松材线虫与拟松材线虫迁移能力的比较

第４７卷第８期　２　０　ｌ　１年８月　

林　业　科　学　

ＳＣＩＥＮＴＩＡ　ＳＩＬＶＡＥ　ＳＩＮＩＣＡＥ　Ｖｏ１．４７．ＮＯ　８　

Ａｕｇ．，２　０　１　１　

松材线虫与拟松材线虫迁移能力的比较　马海宾　，　梁　军　吕　全　张星耀　（１　…司林业科学研究院森林生态环境与保护研究所冈家林业局森林生态学与森林保护学重点实验室　北京１０００９ｔ；　２．中困林业科学研究院热带林业研究所广州５１０５２０）　

关键词：松材线虫；拟松材线虫；迁移；繁殖　中图分类号：￥７６３．１　８　文献标识码：Ａ　文章编号：１００１—７４８８（２０１１）０８一Ｏｌ８８—０４　

Ｃｏｍｐａｒｉｔｉｏｎ　ｏｎ　Ｍｉｇｒａｔｉｏｎ　Ａｂｉｌｉｔｙ　ｏｆ　Ｂｕｒｓａｐｈｅｌｅｎｃｈｕｓ　ｘｙｌｏｐｈｉｌｕｓ　ａｎｄ　Ｂ．ｍｕｃｒｏｎａｔｕｓ　

Ｍａ　Ｈａｉｂｉｎ　Ｌｉａｎｇ　Ｊｎｎ　Ｌａ　Ｑｎａｎ　Ｚｈａｎｇ　Ｘｉｎｇｙａｏ　（１　Ｋｅｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ）　Ｆｏｒｅｓｔ　Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ　０，Ｓｔａｔｅ　Ｆｏｒｅｓｔｒｙ　Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ，Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　Ｆｏｒｅｓｔ　Ｅｃｏｌｏｇｙ，Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ　ａｎｄ　Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ，ＣＡｂ’Ｂｅｔｔｉｎｇ　１０００９ｌ；２．Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏ，Ｔｒｏｐｉｔｉｃａｌ　Ｆｏｒｅｓｔｙ，ＣＡＦ　Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ　５１０５２０）　

Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅ　ｍｉｇｒａｔｉｏｎ　ａｂｉｌｉｔｙ　ｏｆ　Ｂ．ｘｙｌｏｐｈｉｌｕｓ　ａｎｄ　Ｂ．ｍｕｃｒｏｎａｔｕｓ　ｉｎ　Ｐｉｎｕｓ　ｔｈｕｎｂｅｒｇｉｉ　ｓｈｏｏｔ　ｓｅｃｔｉｏｎｓ　ｗａｓ　ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ　ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ．Ｃｏｍｐａｒｅｄ　ｗｉｔｈ　Ｂ．ｒｉｇ￣ｅｒｏｎａｔｕ￥，Ｂ．ｘｙｌｏｐｈｉｌｕｓ　ｐａｓｓｅｄ　ｔｈｒｏｕｇｈ　ａ　ｓｈｏｏｔ　ｓｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｐ．ｔｈｕｎｂｅｒｇｉｉ　ｗｉｔｈ　ａ　ｈｉｇｈｅｒ　ｓｐｅｅｄ　ａｎｄ　ｍｏｒｅ　ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ　ｎｕｍｂｅｒｓ　ｏｆ　ｐａｓｓｉｎｇ　ｔｈｒｏｕｇｈ　ｓｈｏｏｔ　ｓｅｃｔｉｏｎ，Ｂ．ｘｙｌｏｐｈｉｌｕｓ　ｈａｄ　ｓｔｒｏｎｇｅｒ　ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｃａｐａｃｉｔｙ　ｔｈａｎ　ｔｈａｔ　ｏｆ　Ｂ．ｍｕｃｒｏｎａｔｕｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｓｈｏｏｔ　ｓｅｃｔｉｏｎ　ｉｎ　２０　ｄａｙｓ　Ｈｏｗｅｖｅｒ，ｔｈｅ　ｓｔｒａｉｎ　Ｂｍｏ３　ｏｆ　Ｂ．ｍｕｃｒｏｎａｔｕｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｈｉｇｈｅｒ　ｍｉｇｒａｔｉｏｎ　ａｂｉｌｉｔｙ　ｔｈａｎ　ｓｏｍｅ　ｓｔｒａｉｎｓ　ｏｆ　Ｂ．ｘｙｌｏｐｈｉｌｕｓ．Ｉｔ　ｉｓ　ｃｏｎｃｌｕｄｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｃｅｌｌｕｌａｓｅ，ｔｈｅ　ｔｉｍｅ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｎｕｍｂｅｒｓ　ｏｆ　ｐａｓｓｉｎｇ　ｔｈｒｏｕｇｈ　ｓｈｏｏｔ　ｓｅｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｍｕｌｔｉｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｓｈｏｕｌｄ　ｂｅ　ｔａｋｅｎ　ｉｎｔｏ　ｃｏｎｓｉｄｅｒａｔｉｏｎ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ　ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｂ．　ｘｙｌｏｐｈｉｌｕｓ　ａｎｄ　Ｂ．ｍｕｃｒｏｎａｔｕｓ．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：　Ｂｕｒｓａｐｈｅｌｅｎｃｈｕｓ　ｘｙｌｏｐｈｉｌｕｓ；　ｒｓ０ｐ　ｅｆｅｎｃ＾“ｓ　ｍｕｃｒｏｎａｔｕｓ；ｍｉｇｒａｔｉｏｎ；ｍｕｌｔｉｐｌｉｃａｔｉｏｎ　

