大肠菌群最可能数(MPN)检索表
【微生物】大肠菌群检验及注意事项
【微生物】大肠菌群检验及注意事项！大肠菌群介绍大肠菌群并非细菌学分类命名，而是卫生细菌领域的用语，它不代表某一个或某一属细菌，而指的是具有某些特性的一组与粪便污染有关的细菌，这些细菌在生化及血清学方面并非完全一致，其定义为：需氧及兼性厌氧、在37℃能分解乳糖产酸产气的革兰氏阴性无芽胞杆菌。
一般认为该菌群细菌可包括大肠埃希氏菌、柠檬酸杆菌、产气克雷白氏菌和阴沟肠杆菌等。
大肠菌群分布较广，在温血动物粪便和自然界广泛存在。
调查研究表明，大肠菌群细菌多存在于温血动物粪便、人类经常活动的场所以及有粪便污染的地方，人、畜粪便对外界环境的污染是大肠菌群在自然界存在的主要原因。
粪便中多以典型大肠杆菌为主，而外界环境中则以大肠菌群其他型别较多。
大肠菌群是作为粪便污染指标菌提出来的，主要是以该菌群的检出情况来表示食品中有否粪便污染。
大肠菌群数的高低，表明了粪便污染的程度，也反映了对人体健康危害性的大小。
粪便是人类肠道排泄物，其中有健康人粪便，也有肠道患者或带菌者的粪便，所以粪便内除一般正常细菌外，同时也会有一些肠道致病菌存在（如沙门氏菌、志贺氏菌等），因而食品中有粪便污染，则可以推测该食品中存在着肠道致病菌污染的可能性，潜伏着食物中毒和流行病的威胁，必须看作对人体健康具有潜在的危险性。
大肠菌群是评价食品卫生质量的重要指标之一，目前已被国内外广泛应用于食品卫生工作中。
大肠菌群检验方法由于大肠菌群指的是具有某些特性的一组与粪便污染有关的细菌，即：需氧及兼性厌氧、在37℃能分解乳糖产酸产气的革兰氏阴性无芽胞杆菌。
因此大肠菌群的检测一般都是按照它的定义进行。
目前国内采用的食品大肠菌群检测方法主要有国家食品药品监督管理总局发布的国家标准和国家质量监督检验检疫总局颁布的进出口行业标准。
两个标准方法在检测程序上略有不同。
但两种方法都是采用推测、验证两大步骤。
推测试验：样品稀释后，选择三个稀释度，每个稀释度接种三管LST肉汤。
36±1℃培养48±2h，观察是否产气。
10食品中大肠菌群计数测定的标准操作规程
规范食品中大肠菌群计数测定的标准操作规程。
2范围本标准规定了食品中大肠菌群（Coliforms）计数的方法。
本标准适用于食品中大肠菌群的计数。
3术语和定义3.1 大肠菌群coliforms在一定培养条件下能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧革兰氏阴性无芽胞杆菌。
3.2 最可能数most probable number，MPN基于泊松分布的一种间接计数方法。
4责任质量部组织制订、化验室负责实施。
5内容5.1 设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：5.1.1 恒温培养箱：36 ℃±1 ℃。
5.1.2 冰箱：2 ℃～5 ℃。
5.1.3 恒温水浴箱：46 ℃±1 ℃。
5.1.4 天平：感量0.1 g。
5.1.5 均质器。
5.1.6 振荡器。
5.1.7 无菌吸管：1 mL（具0.01 mL 刻度）、10 mL（具0.1 mL 刻度）或微量移液器及吸头。
5.1.8 无菌锥形瓶：容量500 mL。
5.1.9 无菌培养皿：直径90 mm。
5.1.10 pH 计或pH 比色管或精密pH 试纸。
5.1.11 菌落计数器。
5.2培养基和试剂5.2.1 月桂基硫酸盐胰蛋白胨（Lauryl Sulfate Tryptose，LST）肉汤：见附录A 中A.1。
5.2.2 煌绿乳糖胆盐（Brilliant Green Lactose Bile，BGLB）肉汤：见附录A 中A.2。
5.2.3 结晶紫中性红胆盐琼脂（Violet Red Bile Agar，VRBA）：见附录A 中A.3。
5.2.4 磷酸盐缓冲液：见附录A 中A.4。
5.2.5 无菌生理盐水：见附录A 中A.5。
5.2.6 无菌1 mol/L NaOH：见附录A 中A.6。
5.2.7 无菌1 mol/L HCl：见附录A 中A.7。
5.3大肠菌群MPN 计数法5.3.1 检验程序大肠菌群MPN计数的检验程序见图1。
MPN法测定食品中大肠杆菌群数
