_小鼠卵巢颗粒细胞适宜培养体系及激素干预的影响

中国组织工程研究第16卷第2期 2012–01–08出版Chinese Journal of Tissue Engineering Research January 8, 2012 Vol.16, No.2Jiaxing University College of Medicine, Jiaxing 314001, Zhejiang Province, ChinaChen Yi-fei, Jiaxing University College of Medicine, Jiaxing 314001, Zhejiang Province, China Correspondence to:Xu Ying, Doctor, Jiaxing University College of Medicine, Jiaxing 314001, Zhejiang Province, ChinaXuyingmrd@Supported by: the Natural Science Foundation ofZhejiang Province, No. Y2110873*; the Key Programme for Scientific Research of Jiaxing Committee of Science and Technology, No.2007A22013*; the Programme for Scientific Research of Jiaxing Committee of Science and Technology, No.2010AY1098*; the College Students' Scientific Research Innovation Projects of Zhejiang Province, No. 2010R417004* Received: 2011-04-18 Accepted: 2011-06-20嘉兴学院医学院，浙江省嘉兴市314001陈毅斐，男，1988年生，嘉兴学院医学院临床医学专业本科在读。

通讯作者：徐营，博士，嘉兴学院医学院，浙江省嘉兴市 314001 Xuyingmrd@ 中图分类号:R318文献标识码:B文章编号:1673-8225 (2012)02-00282-05收稿日期：2011-04-18 修回日期：2011-06-20 (20110418017/M·LX)小鼠卵巢颗粒细胞适宜培养体系及激素干预的影响****陈毅斐，许程洁，王鑫泉，徐营Suitable culture system of mouse ovarian granulosa cells and effect of hormone intervention Chen Yi-fei, Xu Cheng-jie, Wang Xin-quan, Xu YingAbstractChen YF, Xu CJ, Wang XQ, Xu Y.Suitable culture system of mouse ovarian granulosa cells and effect of hormone intervention.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2012;16(2): 282-286.[ ]摘要陈毅斐，许程洁，王鑫泉，徐营.小鼠卵巢颗粒细胞适宜培养体系及激素干预的影响[J].中国组织工程研究，2012，16(2):282-286. [ ]0 引言颗粒细胞是哺乳动物卵巢的重要功能细胞，其包围并营养着卵母细胞，与卵母细胞的生长、成熟紧密相关。

颗粒细胞与卵母细胞间的相互作用是二者生长、发育的必要条件，它们形成功能上的整体，颗粒细胞的增殖与分化直接影响着卵泡的生长发育、排卵、黄体形成以及甾体激素分泌等卵巢功能活动[1-3]。

抑制颗粒细胞增殖，将打断卵泡生长程序而导致不排卵，颗粒细胞大量凋亡将影响卵泡的正常发育与成熟过程，最终导致卵泡闭锁[4]。

目前，对于颗粒细胞体外培养条件的探索，学者们的报道不尽相同[5-8]。

基于颗粒细胞生理功能的重要性，尝试在体外环境建立一个高效、稳定的卵巢颗粒细胞培养体系，探究颗粒细胞相关生物学特性可帮助认识卵泡发育与闭锁机制，为进一步开展颗粒细胞体外生殖学与毒理学研究奠定基础。

本实验同时应用RPMI1640、HTF与BIO-AMF2体外培养体系，比较、优化并确定稳定、高效的培养系统，对原代培养颗粒细胞的基本生物学特性以及孕马血清促性腺激素(pregnant mare serum gonadotropin，PMSG)、人绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin， hCG)对细胞增殖能力与细胞骨架的影响进行初步研究。

1 材料和方法设计：随机对照动物实验。

时间及地点：实验于2010-05/2011-03在陈毅斐，等. 小鼠卵巢颗粒细胞适宜培养体系及激素干预的影响 www.CRTER .org嘉兴市医学分子生物学重点实验室进行。

