水及食品中微生物的检测
水质微生物检测
第二节饮用水种类及卫生微生物指标
一、饮用水分类 1、生活饮用水：供人生活的饮水和生活用水 2、包装饮用水： • 饮用天然矿泉水 • 饮用天然泉水 • 其他天然饮用水 • 饮用纯净水 • 饮用矿物质水 • 其他包装饮用水
二、饮用水介绍
（一）、生活饮用水 • 新发布的产品标准 GB5749-2006 • 标准检验方法为 GB/T5750-2006 • 水质检验项目由原35项增加至106项，旧标准微生
0 MPN/100mL
0 CFU//250mL 0 CFU//250mL 0 CFU//50mL
各类水质的微生物指标要求(续)
瓶 装 饮 用 纯 净 GB17324 － 水卫生标准 1998
菌落总数 ≤ 大肠菌群 ≤
霉菌和酵母 ≤
致病菌（沙门氏菌、
志贺氏菌、金黄色葡萄
球菌）
瓶（桶）装饮用 GB19298 － 水卫生标准 2003
• PH：水中微生物适宜范围是pH6.5～8.5，这与一般自然水 的pH值范围相适应。 海水的pH7.5～8.5，海水中多数微生 物生长的最适pH7.2～7.6；
• 化学物质：有机物，无机物：氨、硝酸盐、磷酸盐、硫酸 盐、碳酸盐，金属离子：汞、铜；
• 营养物质：异养微生物，营养贫乏时，微生物倾向吸附颗 粒。
第三节生活饮用水微生物检测
一、水样中微生物项目检测方法 GB/T 5750.12
1 菌落总数
1 平皿计数法
2 总大肠菌群大肠菌群
1 多管发酵法
2 滤膜法
4大肠埃希氏菌
二、水微生物的种类
• 水微生物的种类很多，有细菌、真菌、病毒、藻 类和原生动物；
• 水中大多数微生物属于异养微生物，它能利用水 中有机物质生长，另一类为自养微生物，它只需 无机物质就能合成新的细胞。
国标菌落总数检测方法
国标菌落总数检测方法引言：菌落总数是指在一定的培养条件下，菌落形成的数量。
菌落总数检测是食品微生物检验中的一个重要指标，用于评估食品中微生物的污染程度和卫生质量。
本文将介绍国标菌落总数检测方法的步骤和原理。
一、国标菌落总数检测方法的步骤国标菌落总数检测方法主要包括样品制备、平板计数和结果计算三个步骤。
1. 样品制备需要准备好待测样品。
样品通常是食品、水或其他物质，可以是液体或固体。
将样品称取一定的量，然后按照一定的比例与适量的生理盐水进行稀释，以降低样品中菌落的数量，使其适合于后续的菌落计数。
2. 平板计数将制备好的样品溶液均匀地倒入已经凝固的琼脂平板中，然后用无菌铲子或无菌玻璃棒将溶液均匀涂抹在琼脂平板表面。
待琼脂凝固后，将平板倒置放置在恒温培养箱中，以利于菌落的生长。
根据不同的样品特点和需求，可以选择适当的培养温度和时间。
3. 结果计算在菌落生长适宜的条件下，菌落会在琼脂平板上形成。
在菌落形成后，使用计数器或目视观察，对菌落进行计数。
计数时需要遵循一定的规则，如避免重复计数、避免边缘菌落等。
最后，根据计数结果和样品的稀释倍数，计算出菌落总数。
二、国标菌落总数检测方法的原理国标菌落总数检测方法基于微生物在适宜的培养条件下形成可见的菌落的特性进行。
其原理主要包括稀释平板法和菌落计数法。
1. 稀释平板法稀释平板法是菌落总数检测的一种常用方法。
通过将样品与一定量的生理盐水进行稀释，使菌落的数量适于计数。
然后将稀释好的样品均匀涂抹在琼脂平板上，使菌落在琼脂上生长形成可见的菌落。
根据样品的稀释倍数和计数得到的菌落数量，计算出菌落总数。
2. 菌落计数法菌落计数法是国标菌落总数检测方法的关键步骤。
在菌落生长适宜的条件下，菌落会在琼脂平板上形成。
然后使用计数器或目视观察，对菌落进行计数。
计数时需要遵循一定的规则，如避免重复计数、避免边缘菌落等。
最后，根据计数结果和样品的稀释倍数，计算出菌落总数。
三、国标菌落总数检测方法的应用国标菌落总数检测方法广泛应用于食品、饮用水、药品、化妆品等领域。
