大肠菌群平板计数法
大肠菌群检测(MPN法)
大肠菌群检测(MPN法)大肠菌群检测(MPN法)是一种常用的微生物学技术，可用于检测土壤、水源、食品等中的大肠菌群进行水质和食品安全监测。
本文将介绍大肠菌群及其检测方法-最可能数法(MPN法)。
一、大肠菌群概述大肠菌群是以肠道菌属为主体的一类细菌，包括肠道埃希菌、沙门氏菌、志贺菌、伤寒杆菌等成员，它们可以在人类和动物的肠道中生存并繁殖。
在自然界中，大肠菌群也是广泛存在的微生物家族，如彗星菌、副肠杆菌、耶尔森氏菌等都属于大肠菌群。
1.菌落计数法该方法主要是利用琼脂平板培养皿在水培的条件下，大肠菌群在培养基上经不同时间的生长，形成菌落来进行菌数计数。
缺点是容易受到其他微生物的干扰，只能算出概略的数值，一定误差，没有国家标准。
2. 硝酸德钠试剂法将测样加硝酸德阳试剂进行加热，最终乳黄色的镜检测前进行比色，得出含大肠菌群的细菌群落达标后延迟显色的时间。
该方法已被最可能数(MPN)法所替代。
3. 最可能数法(MPN法)该方法先将测量的样品分别稀释到不同浓度下，再将每一份稀释液添加到以琼脂平板固化培养基为基础的不同培养液中，观察哪一份培养液出现大肠菌群的生长，最后通过MPN表格计算每85ml或100ml的水样中最可能含有的大肠菌群数量，计算公式为：10^x = n / 联合效价（即dilution rate的倒数）其中，x代表最可能数，n代表测量到大肠菌群的样品数。
在实际工作中，MPN法检测显示出了较好的结果，优点是用固定方法，可重复性好，而且可以通过相关将分析获得定量值，便于与相关的标准进行比较。
三、大肠菌群的检测范围1. 水源：大肠菌群检测是办公室里检测饮用水可能携带的最佳方法。
一般情况下，检测过程是检测水中的微生物是否合乎标准。
2.食品：由于食品生产经常存在卫生要求，因此食品也是大肠菌群检测重要的一环。
例如，必须检测火腿或肉类制品中的大肠菌群是否合格以确保食品安全。
3. 其他领域：大肠菌群检测可以用于医学、农业、环境和建筑等领域，如医院污水浑浊度的检测和土壤中大肠菌群的检测。
粪便中大肠菌群总数
粪便中大肠菌群总数
摘要：
一、大肠菌群总数的定义
二、大肠菌群总数的检测方法
1.平板计数法
2.免疫磁珠法
三、大肠菌群总数与健康关系
1.与肠道菌群平衡的关系
2.与粪便卫生质量的关系
四、大肠菌群总数的参考值
正文：
大肠菌群总数是指在一定条件下，粪便中所含大肠菌群的数目。
它是一个重要的卫生指标，用于评估人体肠道中菌群平衡状态，以及粪便的卫生质量。
大肠菌群总数的检测方法主要有平板计数法和免疫磁珠法。
平板计数法是测定大肠菌群总数的最常用方法。
它通过将粪便样品均匀涂布在含有抗生素的培养基上，然后在特定条件下培养一定时间后，对菌落进行计数。
免疫磁珠法是一种快速、灵敏的检测方法。
它通过抗体与目标菌结合，然后用磁珠捕获结合的细菌，最后通过计数磁珠的数量来推算大肠菌群总数。
大肠菌群总数与健康关系密切。
正常情况下，肠道内存在大量微生物，形成一个稳定的菌群平衡。
大肠菌群总数的变化可能影响肠道菌群的平衡，进而影响人体健康。
此外，大肠菌群总数还可以反映粪便的卫生质量。
若大肠菌群
总数过高，可能表明粪便中存在较多的致病菌，对人体健康造成潜在威胁。
根据不同国家和地区，大肠菌群总数的参考值可能有所不同。
一般情况下，大肠菌群总数应该小于10^8 CFU/g粪便。
大肠菌群平板计数法的注意事项
大肠菌群是经常用来衡量食品卫生情况的重要指标，绝大部分食品都会要求检测的项目。
在食品微生物实验室里，大肠菌群和菌落总数的检测频次应该是最高的，但检测过程中总会有一些小问题困扰着大家，以下来讲解一下大肠菌群平板计数法的注意事项。
方法选择相比于MPN计数法，平板计数法更适用于大肠菌群含量较高的食品。
但大肠菌群多少算是含量较高呢国标里没有明确规定，但通常认为，产品大肠菌群以100CFU/g（mL）为界，超过这个含量一般认为是含量较高。