知识点：MPN法测定大肠杆菌群数情境：微生物检测技术任务：MPN法测定大肠杆菌群数课程：食品微生物技术MPN 法测定大肠菌群原理一、大肠菌群什么叫大肠菌群大肠菌群是一群以大肠埃希氏菌为主的需氧及兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌，在37℃生长时，能在48h内发酵乳糖并产酸产气。
二、MPNMPN❞食品中大肠菌群数是以每100 mL（g）检样内大肠菌群最近似数（The most probable number，简称MPN）表示。
❞据此含义，所有食品卫生标准中所规定的大肠菌群均应以每mL（g）食品内允许含有大肠菌群的实际数值为报告标准。
三、MPN法测定原理MPN法是统计学和微生物学结合的一种定量检测法。
待测样品经系列稀释并培养后，根据其未生长的最低稀释度与生长的最高稀释度，应用统计学概率论推算出待测样品中大肠菌群的最大可能数。
大肠菌群测定步骤1.液体样品稀释以无菌吸管吸取25 mL样品置盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）或其他无菌容器中充分振摇或置于机械振荡器中振摇，充分混匀，制成1:10 的样品匀液。
2.梯度稀释❞用1 mL无菌吸管或微量移液器吸取（1:10）样品匀液1 mL，沿管壁缓缓注入9 mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管混匀或换用1支1 mL无菌吸管反复吹打，使其混合均匀，作成1:100的样品匀液。
❞根据对样品污染状况的估计，按上述操作，依次制成十倍递增系列稀释样品匀液。
每递增稀释1次，换用1支1 mL灭菌吸管或吸头。
从制备样品匀液至样品接种完毕，全过程不得超过15min。
五、初发酵试验每个样品，选择3个适宜的连续稀释度的样品匀液（液体样品可以选择原液），每个稀释度接种3管月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤，每管接种1mL（如接种量超过1mL，则用双料LST肉汤），36℃±1℃培养24h±2h，观察倒管内是否有气泡产生，24h±2h产气者进行复发酵试验（证实试验），如未产气则继续培养至48h±2h，产气者进行复发酵试验。
014大肠菌群计数作业指导书
陕西威水饮品有限公司质量管理文件1目的：规定了公司产品检验大肠菌群（Coliforms）的计数方法.2适用范围：适用于本公司成品中大肠菌群的计数。
3编写依据：GB4789.3-2010《食品安全国家标准食品微生物学检验大肠菌群计数》. 4术语和定义:4.1 大肠菌群coliforms在一定培养条件下能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧革兰阴性无芽胞杆菌。
4.2 最可能数most probable number，MPN基于泊松分布的一种间接计数方法。
5.设备和材料：除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：5.1 恒温培养箱：36℃±1℃5.2 冰箱：2℃～5℃5.3 恒温水浴箱：46℃±1℃5.4 天平：感量0.1g5.5 均质器5.6 振荡器5.7 无菌吸管：1mL（具0.01mL 刻度）、10mL（具0.1mL刻度）或微量移液器及吸头5.8 无菌锥形瓶：容量500 mL5.9 无菌培养皿：直径90 mm5.10 pH 计或pH 比色管或精密pH 试纸5.11 菌落计数器6.培养基和试剂：6.1 月桂基硫酸盐胰蛋白胨（Lauryl Sulfate Tryptose，LST）肉汤：见附录A 中A.1 6.2 煌绿乳糖胆盐（Brilliant Green Lactose Bile，BGLB）肉汤：见附录A 中A.2 6.3 结晶紫中性红胆盐琼脂（Violet Red Bile Agar，VRBA）：见附录A 中A.36.4 磷酸盐缓冲液：见附录A 中A.46.5 无菌生理盐水：见附录A 中A.56.6 无菌1 mol/L NaOH：见附录A 中A.66.7 无菌1 mol/L HCl：见附录A 中A.7第一法大肠菌群MPN 计数法7检验程序：大肠菌群MPN计数的检验程序见图1。