食品微生物检验内容与检测技术分析
食品微生物检验内容与检测技术分析食品微生物检验是指对食品中的微生物进行检测和分析，以评估食品质量和安全性。
食品微生物检验的内容主要包括细菌、真菌、病毒以及寄生虫等微生物的检测。
食品微生物检验的主要目的是评估食品中的微生物污染程度，判断食品是否存在微生物污染，并评估其对人体健康的潜在危害。
常见的微生物检测项目包括总大肠菌群、霉菌和酵母菌、致病菌等。
1. 总大肠菌群检测：总大肠菌群是一类细菌，它们是指在寒冷接种的液体培养基中，能够在37℃下以产气或产酸的方式生长的细菌。
总大肠菌群检测可以反映食品中可能存在的粪便污染，是评价食品安全性的一个重要指标。
2. 霉菌和酵母菌检测：霉菌和酵母菌是一类常见的真菌，它们能够在食品中生长和繁殖，导致食品变质和产生毒素。
食品中的霉菌和酵母菌检测可以评估食品的质量和安全性，及时发现食品中的霉菌和酵母菌污染。
3. 致病菌检测：致病菌是指能够引起食物中毒或食源性疾病的细菌。
常见的致病菌包括沙门氏菌、变形杆菌、大肠杆菌等。
通过对食品中的致病菌进行检测，可以及时发现食品的潜在健康风险，采取相应的措施防止食品中毒的发生。
食品微生物检测技术主要包括传统培养法和分子生物学方法两种。
1. 传统培养法：传统培养法是指将食品样品进行培养，利用特定的培养基和培养条件，使微生物在培养基上生长和繁殖，通过观察培养基上的菌落形态、生理生化特性等，来鉴定和定量微生物。
常用的传统培养法有平板计数法、滤膜法、涂布法等。
2. 分子生物学方法：分子生物学方法是指利用分子生物学技术对食品中的微生物进行检测和鉴定。
主要包括聚合酶链式反应（PCR）、实时荧光聚合酶链式反应（RT-PCR）、基因测序等技术。
这些方法通过检测和分析微生物的基因序列和特征，可以准确快速地鉴定和定量食品中的微生物。
食品微生物检验的技术选择应根据不同的微生物和检测要求来确定。
传统培养法适用于一些常见的微生物的检测和定量，但需要较长的时间和专业的培养技术。
食品中的微生物检测技术
食品中的微生物检测技术食品安全一直备受人们的关注，而微生物污染是造成食品安全问题的重要原因之一。
所以，对于食品中的微生物检测技术的研究和应用显得十分必要。
本文将探讨食品中的微生物检测技术及其在食品安全领域中的应用。
一、背景介绍食品中的微生物指的是在食品中生长和繁殖的微生物，包括细菌、真菌和病毒等。
在食品生产和加工过程中，微生物可能通过各种途径进入食品中，引发食物中毒甚至传播疾病。
因此，监测食品中的微生物污染是确保食品质量和食品安全的关键环节。
二、食品中的微生物检测技术及原理1. 传统培养法传统培养法是最常用的微生物检测方法之一。
它通过将食品样品放入富含营养物质的培养基中，利用食品中的微生物在适宜条件下生长并形成可见的微生物集落，从而实现对微生物的检测。
这种方法简单易行，能够检测多种微生物，但是存在检测时间长、有可能遗漏无法培养的微生物等缺点。
2. 分子生物学方法分子生物学方法是近年来食品中微生物检测技术的新兴领域。
通过检测微生物的DNA或RNA序列，可以准确快速地确定食品中的微生物种类和数量。
其中，PCR技术和测序技术是最常用的方法之一。
PCR技术可以放大微生物的DNA片段，并通过比对特定序列来识别微生物。
测序技术则可以进一步对PCR扩增的片段进行测序，从而得到更加详细的信息。
这些分子生物学方法具有高灵敏度、高特异性和高准确性的优势，但是在样品处理和设备要求方面相对较高。
三、食品中的微生物检测技术的应用1. 工业生产在食品工业中，微生物检测技术被广泛应用于食品原料的筛选和检验、发酵及酿造工艺的控制、食品添加剂的质量监测等方面。
通过及时检测微生物污染，可以避免微生物对生产过程的干扰，保证产品质量和安全。
2.食品检测机构食品检测机构必须依靠微生物检测技术来评估食品质量和安全。