松材线虫病，又称松树萎蔫病、松树枯萎病，　是由松材线虫（Ｂｕｒｓａｐｈｅｌｅｎｃｈｕｓ　ｘｙｌｏｐｈｉｌｕｓ）引起的　一种毁灭性森林病害。松材线虫原来广泛分布于　北美地　，但在原产地并未造成严重危害。１９０５　年松材线虫病在日本发现后，导致当地松树严重　死亡，日本松树林遭受了毁灭性破坏（杨宝君等，　２００３）。２０世纪８０年代初，松材线虫病在我国南　京首次发现，而后快速蔓延，迄今成为我国最为严　重的林业外来有害生物，给松材线虫病害发生区　造成了严重的经济损失和生态环境压力（张星耀　等，２００３）。松材线虫病害系统存在复杂的互作关　系，包括松材线虫、拟松材线虫（Ｂ。ｍｕｃｒｏｎａｔｕｓ）、　寄主松树、媒介天牛、伴生细菌、树栖真菌及环境　因素，目前尚无有效的控制措施。　松材线虫的致病机制一直存在争论，主要有　“酶学说”、“空洞化学说”和“毒素学说”。松材线　虫的行为学同“空洞化学说”有着密切关联，成为松　材线虫病研究的热点问题之一。松材线虫侵入松树　体内后的迁移和运动，导致木质部空洞化，乃至死　亡，直接影响着松树的发病过程（Ｉｋｅｄａ，１９９６）。松　材线虫通过传播媒介，如松墨天牛（Ｍｏｎｏｃｈａｍｕｓ　ａｌｔｅｒｎａｔｕｓ）取食的松树枝条伤口侵人健康松树体内，　沿松树皮层和木质部的树脂道扩散（Ｍａｍｉｙａ，１９８５；　Ｆｕｋｕｄａ，１９９７），进而呈现不同的病理学反应。研究　松树的抗病机制和松材线虫致病机制时，松材线虫　的运动行为常被作为重要的考虑因素。Ｏｋｕ等　（１９８９）研究不同抗性松树对松材线虫反应时发现，　接种后２４　ｈ穿过煮沸过的松树枝段的松材线虫数大　于穿过活的松树枝段的线虫数，后人据此用接种后　２４　ｈ穿过松树枝段的线虫数量作为松树抗性或线　虫致病力的评价指标（Ｔｏｇａｓｈｉ　ｅｔ　ａ１．，２００３；　Ｍａｔｓｕｎａｇａ　ｅｔ　ａ１．，２００４）。本实验室前期研究发现，　仅用这一指标并不能完整反映线虫的迁移运动能　力，评价线虫的迁移行为时常出现相矛盾的结果。　因此，本研究在此基础上，选用穿过松树枝段的线虫　数量、线虫穿过松树枝段所需时间和枝段内繁殖能　力比较松材线虫和拟松材线虫的迁移运动能力，为　深入研究松材线虫在松树体内迁移扩散及致病机制　

