差异表达基因分离技术的研究进展

Ａｂｓｔｒａｃｔ： ｍｅｔｈｏｄｓ ｈａｖｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｂｅｅｎ ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ ｆｏｒ ａｎａｌｙｉｎｇ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ
Ｎｏｒｍａｌ
Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈａｏｚｈｏｕ ５２ １０４１）
ｇｅｎｅｓ
ｈａｓ ｂｅｃｏｍｅ ｐｒｉｍｅ ｉｎｔｅｒｅｓｔ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ
ｍＲＮＡ差异显示技术
ｍＲＮＡ差异显示技术（ｍＲＮＡ
ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｄｉｓｐｌａｙ
作用。
ｒｅｖｅｒｓｅ
ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ
ＰＣＲ，ＤＤＲＴ—ＰＣＲ）最早由Ｌｉａｎｇ和
５代表性差异分析
１９９３年Ｌｉｓｉｔｓｙｎ和Ｗｉｇｌｅｒ＂。建立了代表性差异 分析方法（ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｖｅ
ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ
１
差异基因筛选方法，主要品中提取ｍＲＮＡ为模板，反转录合成 ｅ中特异表达 的基因，然后对照杂交结果从原平板中挑出菌落鉴 定目的基因睢】。但这种方法灵敏度低，仅对－－ｄ，部 分能在一种细胞中大量表达、而在另一种细胞中不 表达或是表达量极低的基因才能奏效，而低丰度的 ｍＲＮＡ则难以检测到。
４
ａｎａｌｙｓｉｓ，ＲＤＡ），
１９９４年Ｈｕｂａｎｋ和Ｓｃｈａｔｚ【８１将其应用于克隆差别表 达基因上，并获得了成功。ＲＤＡ的简要过程如下： （１）提取检测组（Ｔｅｓｔｅｒ）和驱动组（Ｄｒｉｖｅｒ）的ＲＮＡ 或ｍＲＮＡ，反转录为ｃＤＮＡ。（２）用同一限制性内切 酶（如ＤｐｎⅡ）对两组ｃＤＮＡ作切割处理，形成长度 较短的ｃＤＮＡ片段代表群，以保证绝大多数遗传信 息能被ＰＣＲ扩增。（３）分别接上相同的寡核苷酸接 头。其中脱磷酸的短链以非共价键连接在ＤＮＡ粘 性末端上，以提高５’端长链的连接效率。该短链可 于升高温度时解离下来，在Ｔａｑ酶作用下以长链为 模板填平末端后，以接头的长链为引物进行ＰＣＲ扩 增，获得代表性扩增子。（４）以同一限制性内切酶 在代表性扩增子两端切出相同的粘性末端，并只在 Ｔｅｓｔｅｒ片段末端接上新接头，然后将Ｔｅｓｔｅｒ与过量的 Ｄｒｉｖｅｒ混合杂交。（５）复性、补平末端，以新接头序 列相对应的引物进行ＰＣＲ扩增。（６）用Ｍｕｎｇ
ｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，ＳＳＨ）技术是在抑制ＰｅＲ与差减杂交技 术结合的基础上，由Ｄｉａｃｈｅｎｋｏ等¨叫于１９９６年建
立的。
从待比较的两类细胞中分别提取ｍＲＮＡ反转 录为ｅＤＮＡ作为检测子（Ｔｅｓｔｅｒ）和驱动子（Ｄｒｉｖｅｒ）， 经酶切后产生大小适当的平末端ｅＤＮＡ片段；将 Ｔｅｓｔｅｒ等分为两份后加上不同的接头，之后经过两 轮杂交。第一次杂交中，过量Ｄｒｉｖｅｒ分别加入到连 有不同接头的Ｔｅｓｔｅｒ中，热变性后退火复性，产生４ 类分子，包括单链Ｔｅｓｔｅｒ ｃＤＮＡ、自身退火的Ｔｅｓｔｅｒ ｅＤＮＡ双链、Ｔｅｓｔｅｒ和Ｄｒｉｖｅｒ的异源双链和Ｄｒｉｖｅｒ ｅＤＮＡ。第一次杂交的目的是实现Ｔｅｓｔｅｒ单链ｃＤＮＡ 的均等化。杂交前，不同目的ｅＤＮＡ分子问存在丰 度差异。根据分子杂交的二级动力学原理，高丰度 ｅＤＮＡ分子复性形成双链的速度快于低丰度ｃＤＮＡ， 且丰度越高，复性越快。因此单链Ｔｅｓｔｅｒ ｅＤＮＡ分 子群体中，目的ｃＤＮＡ得以富集，而丰度差异得到均 衡。