通过对食品样品进行微生物检测并给出合理的检测结论，有助于保护消费者的权益，维护食品市场秩序。
3. 公共卫生监管监管部门应用微生物检测技术对市场上的食品进行检测和监控，并采取相应的措施来控制和预防微生物污染。
食品微生物检验的指标
食品微生物检验的指标食品在食用前的各个环节中，被微生物污染往往是不可避免的。
评价食品被微生物污染的程度，要采用微生物检验指标采进行。
常采用的微生物检验指标为三项细菌指标，即细菌数量(主要是菌落总数)、大肠菌群最近似数(MPN)和致病菌。
第一节菌落总数一、菌落总数的概念及卫生意义食品中细菌数量越多，则食品腐败变质的速度就越快，甚至可引起食用者的不良王应．如有人认为细菌数量达到100—1000万个／g时食品就可能引起食用者的食物中毒。
菌落：指细菌在固体培养基上生长繁殖而形成的能被肉眼识别的生长物，它是由数以万计相同的细菌集合而成。
细菌数量的表示方法由于所采用的计数方法不同而有两种：菌落总数和细菌总数：1、菌落总数指一定数量或面积的食品样品，在一定条件下进行细菌培养，使每一个活菌只能形成一个肉眼可见的菌落，然后进行菌落计数所得的菌落数量。
通常以lg或1ml或lcm2样品中所含的菌落数量来表示。
按国家标准方法规定，即在需氧情况下，37℃培养48h，能在普通营养琼脂平板上生长的细菌菌落总数，所以厌氧或微需氧菌、有特殊营养要求的以及非嗜中温的细菌，由于现有条件不能满足其生理需求，故难以繁殖生长。
因此菌落总数并不表示实际中的所有细菌总数，菌落总数并不能区分其中细菌的种类，所以有时被称为杂菌数，需氧菌数等。
2、细菌总数指一定数量或面积的食品样品．经过适当的处理后，在显微镜下对细菌进行直接计数。
其中包括各种活菌数和尚未消失的死菌数。
细菌总数也称细菌直接显微镜数。
通常以1g或1m1或lcm2—样品中的细菌总数来表示。
菌落总数测定是用来判定食品被细菌污染的程度及卫生质量，它反映食品在生产过程中是否符合卫生要求，以便对被检样品做出适当的卫生学评价。
菌落总数的多少在一定程度上标志着食品卫生质量的优劣二、菌落总数的常规检验方法菌落总数的常规检验方法(GB4789．2-84)：一般将被检样品制成几个不同的10倍递增稀释液，然后从每个稀释液中分别取出1mL置于灭菌平皿中与营养琼脂培养基混合，在一定温度下，培养一定时间后（一般为48小时），记录每个平皿中形成的菌落数量，依据稀释倍数，计算出每克（或每ml）原始样品中所含细菌菌落总数。
食品微生物常见检测指标
1菌落总数菌落总数是指示性微生物指标，并非致病菌指标。
主要用来评价食品清洁度，反映食品在被加工过程中被污染的程度及卫生质量的重要指标。
菌落总数超标可能是企业所使用的原辅料初始菌数较高，或未按要求严格控制生产加工过程的卫生条件，或包装容器清洗消毒不到位，还有可能是产品包装密封不严，储运条件控制不当等导致。
如果食品的菌落总数严重超标，将会破坏食品的营养成分，加速食品的腐败变质，使食品失去食用价值。
2大肠菌群大肠菌群是国内外通用的食品污染常用指示菌之一。
食品中检出大肠菌群，提示被致病菌（如大肠埃希氏菌、柠檬酸杆菌、产气克雷伯氏菌和阴沟肠杆菌等）污染的可能性较大。
大肠菌群超标可能由于产品的加工原料、包装材料受污染，或在生产过程中产品受人员、工具器具等生产设备、环境的污染而导致。
大肠菌群，它不代表某一个或某一属细菌，而指的是具有某些特性的一组与粪便污染有关的细菌。
大肠菌群都是直接或间接地来自人和温血动物的粪便。
一般食品中大肠菌群超标，表示食品受动温血动物的粪便污染，其中典型大肠杆菌为粪便近期污染，其他菌属则可能为粪便的陈旧污染。
人吃了大肠菌群超标的食物可能会导致：肠道传染病、食物中毒等。
3霉菌霉菌，是丝状真菌的俗称，意即"发霉的真菌"，它们往往能形成分枝繁茂的菌丝体，但又不像蘑菇那样产生大型的子实体。