收稿口期：２０１０—０３～ｌｌ；修回日期：２０１０—０５—０５。　基金项目：冈家十～一五科技支撑项目（２００６ＢＡＤ０８ＡＩ９１），科技部国际合作项目（２００７ＤＦＢ３０２７０）。　张星耀为通讯作者。　第８期　马海宾等：松材线虫与拟松材线虫迁移能力的比较　１８９　奠定基础。　１材料与方法　１．１　试验材料　试验用的松材线虫、拟松材线虫株　系来源见表ｌ，线虫繁殖用灰葡萄孢（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ　

ｃｉｎｅｒｅａ）菌株ＣＸＹ１２０１。线虫株系和真菌菌株均保　存在中国林科院森林生态环境与保护研究所病　理室。　黑松（Ｐｉｎｕｓ　ｔｈｕｎｂｅｒｇｉｉ）枝条采自中国林业科学　研究院院内，黑松胸径约２５　ｃｍ。　

表１供试线虫株系　Ｔａｂ．１　Ｎｅｍａｔｏｄｅ　ｓｔｒａｉｎｓ　ｆｏｒ　ｔｅｓｔ　

１．２试验方法１）线虫繁殖选用本研究室分离　保存的灰葡萄孢（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ　ｃｉｎｅｒｅａ）接种在马铃薯葡　萄糖琼脂（ＰＤＡ）平板培养基上，待菌丝长满平板后　备用。供试线虫选用本研究室收集保存的松材线虫　和拟松材线虫株系。用混合消毒法对线虫进行表面　消毒（杨宝君等，２００３），贝尔曼漏斗法分离，　２　０００　ｒ・ｍｉｎ　离　６，５　ｒａｉｎ或静止３～４　ｈ，弃上清，浓　缩收集线虫；以无菌水为介质配成松材线虫液。线　虫纯化后于室内用真菌培养繁殖。用无菌水调整线　虫液含量为Ｉ．０×１０　条・ｍＬ～，５℃保存备用。　２）植物材料准备　选天气晴朗的上午采集黑　松４年生枝条，松枝直径约１　ｃｍ；用无菌水冲洗枝　条表面，洗净后在水中剪成５　ｃｍ长的小段，用滤纸擦　干，备用。试验前用贝尔曼漏斗法确认黑松枝段内　无松材线虫。　３）线虫迁移能力　将线虫液含量调整为１．０　Ｘ　１Ｏ　条・ｍＬ　备用。将３　ｃｍ长的乳胶管套在松枝上　端，取灭菌后脱脂棉放到乳胶管内，滴入２００　ＩｘＬ混　匀的线虫液，用脱脂棉塞上乳胶管上端，滴加无菌水　保湿（王翔凤，２００７）。将松枝下端插到盛有１　ｍＬ　无菌水的５０　ｍＬ带盖锥形离心管中。置于恒温培养　箱２５℃保湿培养，每６　ｈ收集检查１次下端水液，显　微镜下观察测算线虫数量及虫龄，记录线虫各株系　最早游出线虫时间　接种２０天后用贝尔曼漏斗法　收集枝段内线虫，计数。每个线虫株系接种３条黑　松枝段，３次重复。ＳＡＳ统计分析软件对各项数据　进行统计分析和差异显著性检验。　２结果与分析　２．１　不同线虫株系穿过黑松枝段的时间　不同线　虫株系穿过黑松枝段的时间如图１所示。在所有供　试线虫中，松材线虫Ｂｘ０２株系在接种１８　ｈ后能够穿　过黑松枝段，在锥形管下端无菌水中被检出。拟松　材线虫Ｂｉｎ０３和Ｂｍ０４株系穿过黑松枝段所需时间　较长，直到接种后９２　ｈ才能在锥形管下端无菌水中　检出线虫。供试松材线虫Ｂｘ０５株系接种后７２　ｈ才　能检出线虫，所需时间比拟松材线虫Ｂｍ０２的６８　ｈ　长。试验中Ｂｘ０ｌ，ＢＸ０２，Ｂｘ０３，Ｂｘ０４，Ｂｘ０６共５个松　材线虫株系穿过黑松枝段时间均短于所有４个拟松　材线虫株系的穿过时间。　Ｂｘ０１　Ｂｘ０２　Ｂｘ０３　Ｂｘ０４　Ｂｘ０５　Ｂｘ０６　１３ｍ０ｌ　Ｂｍ０２　Ｂｍ０３　Ｂｍ０４　株系Ｓｔｒａｉｎ　图１　不ｌ司线虫株系迁移出黑松枝段时间　Ｆｉｇ．１　Ｔｉｍｅ　ｏｆ　ｎｅｍａｔｏｄｅｓ　ｐａｓｓｉｎｇ　ｔｈｒｏｕｇｈ　Ｐ．ｔｈｕｎｂｅｒｇｉｉ　ｓｈｏｏｔ　ｓｅｃｔｉｏｎ　２．２　不同线虫株系初期穿过黑松枝段的数量初次　镜检发现有线虫从黑松枝段中迁移出来后，立即显微　计数迁移出的线虫数量（图２）。所有供试线虫中，松　材线虫株系Ｂｘ０１初期迁移出黑松枝段的数量最多，　为（７．３±１．５）条，明显高于其他线虫株系，但仅是同　

