2.1 首先得有合适的培养基。
培养基就像是酵母菌的“食物”和“住所”。
一般来说，常用的有麦芽汁培养基。
这麦芽汁就像是酵母菌的“美味佳肴”，能让酵母菌茁壮成长。
根据不同的需求，也可以用合成培养基，就像给酵母菌定制的“营养套餐”。
2.2 容器也很关键。
要选择干净、无菌的容器。
这就好比我们住房子，肯定要选择干净整洁的房子一样。
如果容器不干净，有杂菌，那就像家里进了小偷，会影响酵母菌的正常生长。
小量培养的时候，可以用试管或者小锥形瓶；要是大量培养，那就得用大的发酵罐了。
2.3 还有接种的工具，像接种环之类的，也要提前消毒好。
这就像我们做饭前要把厨具洗干净一样，不能让脏东西影响了酵母菌的培养。
三、接种。
3.1 接种的时候要小心谨慎。
从保藏的酵母菌菌种中挑取少量的酵母菌，就像从宝藏中小心翼翼地取出一颗明珠一样。
把这少量的酵母菌接种到准备好的培养基中。
如果是液体培养基，接种的时候要尽量让酵母菌均匀地分布在培养基里，可不能让它们“挤成一团”。
3.2 在接种过程中，要严格遵守无菌操作的原则。
这就像我们在医院做手术一样，必须保证无菌环境。
一旦有杂菌混入，那可就“前功尽弃”了。
酵母菌就可能被杂菌“欺负”，长不好甚至死亡。
四、培养条件。
4.1 温度是个很重要的因素。
不同的酵母菌适合生长的温度不太一样，一般来说，在20 30摄氏度之间比较合适。
6 种子制备及扩大培养
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3+湿度
制备斜面孢子培养基的湿度对孢子的数量和质量 有较大的影响。
相对湿度 （%） 15~19 25~30 40~45 活孢子计数 （亿/支） 1.2 2.3 5.7
斜面外观 上部稀薄、下部稠略黄 上部薄、中部均匀发白 一片白，孢子丰富，稍皱
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3+湿度
例如土霉素生产菌种龟裂链霉菌，孢子制备时发现：
种子制备及扩大培养
一、定 义
将保存的生产菌种接入试管斜面 活化后，在经过扁瓶或摇瓶及种子罐 逐级放大培养过程而获得一定数量和 质量的纯种。
1
（一）种子的要求
性能： 活力旺盛、生理形状稳定； 数量： 能满足大容量发酵罐的要求； 无杂菌污染； 保持稳定的生产能力。
2
（二）种子的制备过程
3
1.实验室阶段
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2.种龄与接种量
种龄需经过多种实验来确定。
嗜碱性芽孢杆菌生产碱性蛋白酶， 12小时最好。
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2.种龄与接种量
大接种量可以缩短发酵罐中菌 丝繁殖的时间，使产物的形成 提前到来，并可减少杂菌的生 长机会。
接种量过大会引起溶氧不足，影响 产物合成；而且会过多移入代谢废 物，也不经济；
过小会延长培养时间，降低发酵罐 的生产率。
(与目的产物的产量有一定关联的)酶活力
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谷氨酸种子制备举例
2， 一级种子培养 目的：大量繁殖活力强的菌体， 培养基组成应以少含糖分，多含有机氮为主，培养 条件从有利于长菌考虑。 (1) 培养基组成 葡萄糖 2.5％ 尿素 0.5％ 硫酸镁 0.04％ 磷酸氢二钾 0.1％ 玉米浆 2.5~3.5％(按质增减) 硫酸亚铁、硫酸锰 各2ppm PH 7.0
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确定种子罐级数需注意的问题
种子扩大培养1.pptx
对接种物的一般要求：
1）应以高产菌株中分离获得的纯系作为出发 菌株。菌株纯度高，性状稳定，不易发生变异。 2）生理活性强。
若以菌体细胞为接种物，应采取正在旺盛生 长的繁殖期细胞，菌体细胞应均匀，同步率高。 以孢子为接种物，应采用易于萌发的孢子。
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为了提高孢子的萌发率，有时需采取一些 特殊措施 如：
过程
孢子的产生条件？
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孢子制备
1.
放线菌孢子的制备
工艺过程
菌 种
母 斜 面
子 斜 面
摇 种发 瓶 子酵 种 罐罐 子
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注意事项
① 限制碳源(约1%)和氮源(不超过0.5%)； ② 培养温度多为28 ℃ ，少数为37 ℃ ，培养时间为5~14天； ③ 采用孢子进罐：工艺简单，批间差异小，便于控制孢子质量；采用菌丝进罐：
近年来，不少厂家以加大种子量及采用丰 富培养基作为获得高产的措施；有的产品采用 两个种子罐接一个发酵罐的双种法。
如卡那霉素生产中采用双种比单种的发酵 单位提高8%，且达到产量高峰的时间提前。
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但如果接种量过大，往往使菌体生长过快、 培养液黏度增加，造成溶氧不足，从而影响产 物的合成。
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过滤常数 比热死速率 比生长速率
发酵工程的流程
空气 空气净化处理
保藏菌种 斜面活化 扩大培养
原料预处理
培养基制备灭菌
种子罐 发酵罐
灭菌
产物分离纯化
成品
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种子扩大培养
现代的发酵工业生产规模越来越大，每只发酵罐 的容积有几十立方米甚至几百立方米，要使小小的微生物在 几十小时的较短时间内，完成如此巨大的发酵转化任务，那 就必须具备数量巨大的微生物细胞才行。
发酵工程种子的扩大培养
孢子培养
母瓶：活化、纯化,使保藏菌种生长,并去处变异株. 所以接种时要稀一点、便于纯化生长到单菌落.