在潮湿温暖的地方，很多物品上长出一些肉眼可见的绒毛状、絮状或蛛网状的菌落，那就是霉菌。
霉菌在我们的生活中无处不在，它比较青睐于温暖潮湿的环境，一有合适的环境就会大量的繁殖，必须采取措施来阻止霉菌的繁殖或切断其传播途径，就可以摆脱霉菌的污染。
霉菌毒素对人主要毒性表现在神经和内分泌紊乱、免疫抑制、致癌致畸、肝肾损伤、繁殖障碍等。
4酵母酵母是一些单细胞真菌，并非系统演化分类的单元。
是子囊菌、担子菌等几科单细胞真菌的通称，一般泛指能发酵糖类的各种单细胞真菌，有的为致病菌。
空气中、人体中都存在一定数量的酵母菌，只要在合适的环境就会快速繁殖;吃了酵母菌污染的食品易造成食物中毒，有些免疫力低的人群亦可能发生酵母菌感染。
纯化水系统验证中微生物的检测周期
纯化水系统验证中微生物的检测周期水系统的纯化水验证是GMP工作的重要一环。
如何确定周期非常重要。
现在的一般做法是分初期验证及后期验证。
在初期分三个周期，每周期为5天或7天。
作全项检测。
包括微生物指标。
取样点为，纯化水贮罐、总送水口、总回水口、各使用点。
前面三个点天天取样。
现在我的问题是如果做理化指标，这样做也许合情合理但做微生物天天取样，天天检测以及持续三周，可能吗？请大家发表高论。
实际上国内的水系统验证已经很简化了，在国外企业，一般每个周期都要一个月！3个月的时间每天都要做的！FDA的高纯水系统检查指南中讲到：纯水的验证周期分为以下几个阶段，初期阶段2～4周，确定运行参数、清洁消毒方法，整个系统的的每个纯化步骤（each step in the purification process，碳滤、砂滤、反渗透、离子交换、蒸馏、水箱）、每个使用点（each point of use）每日取样，这个阶段完成后应形成SOP。
第二个阶段确证系统在制订的SOP操作下是否按照预期的要求运转，时间、取样要求和频率同第一阶段。
第三个阶段，通过长时间的监测运行，确认系统能达到预期的要求。
这个阶段对系统进行周期取样监测，对于注射用水点每周对各使用点循环监测一次。
这个阶段持续一年。
目前国内的纯水系统没有作到这么细（比如对于系统纯化单元的验证一般不管），但还是参照这来的，可以比较学习一下。
《药品生产验证指南》2003版中提出，纯化水的初期验证取样频率为：1、纯化水贮罐，在3个验证周期内（每个周期为5天）天天取样，并记录水温；2、总送水口，在3个周期内天天取样，并记录水温；3、总回水口，在3个验证周期内天天取样，并记录水温；4、各使用点，每个验证周期内取样1次，共3次（重新取样除外）。
并记录水温。
并建议：全部取样点每次取样均需做微生物测试。
空气净化系统验证方案目录一、验证方案概述1．引言2．主要技术参数3．验证目的4．验证时间5．再验证6．验证组织与分工二、验证方法及步骤（一）安装确认1 文件资料2．空调器安装3．辅机安装4．公用工程安装5．风管的制作与安装6．计量器具校验情况（二）运行确认（三）性能确认三、附件引言里主要说明有关空调的信息，是哪个公司生产的设备，哪个公司按ＧＭＰ要求安装的，有几台，设计风量是多少等，主要技术参数如下：１. 洁净厂房的空气温度为18～26℃，相对湿度为45%～65%２.洁净厂房每个房间的空气，流动速度达到GMP对该房间的换气次数要求。
食品微生物检测标准
食品微生物检测标准一、引言食品微生物检测是保障食品安全的重要手段，它通过对食品中的微生物进行检测和分析，以评估食品的卫生质量和潜在的安全风险。
为了规范和统一食品微生物检测工作，制定相应的标准是至关重要的。
本文将详细探讨食品微生物检测标准的相关内容，包括一般标准、各类食品的微生物检测标准、食品安全国家标准以及国际发展趋势等方面。
二、微生物检测一般标准微生物检测一般标准是针对食品中微生物的检测方法和程序进行规范的总称。
这些标准通常包括采样方案、检测方法、结果判定等方面的规定。