∞∞∞　∞∞∈。暑　１９Ｏ　林业科学　拟松材线虫ＢｍＯ１，Ｂｍ０３，Ｂｍ０４迁移出数量差异显著　（Ｐ＜０．０５）；拟松材线虫Ｂｉｎ０１初期迁移出黑松枝段　数量最少，为（４．０±１．０）条。除松材线虫Ｂｘ０３迁移　出数量为（４．７±０．６）条，少于拟松材线虫Ｂｒｎ０２的　（５．０±１．０）条外，松材线虫初次检出穿过黑松枝段数　量均多于拟松材线虫株系。同２．１结果比较发现：　最早穿过黑松枝段的Ｂｘ０２株系，其迁移出数量并不　是最多的；Ｂｉｎ０３株系穿过黑松枝段时间是所有供试　线虫中最长的，初期检出数量亦是最少的。　｝　Ｔ　。　，　．寓．囱　．　．　ＢｘＯ１　Ｂｘ０２　Ｂｘ０３　Ｂｘ０４　Ｂｘ０５　Ｂｘ０６　Ｂｍ０１　Ｂ１１３０２　Ｂｍ０３　ＢｍＯ４　株系Ｓｔｒａｉｎ　图２　同线虫株系初期迁移出黑松枝段数量　ｆ　ｇ．２　Ｎｕｍｂｅｒ　ｏｆ　ｎｅｍａｔｏｄｅｓ　ｐａｓｓｉｎｇ　ｔｈｒｏｕｇｈ　Ｐ．ｔｈｕｎｂｅｒｇｉｉ　ｓｈｏｏｔ　ｓｅｃｔｉｏｎ　２．３　不同线虫株系在黑松枝段内的种群繁殖　接种　后２０天，用贝尔曼漏斗法分离收集黑松枝段内线虫，　统计分析不同线虫株系的种群繁殖结果（图３）。松　材线虫Ｂｘ０２株系是供试所有线虫株系中繁殖数量最　高的，其繁殖倍数达到１５倍，线虫种群数量达Ｎ３　０００　条，繁殖倍数最低的是拟松材线虫Ｂｍ０４株系，繁殖　倍数仅为１．６倍，线虫种群数仅为３３３条。松材线虫　Ｂｘ０２的繁殖数量显著高于除Ｂｘ０３之外的其他线虫　株系（Ｐ＜０．０５）。供试松材线虫ＢｘＯ１，Ｂｘ０２，Ｂｘ０３，　Ｂｘ０４，Ｂｘ０５株系的繁殖数量亦显著高于除Ｂｉｎ０３外的　３个拟松材线虫株系繁殖数量（Ｐ＜０．０５）。　｝囱　囱囱。卤。函。面　。　。画　ｆ　；　＋　｛：图３不同线虫株系在黑松枝段内繁殖数量　Ｆｉｇ　３　Ｎｕｍｂｅｒ　ｏｆ　ｎｅｍａｔｏｄｅｓ　ｍｕｌｔｉｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｉｎ　Ｐ．ｔｈｕｎｂｅｒｇｉｉ　ｓｈｏｏｔ　ｓｅｃｔｉｏｎ　３结论与讨论　本研究比较了松材线虫和拟松材线虫株系在黑　松枝段内的迁移运动能力。运用线虫穿过黑松枝段　的时间、初期迁移出线虫数量及线虫在黑松枝段内　的种群繁殖数量３个指标综合评价松材线虫与拟松　材线虫的迁移运动能力。