图1 大肠菌群MPN计数法检验程序8操作步骤：8.1 样品的稀释8.1.1 固体和半固体样品：称取25g样品,放入盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内,8000r/min～10000r/min 均质1min～2 min,或放入盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1min～2 min，制成1:10的样品匀液。
大肠菌群最可能数(MPN)检索表
阳性管数MPN95%可信限阳性管数MPN95%可信限0.10.010.001上限下限0.10.010.001上限下限000<3.0——9.522021 4.542 001 3.00.159.6221288.794 010 3.00.1511222358.794 011 6.1 1.218230298.794 020 6.2 1.218231368.794 0309.4 3.63830023 4.694 100 3.60.1718301388.7110 1017.2 1.3183026417180 10211 3.638310439180 1107.4 1.3203117517200 11111 3.63831212037420 12011 3.64231316040420 12115 4.5423209318420 13016 4.54232115037420 2009.2 1.43832221040430 20114 3.642323********* 20220 4.542330********* 21015 3.742331460902000 21120 4.54233211001804100 212278.794333>1100420——注 1：本表采用 3 个稀释度【 0.1g(mL) 、 0.01g(mL)注 2：表内所列检样量如改用1g(mL) 、0.1g(mL) 和表内数字应相应提高10 倍，其余类推。
和 0.001g(mL)] ，每个稀释度接种0.01g(mL) 时，表内数字应相应降低3 管。
10 倍；如改用0.01g(mL)、0.001g(mL)0.0001g(mL)时，则一种微生物活菌数快速检测方法，其特征在于包括以下步骤：ａ）样品的选择：检测样品分为固体样品和液体样品；ｂ）采样样品的制备：通过无菌操作取一定量溶液样品进行离心处理后，取上清液，再以更高的速度离心处理，弃去上清液，用移液器取出底部少量溶液；ｃ）微生物活菌数的检测：将移液器取出的底部溶液，涂在载玻片上，经干燥固定，用美兰染色，冲洗后用生物显微镜镜检，记录被美兰染色且呈现空心状态的图像的个数来计数微生物数量。
大肠菌群检测作业标准书ok
大肠菌群系指一群能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌。该菌主要来源于人畜粪便，故以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量，推断食品中有否污染肠道致病菌的可能。
食品中大肠菌群数系以100mL(g)检样内大肠菌群最可能数(MPN)表示。
5.操作方法
5.1仪器：
5.1.1冰箱：0℃-4℃
下限
上限
0
0
0
0
0
0
0
0
0
1
2
3
＜30
30
60
90
＜5
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0
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2
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2
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3
3
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2
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130
160
190
1
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1
1
0
0
0
0
0
1
2
3
40
70
110
150
＜5
10
200
210