例如，在采样方案方面，需要规定采样的部位、数量、频率以及样品的保存和运输方式等；在检测方法方面，应遵循国际公认的检测方法和程序，以确保检测结果的准确性和可靠性；在结果判定方面，应根据微生物的种类和数量制定相应的安全限值，并依据限值进行结果判定。
三、各类食品的微生物检测标准由于不同种类的食品具有不同的特性，其微生物检测标准也会有所不同。
以下是一些常见食品种类的微生物检测标准：1.肉类食品：肉类食品的微生物检测重点在于沙门氏菌、弯曲菌属等病原菌的检测，以及菌落总数、大肠菌群等卫生指标的监控。
对于生肉和熟肉制品，需要制定不同的检测标准。
2.乳制品：乳制品的微生物检测主要包括乳酸菌、大肠菌群、沙门氏菌等指标的检测。
对于发酵乳制品和灭菌乳制品等不同种类，其微生物检测标准也有所不同。
3.水果和蔬菜：水果和蔬菜的微生物检测主要关注大肠菌群、霉菌、酵母等指标的检测。
为了确保食品安全，需要对果蔬表面和内部进行取样检测。
4.谷物及其制品：谷物及其制品的微生物检测重点在于黄曲霉毒素、霉菌等指标的检测。
同时，还需要监控谷物中的沙门氏菌和大肠菌群等卫生指标。
5.食用油：食用油的微生物检测主要针对霉菌、黄曲霉毒素等指标的检测。
此外，还需要对食用油中的细菌进行监控，以确保食用油的质量安全。
四、食品安全国家标准食品安全国家标准是针对食品中微生物和其他危害物的限量标准，是保障食品安全的重要法规。
食品中微生物的检验
食品中微生物的检验一、概念和分类微生物并不是生物学分类学上的专门名词，而是对所有形体微小，单细胞的或个体结构较为简单的多细胞的、甚至没有细胞结构的低等生物的统称。
微生物群体特不庞杂，种类繁多，包括细胞型和非细胞型两类。
凡具有细胞形态的微生物称为细胞型微生物。
细胞型微生物按细胞结构又分为原核微生物和真核微生物。
原核生物的要紧特点：细胞内有明显的核区，但没有核膜包围；核区内含有一条双链DNA构成的染色体；能量代谢和许多合成代谢均在质膜上进行，核糖体分布在细胞之中；相关于原核微生物，真核微生物的细胞结构有了真正的细胞核,有多种细胞器；而病毒因此不具有细胞结构，由核酸和蛋白质组成，能够认为是超显微的、没有细胞结构的、专性活细胞内寄生的实体。
它们在活细胞外具有一般化学大分子的特征，在宿主细胞内又具有生命特征。
能够作为了解的是，病毒能够通过细菌滤器，且对抗生素不敏感，对干扰素敏感。
二、细菌、霉菌、酵母菌和致病菌介绍细菌的细胞结构在原核生物中具有代表性，要紧由细胞壁、细胞膜、细胞质、核质体等局限构成,有的细菌还有夹膜、鞭毛、菌毛等特别结构。
在自然界中细菌是分布最广、数量最多的一类生物，并与食品关系最为紧密。
是食品理论、工业发酵和酿造研究的要紧对象，也是导致食品腐败的要紧类群。
细菌的根基形态有球状、杆状和螺旋状,分不被称为球菌、杆菌和螺旋菌。
霉菌是一些丝状真菌的统称。
在自然界分布极广，它的营养来源要紧是糖类和少量氮、矿物盐等，极易在含糖的食品、饼干、面包和各种谷物、水果上生长。
经常会有食品会因为发生霉变而不能食用，还有些霉菌会产生毒性特别大的毒素，好比黄曲曲折折曲曲折折折折霉素、黄米毒素、杂色曲曲折折曲曲折折折折霉素和展青霉素等等，都可能导致癌症，这类霉菌在大米和花生中最多。
由此，对霉菌的检测尤为重要。
霉菌菌体是由分支或不分支的菌丝组成，菌丝细胞均由细胞壁、细胞膜、细胞质、细胞核、线粒体、核糖体以及内含物组成。
食品微生物检验技术
注1： 按照二级采样方案设定的指标，在n个样品中， 允许有≤c个样品其相应微生物指标检验值大于m值。 注2： 按照三级采样方案设定的指标，在n个样品中， 允许全部样品中相应微生物指标检验值小于或等于m 值；允许有≤c个样品其相应微生物指标检验值在m值 和M值之间；不允许有样品相应微生物指标检验值大于 M值。
若所有稀释度的平板菌落数均小于30 CFU，则应按稀释度最低的 平均菌落数乘以稀释倍数计算。