子瓶: 大量繁殖,得到大量孢子. 接种：①从母斜面上点接种,选取生长好的单 菌落 ②接种时密一点,得到大量的孢子.
孢子培养时注意湿度,子斜面使用一般不超过1个月
三、生产车间阶段 1、培养物的选择原则 在生产车间阶段,最终一般都是获得一定数量的菌丝体. 菌丝体比孢子要有利： 缩短发酵时间 有利于获得好的发酵结果
原则：对数生长期末,细胞活力强,菌体浓度相对较大, 但是最终由实验结果定.
6、种子的质量要求：
量：要求达到一定的浓度
质: 形态 生长处于某个阶段、均匀等等 理化指标：C、N、P的含量,pH 酶活等
无污染
本章小节：
了解种子扩培的工艺过程及其中的基本概念 理解种子扩培的目的和要求 掌握控制种子质量的基本方法和手段
培养基的特点：长菌体,更接近于发酵培养基
种子的质量要求：
108-109个/ml 大小均匀,呈单个或八字排列 PH 7.0-7.2时结束,6.8→8→7.0-7.2 活力旺盛
二、青霉素生产的种子制备 制备过程
安培管 → 斜面孢子 → 大米孢子
→ 一级种子 → 二级种子
→ 发酵
一、斜面孢子 培养基：甘油、 葡萄糖、 蛋白胨等 培养条件：25℃、7天, 注意湿度50%左右
目的：种子扩培到一定的量和质,根据菌种的特点最终的 培养物可分为两类：
对于不产孢子和芽胞的微生物 ——获得一定数量和质量的菌体
对于不产芽孢和孢子的微生物,实验室阶段的种子扩培 最终是获得一定数量和质量的菌体,如谷氨酸的种子培 养.
对于产孢子的微生物 ➢ 获得一定数量和质量的孢子
菌种的扩大培养
菌种的扩大培养、污染的检测与判别种子扩大培养是指将保存在砂土管、冷冻干燥管中处休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，再经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级扩大培养,最终获得一定数量和质量的纯种过程。
这些纯种培养物称为种子。
微生物工业自从采用纯种发酵以来，产率有了很大的提高，然而防止杂菌污染的要求也更高了。
人们在与杂菌污染的斗争中，积累总结出很多宝贵的经验。
规范了管理措施，设计了一系列设备(例如密闭式发酵罐，培养基灭菌设备，无菌空气制备设备等)和管道，应用了无菌室甚至无菌车间，建立了无菌操作技术，因而大大降低了发酵染菌率。
但是某些发酵工业还遭受着染菌的威胁，染菌后轻者影响产率、产物提取收得率和产品质量，重者造成“倒罐” ，不但浪费大量原材料，造成严重的经济损失，还会对周围环境造成破坏。
凡是在发酵液或发酵容器中侵入了非接种的微生物统称为杂菌污染，及早发现杂菌并采取相应措施，对减少由杂菌污染造成的损失至关重要。
因此检查的方法要求准确、快速。
发酵污染可发生在各个时期。
种子培养期染菌的危害最大，因严格防止。
一旦发现种子染菌，均应灭菌后弃去，并对种子罐及其管道进行彻底灭菌。
发酵前期养分丰富，容易染菌，此时养分消耗不多，应将发酵液补足必要养分后迅速灭菌，并重新接种发酵。
发酵中期染菌不但严重干扰生产菌株的代谢，而且会影响产物的生成，甚至使已形成的产物分解。
由于发酵中期养分已被大量消耗，代谢产物的生成又不是很多，挽救处理比较困难，可考虑加入适量的抗生素或杀菌剂。
如果是发酵后期染菌，此时产物积累已较多，糖等养分已接近耗尽，若染菌不严重，可继续进行发酵;若污染严重，可提钱放罐。
染菌程度越重，危害越大;染菌少，对发酵的影响就小。
所以，实际生产中，应当根据污染程度和发酵时期区别对待。
器材与试剂1.器材高压蒸汽灭菌锅、超净工作台、带摇床的培养箱、显微镜、天平、三角瓶、试管、移液管、培养皿、接种针、平板涂布器、酒精灯、载玻片2.试剂营养琼脂、葡萄糖、磷酸二氢氨、七水合硫酸镁、氯化钠、磷酸氢二钾、牛肉膏、蛋白胨、0.4%酚红溶液、蒸馏水、番红染液、香柏油、擦镜液3.培养基(1)营养琼脂培养基：直接称量营养琼脂粉4.5g，溶于100mL蒸馏水配制，pH 7.2，分装到试管中，灭菌后摆成斜面。