DHA+与+EPA+合成超长链多不饱和脂肪酸的效率比较

【通讯作者】吴峥峥

ＤＨＡ与ＥＰＡ合成超长链多不饱和脂肪酸的效率比较

余　曼，陈　波，张瑞帆，吴峥峥

（四川省医学科学院・四川省人民医院眼科，四川成都６１００７２）

【摘要】　目的　比较在ＥＬＯＶＬ４蛋白酶催化作用下，ＤＨＡ和ＥＰＡ合成超长链多不饱和脂肪酸ＶＬＣ－ＰＵＦＡ的效率。方法　构建携带ＥＬＯＶＬ４基因和绿色荧光蛋白的重组腺病毒，转入培养的ＰＣ１２细胞，通过ｑＲＴ－ＰＣＲ定量分析ＥＬＯＶＬ４基因的表达量，ＷＢ检测ＥＬＯＶＬ４蛋白的表达；１∶１加入ＤＨＡ和ＥＰＡ，孵育４８ｈ之后进行脂肪酸提取，通过气相质谱ＧＣ－ＭＳ分析超长链脂肪酸的成分。结果　ＧＣ－ＭＳ检测到分别用ＤＨＡ及ＥＰＡ处理后的ＰＣ１２＋Ａｄ－ＥＬＯＶＬ４的细胞中有ｎ３ＶＬＣ－ＰＵＦＡ的表达，３４：５ｎ３和３６：５ｎ３分别为０畅８５％和１畅１１％；３４：６ｎ３和３６：６ｎ３分别为０畅１６％和０畅２９％；ＥＰＡ所产生的五烯酸总和是ＤＨＡ所产生的六烯酸总和的４倍。结论　ＥＰＡ合成ＶＬＣ－ＰＵＦＡ的效率远远高于ＤＨＡ，为患者提供更高比例的ＥＰＡ，而非ＤＨＡ，可能是治疗ＳＴＧＤ３疾病的方式之一。

【关键词】　二十二碳六烯酸；二十碳五烯酸；ＥＬＯＶＬ４基因；Ｓｔａｒｇａｒｄｔ病；超长链多不和脂肪酸【中图分类号】Ｒ７７ 【文献标志码】Ａ 【文章编号】１６７２－６１７０（２０１４）０５－００２４－０４

ＣｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆｅｌｏｎｇａｔｉｏｎｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙｂｅｔｗｅｅｎＤＨＡａｎｄＥＰＡｉｎｓｙｎｔｈｅｓｉｓｏｆｖｅｒｙｌｏｎｇｃｈａｉｎｐｏｌｙｕｎｓａｔｕｒａｔｅｄｆａｔｔｙａｃｉｄｓ　ＹＵＭａｎ，ＣＨＥＮＢｏ，ＺＨＡＮＧＲｕｉ－ｆａｎ，ＷＵＺｈｅｎｇ－ｚｈｅｎｇ　（ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＯｐｈ－

ｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ，ＳｉｃｈｕａｎＡｃａｄｅｍｙｏｆＭｅｄｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ＆ＳｉｃｈｕａｎＰｒｏｖｉｎｃｉａｌＰｅｏｐｌｅ摧ｓＨｏｓｐｉｔａｌ，Ｃｈｅｎｇｄｕ６１００７２，Ｃｈｉｎａ）

【Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇａｕｔｈｏｒ】　ＷＵＺｈｅｎｇ－ｚｈｅｎｇ

【Ａｂｓｔｒａｃｔ】　Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ　ＴｏｃｏｍｐａｒｅｔｈｅｅｌｏｎｇａｔｉｏｎｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙｂｅｔｗｅｅｎＤＨＡａｎｄＥＰＡｆｏｒｓｙｎｔｈｅｓｉｓｏｆｖｅｒｙｌｏｎｇｃｈａｉｎｐｏｌｙｕｎｓａｔ－ｕｒａｔｅｄｆａｔｔｙａｃｉｄ（ＶＬＣ－ＰＵＦＡｓ）ｕｎｄｅｒｃａｔａｌｙｔｉｃａｃｔｉｏｎｏｆＥＬＯＶＬ４ｐｒｏｔｅａｓｅ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　ＰＣ１２ｃｅｌｌｓｗｅｒｅｔｒａｎｓｄｕｃｅｄｗｉｔｈｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｔｙｐｅ５ｃａｒｒｙｉｎｇｍｏｕｓｅＥｌｏｖｌ４ａｎｄｇｒｅｅｎｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎ（ＧＦＰ）．ＧＦＰ－ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇａｎｄｎｏｎ－ｔｒａｎｓｄｕｃｅｄｃｅｌｌｓｗｅｒｅｕｓｅｄａｓｃｏｎｔｒｏｌｓ．ＥＬＯＶＬ４ｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｗａｓｑｕａｎｔｉｆｉｅｄｂｙｑＲＴ－ＰＣＲｓ．ＥＬＯＶＬ４ｐｒｏｔｅｉｎｗａｓａｎａｌｙｚｅｄｂｙＷｅｓｔｅｒｎ－Ｂｌｏｔ（ＷＢ）．ＴｈｅｔｒａｎｓｄｕｃｅｄｃｅｌｌｓｗｅｒｅｔｒｅａｔｅｄｗｉｔｈＤＨＡｏｒＥＰＡ（１：１）．Ａｆｔｅｒ４８ｈｏｆｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ，ｃｅｌｌｓｗｅｒｅｃｏｌｌｅｃｔｅｄ，ａｎｄｆａｔｔｙａｃｉｄｍｅｔｈｙｌｅｓｔｅｒｓｗｅｒｅｐｒｅｐａｒｅｄｆｏｌｌｏｗｉｎｇｔｏｔａｌｌｉｐｉｄｓｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ．Ｔｈｅｆａｔｔｙａｃｉｄｗａｓａｎａｌｙｚｅｄｂｙｕｓｉｎｇａｇａｓｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ－ｍａｓｓｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ（ＧＣ－ＭＳ）．Ｒｅｓｕｌｔｓ　ＧＣ－

ＭＳａｎａｌｙｓｉｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅＤＨＡａｎｄＥＰＡｔｒｅａｔｅｄＰＣ１２＋

Ａｄ－ＥＬＯＶＬ４ｈａｄｎ３ＶＬＣ－ＰＵＦＡｓｉｎｗｈｉｃｈ３４：５ｎ３ａｎｄ３６：５ｎ３ｗｅｒｅ０畅８５％ａｎｄ１畅１１％，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ；３４：６ｎ３ａｎｄ３６：６ｎ３ｗｅｒｅ０畅１６％ａｎｄ０畅２９％，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．ＴｏｔａｌａｍｏｕｎｔｏｆｐｅｎｔａｅｎｏｉｃｓｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄｆｒｏｍＥＰＡｗａｓａｌｍｏｓｔｆｏｕｒｔｉｍｅｓｔｈａｎｔｈａｔｏｆｈｅｘａｅｎｏｉｃｓｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄｆｒｏｍＤＨＡ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ　ＥｌｏｎｇａｔｉｏｎｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙｏｆＶＬＣ－ＰＵＦＡｓｆｒｏｍＥＰＡｉｓｍｕｃｈｈｉｇｈｅｒｔｈａｎｔｈａｔｆｒｏｍＤＨＡ．Ｔｈｅｒｅｆｏｒｅ，ｄｉｅｔａｒｙｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎｏｆｍｏｒｅＥＰＡｒａｔｈｅｒｔｈａｎＤＨＡｍａｙｐｒｏｖｉｄｅｓｏｍｅｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｂｅｎｅｆｉｔｓｆｏｒｐａｔｉｅｎｔｓｗｉｔｈＳｔａｒｇａｒｄｔｓ摧ｄｉｓｅａｓｅ（ＳＴＧＤ３）．