若所有稀释度（包括液体样品原液）平板均无菌落生长，则以小 于1 乘以最低稀释倍数计算。
若所有稀释度的平板菌落数均不在30 CFU～300 CFU 之间，其 中一部分小于30 CFU 或大于300CFU 时，则以最接近30 CFU 或300 CFU 的平均菌落数乘以稀释倍数计算。
3.散装食品或现场制作食品 根据不同食品的种类和状态及相应检验方法中规定的检验单位，用 无菌采样器现场采集5倍或以上检验单位的样品，放入无菌采样容 器内, 采样总量应满足微生物指标检验的要求。
4.食源性疾病及食品安全事件的食品样品 采样量应满足食源性疾病诊断和食品安全事件病因判定的检验要求。
食品微生物检样的操作方法
➢ 充气饮料应在无菌条件下进行排气；酸性样品用经过灭菌的20～30 ％碳酸钠溶液调整pH值至中性；高盐样品应用灭菌蒸馏水进行稀释。
➢ 在作10倍递增稀释中，吸管插入检样稀释液内不能低于液面2.5cm； 吸入液体时，应先高于吸管刻度，然后提起吸管尖端离开液面，将尖 端贴于玻璃瓶或试管的内壁使吸；当用吸管将检样稀释液加至另一装 有9mL空白稀释液的试管内时，应小心沿管壁加入，不要触及管内稀 释液，以防吸管尖端外侧部分粘附的检液也混入其中。
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水及食品中微生物的检测水是食品生产中的重要原料。
据世界卫生组织估计，在全世界每年数以亿计的食源性疾病患者中，70%是由于食用了各种致病性微生物污染的食品和饮水造成的。
水是否合乎标准，除需对其感官质量、放射性物质、与健康有关的无机成分等进行分析测定外，还必须对微生物进行检测。
通常通过水中细菌总数和大肠杆菌群数来确定水的卫生质量。
细菌总数是指被检样品经过处理（如剪碎、研匀），在一定条件下培养后，所得1g或1ml检样中所含细菌菌落的总数。
由于一个活细胞能形成一个菌落，因此，菌落就是待测样品所含的活菌数。
由于每种细菌都有一定的生理要求（如对氧、培养温度、培养基的pH等），所以，培养时应该用不同的培养条件及不同的生理条件去满足其要求，才能将各种细菌都培养出来。
但在实际工作中，一般都只用一种常用的方法去作细菌菌落总数的测定，所得结果指包括一群能在牛肉膏蛋白胨琼脂上或其他培养基上生长的嗜中温性需氧菌的菌落总数。
大肠杆菌是一群在37 ℃下能发酵乳糖、产酸产气、需氧或兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌,大多数无致病性,但是当致病性大肠杆菌侵入人体某些部位时,可引起腹泻、膀肤炎、胆囊炎等。
大肠杆菌作为普遍采用的水质卫生学指标,常用来指示水源受粪便污染的状况,从而控制其质量,保证卫生安全[1]。
食品中大肠杆菌群系以每100ml(g)检样内大肠菌群最可能数（MPN）来表示。
大肠杆菌群的测定，一般包括发酵试验（在单料或双料乳糖胆盐发酵管内进行）、分离培养试验（利用伊红美蓝平板）、复发酵试验（在乳糖发酵管内进行）、革兰氏染色、芽孢染色、显微镜观察等。
1材料与用具1.1材料湖水、黄酒。
1.2 培养基1.2.1 肉膏蛋白胨琼脂固体培养基牛肉膏1.0g、蛋白胨2.0g、NaCl1.0g、水200 ml、琼脂2%、pH7.2、0.10Mpa 灭菌20min。
1.2.2 乳糖胆盐发酵培养基(单料)蛋白胨5g、乳糖2.5g、猪胆盐(或牛、羊胆盐)1.25g、0.04%溴甲酚紫水溶液4滴左右、蒸馏水250ml、pH7.4。
配制方法如下：将蛋白胨、胆盐及乳糖溶于水中，校正pH，加入指示剂，分装每支试管的1/3，并倒置放入杜氏小管(注意排净小管内气泡)，115℃灭菌15min。
1.2.3 乳糖发酵培养基蛋白胨2.4g、乳糖1.2g、0.04%溴甲酚紫水溶液2-3滴、蒸馏水120ml、pH7.4。