但具体什么时候选用平板计数法进行大肠菌群的检测，大部分情况还是要看你的产品执行的标准。
假如产品标准要求大肠菌群含量的单位为CFU/g（mL），那必须选用平板计数法。
若是/g(mL)或者MPN/100g(mL)，就应选择MPN计数法，MPN法具体选用哪版国标此处不再赘述。
因此，根据自己产品的情况选择适当的检测方法。
培养基的要求平板计数法使用的培养基为结晶紫中性胆盐琼脂培养基，简称VRBA。
无论是国标，还是培养基的使用说明中都明确表示，VRBA是不需要进行灭菌的，煮沸2min即可使用。
特地点出这一点是因为很多朋友都在问VRBA的灭菌条件，对不灭菌的培养基不信任，害怕出现检测异常，那是因为这些小伙伴们对其中的原理不清楚。
大肠菌群的定义是在一定培养条件下能够在发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌，因此大肠菌群是不能形成芽孢的，在VRBA培养基煮沸的过程中，即使有大肠菌群存在也会被杀灭，所以从培养基带入污染的可能性是没有的。
当然盛装培养基的容器是需要进行灭菌的，以免容器引入污染。
另外，VRBA是一种选择性的培养基，含有的结晶紫对革兰氏阳性菌有比较强的抑制作用而对革兰氏阴性菌几乎没有作用，而且平板培养产生的菌落还需要进行复发酵的验证，因此VRBA培养基就不需要进行灭菌了。
但值得注意的是，VRBA需要现配现用，配制出的培养基应当在3h之内使用完毕。
稀释度的确定国标中要求选择2-3个适宜的连续稀释度。
大肠菌群平板计数法方法学验证报告
GB 4789.3-2016大肠菌群平板计数法方法学验证报告一、验证目的验证GB4789.3-2016《食品微生物学检验大肠菌群计数（大肠菌群平板计数法）》在本实验室的适用性。
二、验证方法本实验样品取不同不同类型产品进行实验，严格按照GB4789.3-2016进行，除上述实验程序外，为保证本次验证的科学性和准确性，本次实验添加阳性对照组，对照组由标准菌株大肠埃希氏菌（CICC10389）接种培养而成，与样品实验程序同时进行。
三、验证设备和试剂1.冰箱：BCD-212DG/A 海信（北京）电器2.生化培养箱：LRH-70 上海一恒科学仪器3.电位pH计：PHS-3C+（精确度0.01）成都世纪方舟科技有限公司4.无菌均质器：SCIENTZ-04 宁波新芝生物科技有限公司5.恒温振荡器：SHA-A 江苏金坛环宇科学仪器厂6.菌落计数仪：Scan-500 北京五洲东方科技发展有限公司7.天平:JE-502 上海浦春计量仪器有限公司8.超净工作台:SW-CJ-2FD 上海博迅实业9.显微镜：B203LED 重庆奥特光学仪器有限公司培养基和试剂：1.结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）北京陆桥技术股份有限公司2.煌绿乳糖胆盐（BGLB）肉汤北京陆桥技术股份有限公司3.无菌生理盐水：同GB 4789.3项下制法。
四、验证环境1.依据《消毒与灭菌效果的评价方法与标准GB15981-1995》定期对高压蒸汽灭菌锅的灭菌效果进行检测评价并记录；2.依据《无菌室消毒灭菌操作规程》定期对对无菌室、超净台进行清洁消毒灭菌并记录；3.依据《实验室质量控制规范食品微生物检测GB/T27405-2008》定期对对无菌室及超净台进行沉降菌检测并记录；4.无菌室检验：详见《xxxx》；五、验证步骤1.样品的稀释1.1 固体和半固体样品：称取25 g 样品放入盛有225 mL生理盐水的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打 1 min～2 min，制成1:10 的样品匀液。
大肠菌群计数平板法检验原始记录
样品名称
样品编号
检验项目
大肠菌群平板计数法
检验日期
检验地点
□BSL-2实验室