1
1
1
1
1
1
1
1
0
1
2
3
70
110
150
5.4.1.2用1mL灭菌吸管吸取1∶10稀释液1mL，注入含有9mL灭菌生理盐水或其他稀释液的试管内，振摇试管混匀，做成1∶100的稀释液。
乳与乳制品微生物检验食品中大肠菌群的检测
乳与乳制品微生物检验食品中大肠菌群的检测YLNB 3.21、引用依据：GB/T4789.3-20032、术语和定义大肠菌群：指一群能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。
该菌主要来源于人畜粪便，故以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量，推断食品中有否污染肠道致病菌的可能。
食品中大肠菌群数系以100ml(g)检样内大肠菌群最可能数(MPN表示。
3、仪器及器材3.1恒温培养箱：36 ± 1C；3.2 冰箱：0-4 C；3.3恒温水浴锅：46 ± 1C；3.4天平；3.5显微镜；3.6均质器或乳钵；3.7 灭菌平皿：直径90mm3.8 灭菌试管：18X 180 和20X 200；3.9灭菌吸管：1 ml和10 ml ；3.10灭菌广口瓶或三角烧瓶：容量为500ml ；3.11灭菌玻璃珠：直径约5mm 3.12载玻片；3.13酒精灯；3.14试管架；3.15灭菌刀、剪子、灭菌镊子等4、培养基和试剂4.1乳糖胆盐发酵管；4.2伊红美兰琼脂平板；4.3乳糖发酵管；4.4生理盐水；4.5革兰氏染色液。
5、检验程序6、方法6.1检样稀释6.1.1 以无菌操作将检样25ml （或g）放于装有225ml灭菌生理盐水或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内（瓶内预置适当数量的玻璃珠）或灭菌乳钵内，经充分振摇或研磨做成1: 10的均匀稀释液。
固体检样最好用均质器，以8000〜10000r/min 的速度处理1min，做成1: 10的均匀稀释液。
6.1.2 用1ml灭菌吸管吸取1: 10稀释液1ml,注入含有9ml灭菌生理盐水或其他稀释液的试管内，振摇试管混匀，做成1: 100的稀释液。
6.1.3另取1ml灭菌吸管，按上条操作依次做10倍递增稀释液，每递增稀释一次，换用一支1ml灭菌吸管。
6.1.4根据食品卫生标准要求或对检样污染情况的估计，选择三个稀释度，每个稀释度接种3管。
6.2乳糖发酵实验：（通常所说的假定试验：其目的在于检查样品中有无发酵产生气体的细菌）将待检样品接种于乳糖胆盐发酵管内，接种量在1ml以上者，用双料乳糖胆盐发酵管，1ml及1ml以下者，用单料乳糖胆盐发酵管。
肉制品中大肠菌群的检验—第一法大肠菌群MPN计数法
菌海砂或玻璃砂研磨，磨碎后加入灭菌水225mL，混匀后即为1:10稀释
液。或用均质器以8000~10000r/min，均质1min，做成1:10稀释液。
一、样品的采集和处理
大
肠
4.2 鲜、冻家禽检样的处理
菌
群
先将检样进行表面消毒，再用无菌剪子取检样深层肌肉25g（一般可从
MPN
胸部或腿部剪取）。其他处理同生肉。带毛野禽去毛后，同家禽检样处理。
MPN
1.2 采样过程遵循无菌操作程序，防止一切可能的外来污染。
计 数
2. 采样方案
法
2.1 根据检验目的、食品特点、批量、检验方法、微生物的危害
程度等确定采样方案。
2.2 采样方案分为二级和三级采样方案。二级采样方案设有n、
c和m 值,三级采样方案设有n、c、m 和M 值。
一、样品的采集和处理
大
第一法：大肠菌群MPN计数法
目录页
样品的采集和处理 设备和材料 培养基和试剂
大肠菌群MPN计数检样程序 大肠菌群MPN计数检样操作步骤
样品的采集和处理
一
1. 采样原则和采样方案 2. 采样用品 3. 样品的采取和送检 4. 检样的处理
一、样品的采集和处理
大 肠
1. 采样原则
菌 群
1.1 样品的采集应遵循随机性、代表性的原则。
群
样品,
MPN
若5个样品的检验结果均小于或等于m 值(≤100CFU/g),则这种情况是允许的;
计 数
若≤2个样品的结果(X)位于m 值和M 值之间(100CFU/g<X≤1000CFU/g)，
法
则这种情况也是允许的;
若有3个及以上样品的检验结果位于m 值和M 值之间,则这种情况是不允许的；