配制时将蛋白胨及乳糖溶于水中，校正pH，加入指示剂，按检验要求分装每支试管的1/3，并倒置放入杜氏小管(注意排净小管内气泡)，115℃灭菌15min。
1.2.4 伊红美蓝固体培养基伊红美蓝固体培养基是一种鉴别培养基，常用于食品及饮用水的微生物学检验，培养基中的伊红为酸性燃料，美蓝则为碱性染料，当大肠杆菌发酵乳糖产生混合酸时，细菌带正电荷，与伊红染色，再与美蓝结合生产紫黑色化合物。
在此培养基上大肠杆菌生长形成呈紫黑色带金属光泽的小菌落，而产气杆菌则形成棕色大菌落，不能发酵乳糖的细菌产碱性物质较多，带负电荷，与美蓝结合形成兰色菌落。
其配方为：牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl5g、20%乳糖溶液20ml、2%伊红溶液20ml、0.5%美蓝溶液10ml、水1000ml、琼脂20g、pH7.6。
配制时将牛肉膏、蛋白胨、NaCl加入水中溶解，调pH为7.6，加琼脂、融化、分装、灭菌。
再以无菌操作加入预先0.075MPa 灭菌20min的20%乳糖溶液20ml、2%伊红溶液20ml、0.5%美蓝溶液10ml。
当培养基冷却到50℃左右倒平皿。
1.3实验用具显微镜、培养箱、水浴锅、培养皿、吸管、接种环、试管、杜氏小管、涂布器、酒精灯、试管架等。
2方法2.1细菌总数的测定2.1.1 采样瓶装发酵酒的取样方法：用点燃的酒精棉球灼烧瓶口灭菌，用石炭酸纱布盖好，再用灭菌开瓶器将盖启开，含有二氧化碳的酒类可倒入500ml灭菌磨口瓶中，口勿盖紧，覆盖一灭菌纱布，轻轻振荡，待气体全部逸出后，进行检验。
水样的采取方法：湖水应取距水面10~15cm的深层水样，将无菌带玻璃塞的广口瓶浸入水中，盛满后将瓶塞盖好，再从水中取出。
2.1.2 检样稀释 (无菌操作)将被检样25 g (或25ml或1ml) 剪碎，放入含有225ml (或9毫升)无菌生理盐水(或无菌水)的无菌三角瓶(瓶内放置适当数量的玻璃珠)或无菌研钵内，经充分振荡或研磨，制成10-1稀释液。
用1ml吸管吸取10-1稀释液1ml，沿管壁慢慢注入含有9ml无菌水的试管内，制成10-2的稀释液，同法，直到用最后稀释度的菌液做倾注法平皿计数时，每个培养皿的菌落数在30~300之间。
2.1.3 倾注培养选择10-4、10-5两个适宜稀释度，每个稀释度作2个平皿。
稀释液移入平皿后，及时将保温至45℃左右的肉膏蛋白胨琼脂培养基注入平皿约15ml，并摇动平皿使培养基和菌液混匀，待凝固后将平皿倒置于36±1℃培养箱内培养24±2h 后取出，计算平板内菌落总数，乘以稀释倍数，即得每克(每毫升)样品菌落总数。
2.1.4 菌落计数方法可用肉眼观察直接计数，也可用菌落计数器计数。
求出同稀释度的各平板平均菌落数。
2.2 大肠菌群检验2.2.1 检样稀释无菌操作将检样25ml(或25g)放入装有225ml无菌生理盐水的无菌三角瓶内（瓶内预置适当数量的玻璃珠）或无菌研钵内，经充分振摇或研磨制成10-1稀释度的稀释液。
用1ml无菌吸管吸取上述稀释液1ml，注入含有9ml无菌生理盐水的试管内，振摇混匀，制成10-2的稀释液。
另取1ml无菌吸管，按上述方法依次做10倍递增稀释液，每次换用1支1ml 无菌吸管。
选择1、10-1、10-23个稀释度，每个稀释度接种3管。
2.2.2 乳糖胆盐发酵将被检样品接种乳糖胆盐发酵管内，每一稀释度接种3管，置36±1℃培养箱内，培养24±2h，如所有乳糖胆盐发酵管都不产气，则可报告为大肠菌群阴性；如有产气者，则按下列程序进行。
2.2.3 分离培养将产气的发酵管分别接种在伊红美蓝琼脂平板上，置36±1℃培养箱内，培养18~24h。
观察菌落形态，做革兰氏染色和复发酵证实实验。
2.2.4 复发酵证实试验在伊红美蓝琼脂平板上挑取①紫红色，具有金属光泽的菌落；②深红色，不带或略带金属光泽的菌落；③淡红色，中心较深的菌落。