□洁实验净室
检验依据
判定依据
检验仪器
□生化培养箱□均质器□菌落计数仪
□生物安全柜□超净台□电子天平
□恒温振荡器□冰 箱□冰 箱
检验试剂
VRBA琼脂、BGLB肉汤、磷酸盐缓冲液或无菌生理盐水等。
h
稀释度
空白
2
25g(mL)样品+225mL稀释液均质（或原液直接检验）；
平板A1
平板A2
3
10倍系列稀释；
结果
平板B1
4
选2-3个适宜稀释度样品匀液；每梯度接种VRBA平板2个；
平板B2
结果
5
36±1℃，18-24h培养，计数典型和可疑菌落；
平板C1
平板C2
6
挑10个可疑菌落接种于BGLB肉汤管36±1℃，24-48h；
结果
平板D1
7
若BGLB肉汤管产气则阳性；
平板D2
结果
8
按比例记录结果，报告。
平板E1
平板E2
温度（℃）
相对湿度（％RH）
结果
证实实验比例
结果
报告
检验员： 审Βιβλιοθήκη 员：样品制备□固体和半固体样品：无菌称取25g，置于盛有225mL磷酸盐缓冲液或无菌生理盐水的无菌灭菌袋内，进行均质处理。
□液体样品：吸取25mL于样品于225mL磷酸盐缓冲液或无菌生理盐水中，混匀。
检验程序
大肠菌群计数[ CFU/g (mL ) ]
1
实验采集抽样方案来自GB4789.1；
大肠菌群计数
2
0
3
2
1
3
2
2
3
2
3
3
3
0
3
3
1
3
3
2
3
3
3
MPN
21 28 35 29 36 23 38 64 43 75 120 160 93 150 210 290 240 460 1100 >1100
95%置信区间
低
高
4.5
42
8.7
94
8.7
94
8.7
94
8.7
94
4.6
94
8.7 110
17
180
9
180
平板菌落数的选择
选择菌落数在30~150之间的平板，分别计 数平板上出现的典型和可疑大肠菌群菌落。
典型菌落为紫红色，菌落周围有胆盐与酸形 成的沉淀环，菌落直径为0.5mm或更大。
证实试验
从VRBA平板上挑取10个不同类型的典型和 可疑菌落，分别移种于BGLB肉汤管内，进 行证实试验。
BGLB肉汤管产气者，所对应的菌落即为大 肠菌群阳性菌落。
36℃±1℃
18~24h
计数典型和可疑菌落
注：VRBA(结晶紫中性 红胆盐琼脂)又称为： VRB或VRBL
BGLB肉汤证实试验
36℃±1℃
18~24h
报告结果
操作要点
样品稀释同第一法。
选取适宜的2~3个连续稀释度, 每个稀释度 接种两个灭菌平皿, 每皿1mL。另取1mL生 理盐水做个空白对照。将冷至46℃的结晶 紫中性红胆盐琼脂(VRBA)约15mL倾注于每 个平皿中。小心旋转平皿，将培养基与样 液充分混匀，待琼脂凝固后，再加3 mL~4 mLVRBA覆盖平板表层。
大肠菌群平板计数法实验报告
大肠菌群平板计数法实验报告
一、实验目的
本实验旨在通过大肠菌群平板计数法，检测两种不同类型的样品，分
别研究其大肠菌群的数量。
二、实验原理
大肠菌群平板计数法是一种测定复合微生物群落中不同细菌种群数量
的方法，通过在培养基上培养细菌分离特定细菌和其他微生物，然后在培
养基表面形成菌落，把形成的菌落数目统计出来就可以测定某一种细菌的
数量。
三、实验材料
1.无菌培养环：用于现场取样，主要成分是聚丙烯，尺寸为20
cm×40 cm；
2.筛选液：用于本实验的筛选液是根据微生物学原理，采用等量的乳
酸盐，氯化钠和磷酸盐等有机物质制备而成的液体，用于筛选出大肠菌群；
3.抗生素优势培养基：用于本实验，培养基由甘露醇、尿素、抗生素
等制备而成，用于培养出大肠菌群；
4.保存液：用于本实验的液体是根据微生物学原理，采用等量的乳酸盐、氯化钠和磷酸盐等有机物质制备而成，用于保存细菌；
5.透明细菌示踪液：用于本实验，示踪液由甘露醇、尿素、抗生素等
有机物质制备而成，用于追踪细菌的繁殖情况。
四、实验步骤