结果显示：整体上松材线　虫在黑松枝段内迁移运动能力比拟松材线虫强。但　是具体用其中一个指标评价，不同线虫株系的表现　并不一致。本试验拟松材线虫株系Ｂｉｎ０２在穿过黑　松枝段时间和初期迁移出数量２个指标上表现分别　短于松材线虫株系Ｂｘ０５和超过Ｂｘ０３；拟松材线虫　Ｂｉｎ０３在种群繁殖指标上不仅与其他３个拟松材线　虫株系繁殖数量差异达到显著水平（Ｐ＜０．０５），而　且同一个松材线虫株系的繁殖数量也达到显著水平　差异（Ｐ＜０．０５）。　松材线虫的致病性在病理学的范畴内具有群体　效应，只有当松材线虫种群数量达到一定水平时寄　主树才会表现发病症状。运动行为是松材线虫致病　性的一种表现，受多种因素影响。苏胜荣等（２００７）　研究发现：松材线虫接种１年生抗性黑松苗，初期　松材线虫在树体内的数量少于在感病黑松体内的数　量，移动速度慢；随着时间的推移，线虫开始繁殖，　扩散能力增强。谈家金等（２００９）报道松树体内挥　发物Ｇ一蒎烯能够抑制松材线虫繁殖，但同时可增　强线虫活力以及具有诱集诱线虫的作用。因此，寄　主松树对松材线虫的迁移运动能力有明显的影响。　Ｏｄａｎｉ等（１９８５）发现松材线虫和拟松材线虫的迁移　扩散能力同线虫毒力之间有正相关性。但Ｔｏｇａｓｈｉ　等（２００３）的研究推翻了这一结论，发现线虫毒力同　线虫迁移扩散相关性并不明显，原因可能在于线虫　在枝段内轴向和径向的扩散是不同的作用机制。松　材线虫重要行为之一——聚集在松墨天牛蛹室周　围，其原因在于蛹室中具有较高含量的棕榈酸等不　饱和脂肪酸及较高的含水率，同时寄主松树、松墨天　牛和松材线虫之问存在着一些化学信息传导信号　（Ｍａｍｉｙａ　ｅｔ　ａ１．，１９７２；Ｍａｙａｚａｋｉ，１９７７）。Ｓｈｏｔａ等　（２０００）研究发现低温能够降低松材线虫的运动　能力。　本研究表明：仅以接种后２４　ｈ穿过松树枝段的　线虫数量作为评价指标，并不能正确反映寄主松树　抗性或者松材线虫的致病力。本实验室前期研究发　现：松材线虫分泌纤维素酶活力同其致病力有着密　切关系（马海宾等，２００９）。因此，评价线虫迁移运　动能力同线虫毒力的关系，应该综合考虑线虫分泌　致病性相关酶、迁移速度、群体迁移数量及繁殖能力　等。本研究结果基于试验材料为黑松枝段，并且部　分线虫株系的毒力尚未接种寄主松树验证，下一步