第二轮杂交中，两份杂交样品混合的同时，加入 新鲜变性的Ｄｒｉｖｅｒ ｃＤＮＡ。只有经差减和均衡的ｓｓ． ｅＤＮＡｓ能退火复性形成５’端带有两个不同接头的 杂交分子，使其在以后的ＰＣＲ中能被有效地扩增。 理论上该分子代表了丰度已趋于一致的所有差异表 达基因。之后，用与接头外侧序列对应的巢式引物 进行两次ＰｅＲ扩增，只有该型分子两端具有不同接 头，因此得以指数级扩增，差异表达ｃＤＮＡｓ得以 富集。 ＳＳＨ技术的优点在于：（１）假阳性率大大降低。 ＳＳＨ采用两次差减杂交和两次ＰＣＲ，保证了该方法 具有较高的特异性，阳性率可高达９０％以上¨¨。 （２）高敏感性。均衡化作用和目标片段的富集保证
ｒｅｖｉｅｗ ｄｅｓｃｒｉｂｅｄ ｔｈｅ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，ｔｅｃｈｎｉｃａｌ ｒｏｕｔｅｓ，ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｍｅｔｈｏｄｓ，ａｄｖａｎｔａｇｅｓ ａｎｄ ｄｅｆｅｃｔｓ ｏｆ ｔｈｅｓｅ ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｍｏｒｅｏｖｅｒ，Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ ｉｎ ｒｅｌａｔｅｄ ｓｔｕｄｉｅｓ
万方数据
７２
生物技术通报Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
Ｂｕｌｌｅｔｉｎ
２００９年第６期
Ｙ染色体的特异性基因，后经多年改进，已经发展为 许多基因克隆方法的基础，其实质是一种驱动组过 量的杂交方法。主要过程包括从来源相似而功能有 异的两种样品获得ｍＲＮＡ，含有目的基因的样品为 检测方（Ｔｅｓｔｅｒ），不含目的基因的样品称为驱动方 （Ｄｒｉｖｅｒ）。检测方ｍＲＮＡ反转录形成的ｃＤＮＡ与过 量的驱动方ｍＲＮＡ进行杂交，经两轮充分杂交后， 去除双链杂合体，富集目的基因，建立差减ｃＤＮＡ文 库，筛选目的基因。虽然差减杂交法在理论上极具 吸引力，但实际操作较难，经过两轮杂交及经基磷灰 石柱层析后，所回收的ｃＤＮＡ量非常有限，且存在重 复性差，灵敏度低的缺点。
）主要操作步骤包括，从样本中提
取总ＲＮＡ，用随机引物合成ｃＤＮＡ第一链，再用同 样的引物合成ｃＤＮＡ第二链，凝胶电泳，回收差异 表达的基因片段，基因克隆和测序。该方法采用的 随机引物不是Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ），所以可将非ｐｏｌｙ（Ａ）结 尾的ｍＲＮＡ也转录过来，避免了信息的丢失＂。。 ＲＮＡ指纹图谱技术在一定的反应条件下，重复 性好，条带的亮度差异在２０％以上即可定为是差异 表达基因。但是，该方法需要较高的变性温度和较 低的离子浓度，并且随机引物可能是某一基因的保 守区或分散的基因重复序列区，这样有可能只扩增 这一类基因。然而，该技术在ＲＮＡ的多态性和不同 发育阶段ＲＮＡ表达类别的差异显示上仍有着重要
Ｂｅａｍ
Ｎｕｃｌａｓｅ消化去除单链ＤＮＡ，完成第一次富集。（７） 更换引物，对富集产物重复（２）一（６）步操作。（８） 对富集产物进行克隆、检测和分析。 ＲＤＡ的实验设计巧妙，一方面通过对ｃＤＮＡ群 体进行限制性酶切，创造合适的表现度（ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａ－ ｔｉｏｎｓ），从而降低了ｃＤＮＡ复杂度，有利于进行ＰＣＲ
ＲＮＡ指纹图谱技术
ＲＮＡ指纹图谱技术（ＲＮＡ
ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｉｎｇ ｂｙ ａｒｂｉ．
扩增。另一方面，通过在检测子和驱动子连接不同
万方数据
２００９年第６期
高雪：差异表达基因分离技术的研究进展
７３