材料：实验动物：ICR 品系性成熟雌性小鼠60只，6~8周龄，购自浙江中医药大学动物实验中心，饲养于光照控制(10L ：14D)、恒温恒湿的饲养室，自由采食饮水。

主要试剂：实验方法：小鼠卵巢颗粒细胞的分离及不同培养体系的建立：每只雌性小鼠腹腔注射10 U 孕马血清促性腺激素，48 h 后颈椎脱臼法处死，无菌条件下迅速分离小鼠卵巢，RPMI1640培养液清洗，在体视显微镜下去除其周围脂肪和被膜，用1 mL 注射器针头刺破卵泡，使颗粒细胞释放，剔除大块组织碎片后1 500 r/min 离心7 min ，加入培养液清洗2次后，弃上清收集细胞。

将沉淀分3组，分别加入RPMI1640培养体系(含100 U/mL 青霉素、 100 mg/L 链霉素、体积分数10%胎牛血清的RPMI1640培养液)、HTF 培养体系(含100 U/mL 青霉素、100 mg/L 链霉素、体积分数10%胎牛血清的HTF 培养液)和BIO-AMF 2培养液重悬，入37 ℃、体积分数5%CO 2、体积分数95%空气、饱和湿度的培养箱中培养，每隔24 h 在倒置相差显微镜下观察不同培养体系中颗粒细胞的生长行为和形态特征。

传代培养：待细胞汇合至培养瓶底面积的80%左右，倾去培养液，加入PBS(-)清洗，然后用0.25%胰酶消化，37 ℃孵育3 min ，加入等体积的含血清培养液终止胰酶反应，以吸管上下吸放数次以打散细胞团块，混和均匀后，依稀释比例转移至新的培养瓶中，同上述原代培养条件培养。

不同培养体系对颗粒细胞增殖能力的影响：取处于指数生长期的颗粒细胞，消化后分别重悬于上述BIO-AMF 2、RPMI1640、HTF 3组培养体系中，混匀后按每孔约1.5×104个接种于96孔板，每孔200 μL ，每组设置6个复孔，培养48 h 后进行MTT 检测。

检测时，每孔添加20 μL MTT(5 g/L)，37℃继续孵育4 h 。

培养终止后，小心吸弃孔内培养液，每孔加入150 μL 二甲基亚砜，低速振荡10 min ，使结晶物完全溶解。

将96孔板置于自动酶联免疫检测仪上测定490 nm 处各孔的吸光度值(A 490)。

小鼠卵巢颗粒细胞C-kit 免疫组化染色鉴定：取少量经传代后的第2代颗粒细胞用于爬片，48 h 后终止细胞培养，PBS(-)振荡清洗5 min×3次；40 g/L 多聚甲醛室温固定40 min 后，PBS(-)振荡清洗5 min×3次；0.5%Triton X-100室温孵育20 min ，PBS(-)振荡清洗5 min×3次。

体积分数为3%H 2O 2去离子水室温孵育10 min 后，蒸馏水冲洗，PBS 浸泡10 min ；滴加封闭用正常山羊血清工作液(试剂A)室温孵育40 min ，倾去，勿洗；滴加1∶100稀释兔抗小鼠一抗(C-kit)50 μL ，4 ℃冰箱过夜后，PBS 振洗5 min×3次；滴加生物素化二抗工作液IgG(试剂B)，37 ℃孵40 min ，PBS 振洗5 min×3次；滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液(试剂C)，37 ℃孵育15 min ，PBS 冲洗，5 min×3次；DAB 显色(A ，B ，C 试剂各1滴，加1 mL 蒸馏水混匀)，室温下控制5~10 min ，PBS 冲洗充分后，苏木精复染，常规梯度乙醇(体积分数为70%、80%、90%) 5 min×1次，体积分数为95%乙醇5 min×2次，体积分数为100%乙醇5 min×3次)脱水之后，二甲苯透明，50%明胶封固，观察拍照。