【Ｋｅｙｗｏｒｄｓ】　Ｄｏｃｏｓａｈｅｘａｅｎｏｉｃａｃｉｄ（ＤＨＡ），Ｅｉｃｏｓａｐｅｎｔａｅｎｏｉｃａｃｉｄ（ＥＰＡ），ＥＬＯＶＬ４ｇｅｎｅ，Ｓｔａｒｇａｒｄｔｓ摧ｄｉｓｅａｓｅ，Ｖｅｒｙｌｏｎｇｃｈａｉｎｐｏｌｙｕｎｓａｔｕｒａｔｅｄｆａｔｔｙａｃｉｄ（ＶＬＣ－ＰＵＦＡ）

以ＤＨＡ和ＥＰＡ为代表的ｎ３ＰＵＦＡｓ（ｐｏｌｙｕｎｓａｔ－ｕｒａｔｅｄｆａｔｔｙａｃｉｄｓ，ＰＵＦＡｓ）是指含有两个或两个以上双键的一类脂肪酸，通常按照第一个双键的位置把多不饱和脂肪酸分类，其中ｎ３ＰＵＦＡｓ，即从甲基端数第１个双键的位置在第３碳位的多不饱和脂肪酸，如二十二碳六烯酸（２２：６ｎ３，ＤＨＡ）和二十碳五烯酸（２０：５ｎ３，ＥＰＡ）。在哺乳动物神经系统中，ｎ３ＰＵＦＡｓ不但是重要的结构组分，而且是重要的营养

因子［１］

。ＤＨＡ被认为是功能最强的ｎ３ＰＵＦＡｓ，

ＤＨＡ与人类多种神经性疾病，例如阿尔默茨症［２］

。

Ｓｔａｒｇａｒｄｔ病（Ｓｔａｒｇａｒｄｔ－ｌｉｋｅｍａｃｕｌａｒｄｙｓｔｒｏｐｈｙ，ＳＴＧＤ）是一种发生于青少年期的遗传性黄斑营养不良，目前尚无有效的治疗方法。近年来的研究又发现，ＥＬＯＶＬ４基因第ＶＩ外显子上突变导致了人类的

常染色体显性遗传ＳＴＧＤ３的发病［３］

。ＥＬＯＶＬ４属

于超长链脂肪酸延伸酶（ｅｌｏｎｇａｓｅｏｆＥＬＯｎｇａｔｉｏｎｏｆｖｅｒｙｌｏｎｇｃｈａｉｎｆａｔｔｙａｃｉｄｓ，ＥＬＯＶＬ）家族，已被证实参与多不饱和脂肪酸（ｖｅｒｙｌｏｎｇｃｈａｉｎＰＵＦＡ，ＶＬＣ－ＰＵ－

ＦＡ）的Ｃ２８－Ｃ３８碳链延长的生化过程［４］

。ＭｃＭａｈｏｎ等发现，ＥＬＯＶＬ４基因突变的ＳＴＧＤ３小鼠模型的视

网膜中的Ｃ３２－Ｃ３６酰基磷脂酰胆碱的水平下降［５］

，ＶＬＣ－ＰＵＦＡ水平减少还会导师ＥＲＧ波幅的下降，因此，治疗ＳＴＧＤ３的策略之一可能是通过食物供给方式将ＶＬＣ－ＰＵＦＡ送到视网膜组织。然而，由于ＶＬＣ－ＰＵＦＡ结构的不稳定性，使得其很能被大量生产，那么另外一种方式就是通过提供ＶＬＣ－ＰＵＦＡ的前体物质，体内合成ＶＬＣ－ＰＵＦＡ。图１显示ｎ３ＰＵＦＡｓ的合成通路，我们看到ＤＨＡ和ＥＰＡ均为ＶＬＣ－ＰＵＦＡ的前体脂肪酸，尤其是ＤＨＡ占有在感光体外部节段磷

脂中大约５０％的脂肪酸［６］

，它在神经系统以及视网膜中的作用曾受到广泛的关注。本研究将转基因ＥＬＯＶＬ４蛋白在ＰＣ１２细胞中过量表达，等浓度加入

４

２　实用医院临床杂志２０１４年９月第１１卷第５期