1.采样：用无菌环把样品和筛选液放在瓶中，搅拌均匀，然后加入适量。
大肠菌群检测中平板计数法主要操作要领
大肠菌裙检测是一项非常重要的微生物检测工作，它可以帮助我们了解环境和食品中是否存在大肠菌裙，从而保证人们的健康安全。
在大肠菌裙检测中，平板计数法是一种常用的检测方法。
下面将介绍大肠菌裙检测中平板计数法的主要操作要领。
1.准备工作在进行大肠菌裙检测之前，需要准备相应的实验器材和培养基。
实验器材包括平板计数仪、移液器、无菌培养皿等。
培养基一般选择大肠埃希氏菌（EC）培养基。
2.样品处理将待测样品取适量放入无菌容器中，进行适当的稀释。
这一步要确保样品的稀释倍数适中，以保证后续的计数结果准确。
3.接种和培养取一定量的处理过的样品，在无菌工作台上均匀涂抹于含有适量培养基的培养皿上，然后进行培养。
培养条件一般为37摄氏度，培养时间为24小时。
培养后会形成菌落，这些菌落代表了原始样品中的细菌数量。
4.计数和记录在培养后，利用平板计数仪对菌落进行计数。
计数的时候需要注意避免重复计数同一菌落，保证计数准确。
需要记录计数结果，包括菌落数量和相应的单位。
5.结果分析根据计数结果，可以对原始样品中的大肠菌裙数量进行估算。
可以通过对对照组和样品组的比较来判断样品中大肠菌裙的数量是否合格。
大肠菌裙检测中平板计数法的主要操作要领就是以上几点。
通过严格按照这些要领进行操作，可以确保检测结果的准确性和可靠性。
在进行操作过程中，还需要遵守无菌操作规范，确保实验过程中不受外界污染。
希望大家在进行大肠菌裙检测时能够严格按照操作要领进行，保证测试结果的准确性，从而更好地保障人们的健康安全。
大肠菌裙检测中的平板计数法是一种经典的微生物计数方法，它主要用于测定食品、饮用水、环境等样品中大肠菌裙的数量。
在这个过程中，我们需要注意几个关键的环节，来保证实验的准确性和结果的可靠性。
在准备工作环节，我们需要保证实验器材和培养基的质量。
实验器材一定要经过严格的消毒和清洁，以免外来细菌的污染影响实验结果。
培养基的选用也尤为重要，要选择与待测细菌的生长要求相适应的培养基，以保证细菌在培养基上的正常生长。
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大肠菌群平板计数法
一、操作步骤
1.样品的稀释
2.选取2个～3个适宜的连续稀释度, 每个稀释度接种2个无菌平皿，每皿1 mL。
同时取1mL 生理盐水加入无菌平皿作空白对照。
3.及时将15 mL～20 mL冷至46 ℃的结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）约倾注于每个平皿中。
小心旋转平皿，将培养基与样液充分混匀，待琼脂凝固后，再加3 mL～4 mLVRBA覆盖平板表层。
翻转平板，置于36 ℃±1 ℃培养18 h～24 h。
4.平板菌落数的选择
选取菌落数在15 CFU～150 CFU 之间的平板，分别计数平板上出现的典型和可疑大肠菌群菌落。
典型菌落为紫红色，菌落周围有红色的胆盐沉淀环，菌落直径为0.5 mm 或更大。
5.证实试验
从VRBA 平板上挑取10 个不同类型的典型和可疑菌落，分别移种于BGLB 肉汤管内，36 ℃±1 ℃培养24 h～48 h，观察产气情况。
凡BGLB 肉汤管产气，即可报告为大肠菌群阳性。
6.大肠菌群平板计数的报告
经最后证实为大肠菌群阳性的试管比例乘以8.3中计数的平板菌落数，再乘以稀释倍数，即为每g（mL）样品中大肠菌群数。
例：10-4样品稀释液1mL，在VRBA平板上有100个典型和可疑菌落，挑取其中10个接种BGLB肉汤管，证实有6个阳性管，则该样品的大肠菌群数为：100×6/10×104/g（mL）=6.0×105CFU/g（mL）
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精品。