颗粒细胞细胞周期的检测：取对数生长期的第2代颗粒细胞，0.25%胰蛋白酶-EDTA 消化收集细胞，1 500 r/min 离心5 min ，沉淀用预冷的体积分数为70%乙醇4 ℃固定过夜；固定的细胞1 500 r/min 离心10min ，弃上清，沉淀用1 mL 含有体积分数为1%胎牛血清和0.1%TritonX-100的PBS(-)重悬，于37 ℃孵育20 min ；1 500 r/min 离心10 min ，弃上清，沉淀用含有体积分数为1%胎牛血清的PBS(-)重悬，加入终质量浓度为50 mg/L RNase A ，37 ℃孵育30 min ；将样品放入冰浴中终止RNA 酶反应，以培养液调整细胞浓度为1× 109 L -1，每个样品中加入终质量浓度为50 mg/L 的溴化丙啶，4 ℃避光染色30 min ；染色后的样品于4 h 内上机流式分析检测细胞周期。

孕马血清促性腺激素和人绒毛膜促性腺激素对颗粒细胞增殖能力的影响：将分离得到的第3代颗粒细胞经锥虫蓝染色、细胞计数后，按每孔约1×104个接种于96孔板，每孔200 μL ，设置实验组与对照组，实验组添加1 mL/L 人绒毛膜促性腺激素与2.5 mL/L 孕马血清促性腺激素，对照组不处理，每组设置3个复孔，置于37 ℃、体积分数为5%CO 2、饱和湿度的培养箱中培养。

在培养过程中每24 h 进行1次MTT 检测，每次分别检测实验组与对照组中的3个孔，直至接种培养后第6天。

以时间为横坐标，各时间点A 490测定的平均值为纵坐标，绘制实验组与对照组颗粒细胞体外培养的增殖曲线，比较两者差异。

试剂 来源 RPMI1640培养基，HTF 培养基，胎牛血清，25%胰蛋白酶-EDTABIO-AMF 2培养基，无Ca 2+、 Mg 2+磷酸盐缓冲液[PBS(-)] 孕马血清促性腺激素、人绒毛膜促性腺激素青霉素、链霉素C-kit 免疫组化试剂盒MTT 粉剂，二甲基亚砜， RNase A牛血清白蛋白TritonX-100，甘氨酸 小鼠抗β-微管蛋白抗体，FITC 标记的山羊抗鼠二抗，微丝抗体(鬼笔环肽)，溴化丙啶，防荧光淬灭剂 Gibco 公司生工生物(上海)有限公司宁波第二激素厂中诺药业有限公司 武汉博士德生物工程有限 公司北京鼎国昌盛生物技术公司Roche 公司 Amresco 公司Sigma 公司陈毅斐，等. 小鼠卵巢颗粒细胞适宜培养体系及激素干预的影响www.CRTER.org孕马血清促性腺激素和人绒毛膜促性腺激素对颗粒细胞的细胞骨架的影响：向BIO-AMF 2培养液中添加1 mL/L 人绒毛膜促性腺激素与2.5 mL/L 孕马血清促性腺激素培养经传代后的第3代颗粒细胞作为实验组，取实验组与空白对照组颗粒细胞分别进行细胞爬片，培养48 h 后，经清洗、固定、透膜后与分别用封闭液1∶20稀释鬼笔环肽标记微丝抗体37 ℃温育1 h ；1∶50稀释小鼠抗β-微管蛋白抗体(monoclonal anti-β-tubulin)4 ℃过夜，清洗后加入1∶100清洗液稀释的FITC 标记的山羊抗鼠二抗(FITC-goat-anti-mouse IgG)，37 ℃温育1 h ，清洗后于洁净载玻片上滴加防荧光淬灭剂，用无色指甲油封固盖玻片四周，37 ℃温育5 min ，使样品固定。