的接头，利用ＰｅＲ指数扩增双链模板，而仅以线性 形式扩增单链模板的特性，进行选择性扩增，使两组 之间的差异片段得到富集，有利于进行基因片段的 特异性扩增。目前，该方法已经在动物、人类及植物 的基因克隆中发挥作用。黄薇等ｐ ３采用该方法研 究植物耐盐基因，克隆了一个水孑Ｌ蛋白基因。此技 术具有假阳性较低、重复性好的特点，但操作步骤繁 琐、实验周期长、费用昂贵等缺点也是不容忽视的。
Ｍｉｅｒｏａｒｒａｙ
生命活动的各个进程伴随着不同基因的选择性 开启和关闭。高等真核生物约含有１０万个基因，在 某一类型的细胞中的特定发育阶段，只有１５％的基 因表达。这种在生物个体发育的不同阶段、或在不同 组织器官中，按一定时间和空间，基因有序表达的方 式称为基因的差别表达（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉｓｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ）¨１。 基因的这种差异表达不仅受生物体内在机制的调控， 也受外界环境因素，如光照、温度、逆境、药物作用等 影响。如何有效地分离克隆在不同发育阶段及不同 细胞群体间差异表达的基因，成为分子生物学研究的 一大热点，大量差异基因分离策略相继问世。
了低丰度ｍＲＮＡ也可能被检出。（３）高效性。一次 ＳＳＨ反应可同时分离成百个差异表达基因，速度快， 效率高。（４）差减后的组织特异性ｃＤＮＡ混合物能 被用作杂交筛选的探针，这使得该技术在克隆差异 表达基因方面更为通用。此外，ＳＳＨ技术程序相对 简单，操作简便易行且重复性高。 ＳＳＨ技术也存在一些局限，如要求研究材料的 遗传背景接近，差异不能太大；起始材料相对要求较 多，需要０．５—２斗ｇ的ｍＲＮＡ，否则低丰度的差异表
生物技术通报
・技术与方法・
ＢｌｏＴＥｃＨＮｏＬｏＧＹ
ＢＵＬＬＥＴＩＮ
２００９年第６期
差异表达基因分离技术的研究进展
高雪
（韩山师范学院生物系，潮州５２１０４１）
摘要：
分离并克隆差异表达基因是生命科学的研究热点。近年来，以差示筛选、扣除杂交等基本方法为基础，先后出
现了抑制差减杂交，微阵列技术等多种分析差异表达基因的技术，使差异表达基因分离方法不断完善。对这些方法的优缺 点、发展趋势及应用前景进行了简要综述。
ｗｅｒｅ
ｄｉｓｃｕｓｓｅｄ． Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ Ｓｕｂｔｒａｅｔｉｖｅ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ＤＤＲＴ—ＰＣＲ ＲＮＡ ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｉｎｇ
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｇｅｎｅ ｂｙ ａｒｂｉｔｒａｒｙ ｐｒｉｍｅｄ ＰＣＲ ＲＤＡ ＳＳＨ
Ｐａｒｄｅｅ在１９９２年报道”１，是目前应用较广泛的进行 ｍＲＮＡ差异比较的技术，能有效检测真核细胞中特定 基因的表达模式，因而可以用于发现和克隆新的基因。 它以ＰＣＲ和聚丙烯酰胺凝胶电泳为基础，根据真核生 物成熟ｍＲＮＡ的３’端具有ｐｏｌｙ（Ａ）尾的特点，用含Ｏｌｉ— ｇｏ（ｄＴ）的寡聚核苷酸作为锚定引物，逆转录真核生物 中全部表达的ｍＲＮＡ。根据ｐｏｌｙ（Ａ）序列（前２个碱基 除ＡＡ外）设计合成１２种下游锚定引物，利用３’端锚定 引物与５ ７端２０种１０ ｂｐ随机引物进行ＰＣＲ扩增，将 ＰＣＲ产物直接显示在聚丙烯酰胺凝胶上，回收表现差 异的条带进一步分析鉴定。这一方法的问世为差异基 因的分离克隆提供了一个全新的思路，目前该技术已 广泛应用于胚胎发育、形态发生、信号传导及抗逆基因 的比较鉴定与克隆。中科院遗传所利用该技术研究盐 胁迫条件下水稻耐盐突变体基因的表达，克隆到了完 全受盐诱导表达的ｃＤＮＡ片段”１。 ＤＤＲＴ—ＰＣＲ能同时进行两组或两组以上样品的 分析比较，检测基因的上调和下调表达，具有周期 短、灵敏度高、操作简便等优点；但是它也存在一些 明显的不足，如假阳性高、可重复性差、扩增片段短、 倾向于分离高拷贝数ｍＲＮＡ对应的ｃＤＮＡ序列、检 测到的往往是３’端出现的差异基因，而５’端表现差 异的基因不易被检测到等。