具有以上特征的菌落为可疑大肠菌群菌落，挑取1~2个进行革兰氏染色，同时对应接种到乳糖发酵管内进行复发酵，36±1℃培养24±2h，观察产气情况。
凡在乳糖发酵管内产气、革兰氏染色为阴性的无芽孢杆菌，即可报告为大肠菌群阳性；如不产气或革兰氏阳性，则报告大肠菌群阴性。
3结果与分析3.1细菌总数的测定取湖水、黄酒稀释度为10-4和10-5的稀释液于牛肉膏蛋白胨培养基内混合培养，每一稀释度2个平板。
将平皿倒置于36±1℃的恒温箱内培养24±2h后取出，采用肉眼直接观察计数各平板的菌落数，并计算两者的菌落数，结果如表1所示。
由表可知湖水的细菌含量为1.6*106个/ml，比黄酒的细菌含量高。
因此，黄酒中的细菌未超标，而湖水中的细菌超标了，不符合安全标准。
湖水中只有10-5稀释度的平皿有细菌，其他几个都没有，可能是因为前几个倒的时候培养基温度还太高，把细菌烫死了。
表1 湖水和黄酒的细菌总数结果样品湖水10-4湖水10-5黄酒10-4黄酒10-512平均菌落总数(个/ml) 01.6*1063216<1*1043.2 大肠菌群检验3.2.1 乳糖胆盐发酵分别取黄酒、湖水1、10-1、10-2稀释液1ml注入乳糖胆盐发酵管，每个稀释度接种3管，于36±1℃的恒温箱里培养24±2h，结果如表2和表3所示。
用湖水进行乳糖胆盐发酵，结果显示都不产气，但1、10-1两个稀释度有颜色变化，决定将这两个稀释度中的大肠杆菌进行分离培养。
而用黄酒进行乳糖胆盐发酵，结果显示都不产气、不产酸，报告为大肠菌群阴性。
表2 湖水乳糖胆盐发酵稀释度1号管2号管3号管1 10-1 10-2不产气但有颜色变化不产气但有颜色变化不产气且无颜色变化不产气但有颜色变化不产气但有颜色变化不产气且无颜色变化不产气但有颜色变化不产气但有颜色变化不产气且无颜色变化表3 黄酒乳糖胆盐发酵稀释度1号管2号管3号管1 10-1 10-2不产气无颜色变化不产气无颜色变化不产气无颜色变化不产气无颜色变化不产气无颜色变化不产气无颜色变化不产气无颜色变化不产气无颜色变化不产气无颜色变化3.2.2 分离培养将有颜色变化的1、10-1两个稀释度的湖水发酵管分别接种于伊红美蓝琼脂平板上，于36±1℃恒温箱倒置培养18-24h。
观察菌落形态。
结果如表4所示。
表4 湖水伊红美蓝固体培养基分离培养稀释度1号管2号管3号管1 10-1有可疑菌落有可疑菌落有可疑菌落有可疑菌落有可疑菌落有可疑菌落3.2.3复发酵证实实验对分离培养得到的紫红色、具金属光泽的菌落进行革兰氏染色，同时对应接种到乳糖发酵管内进行复发酵，于36±1℃的恒温箱倒置培养24±2h，观察产气情况。
结果如表5所示，表明所有管均为大肠菌群阳性管。
查大肠杆菌最可能数(MPN)检索表可知，每100ml湖水大肠菌群最可能数（MPN）超过2400个，每100ml黄酒MPN不超过30个。
表5 湖水革兰氏染色及乳糖复发酵结果稀释度1号管2号管3号管1 10-1G-；产气G-；产气G-；产气G-；产气G-；产气G-；产气4讨论由于大肠杆菌样品处理较难,及受到灵敏度的困扰等问题，国内外研究人员已经发展了一些新方法来快速检测大肠杆菌,主要包括酶底物法、电化学方法、聚合酶链反应技术、荧光法、免疫分析法等[2]。
然而近年来随着环境污染的加剧和生态平衡的不断破坏，可导致人类感染的致病菌的种类越来越多，病原微生物对人类的威胁加大。
在食品生产、加工、储存、运输、销售等各个环节中都有被污染的可能。
而一旦污染，微生物将大量繁殖而引起食品腐败变质，或导致食源性感染和食物中毒，对人们的危害极大。
因此探索更快更精确的检验方法是社会的迫切需要。
参考文献[1]孙超, 庄惠生. 水体中大肠杆菌的检测分析新方法研究[D]. 东华大学, 2010.[2]刘亚军, 金利通. 水体中大肠杆菌快速检测方法和仪器的研究[D]. 华东师范大学, 2009.。