区分松材线虫和拟松材线虫的生化及分子鉴别方法
福建省松枯死木检测鉴定方法与结果分析
２ 检 测 、 定 方 法 鉴
２ １ 常规检 测 法 ．
即贝 尔曼漏 斗法 ， 线虫 具有趋 水性 ， 游离 于水 中 ， 由于重力 作用 沉淀 下来 。 ２１ １ 取样 ． ． 松 材线虫 的 种群数 量 在罹 病 木 中处 于 动态 变 化 之 中 Ｊ 。取 样 工 作有 一 定 的 难度 ， 定期 进行 林 间调查 ， 要 发现 疑是松 材线 虫病 木 ， 时在发 病 初期 ， 树 干 的上 （ 量 靠近 及 在 尽 第一枝 分叉处 ） 中 、 （ 出土层 ２ｃ 分别取 样 。样本 取 下 后单 独包 装 ， 、 下 高 ０ｍ） 以免互 相 感染 。记 录样本 编号 、 取样 时 间、 地点 、 树种 、 树高 、 胸径 、 龄 、 样 部 位及 有 无 松 墨天 牛 和其 它 病 虫危 树 取 害， 对样 本进 行及 时 的检 测 。未能及 时检 测 的 ， 取样 时 应 相对 大 一 点 ， 防样 本 失水 而 导致 线 以 虫死亡 ， 响检测鉴 定结果 。 影 ２ １２ 样 品制作 ．． 为 了检 测鉴定 结 果更加 准确 ， 尽量 将样本 剪切 碎 ， 以便装 满漏 斗 ， 高线 虫 提 量 。根据 漏斗 的大 小 ， 品重 １ 样 ０～１０ 。制作 每 份 样 品 之 间要 将 木 块 、 屑 清理 干 净 。对 于 ０ｇ 碎 较 干燥 的样本 ， 如包装 板 等 ， 应增 加 样 品的量 。 ２ １３ 分 离线虫 ．． 先 将清 水慢 慢注 入漏斗 中 ， 检查 是 否漏 水 ， 掉 漏斗 颈 中的气 泡 。用研 究院 ， 福建 福 州 ３０ １ ； ． ５０２ ２ 国家林业局 南方 山地 用材林 培 育重点
实验 室， 福建 福州 ３０ １ ） ５ ０ ２
松材线虫病防治实践
松树林松材线虫病防治卖践文、图/黄艳琴2()21年3月.本人参与南宁市烈士陵阮］松材线虫病防治全过程大学毕业以来.从事有害生物防治已有7年多.总结应乂寸松材线虫病的“实战”经验，我有些自己的心得体会2()14年起，全程参与第三次全国林业有害生物普查，直至2017年成果汇编,为我的职业生涯打下基础，也为我选择了主攻方向——松 树“癌症”——松材线虫病防治2018年，自治区林业局举办松材线虫病防控技术培训班,强化了我的专业知识,更坚定J'我対林业有害生物防控的信念同年4月春季，与同事前往大新县进行H常监测巡査时，期间发现不少松树发红发黄.经过现场仔细观察.发现是由于雷击造成的当时行业内有-•种共识，因雷击而死的松树不用取样因此.对其它任何原因致该现象发生 的松树.部坚持取样.唯独对宙击致死的忽略r 取样 那时.虽说我心存疑虑，却找不到明确的答案同年5丿］，广西南宁天鹰有害生物防治有28广两林业＞2022.6科学防疫鼻限公司安排我与同事到广西林科院森保所，学习松材线虫病检测/鉴定，镜检了解松材线虫的雌雄形态特征，学习如何通过线虫的阴门盖、雄虫尾部鸟爪状、雌虫尾部平缓或有点突来区分雌雄：6月，参加南宁市林业有害生物防控技术培训班暨兼职林业植物检疫员资格培训班，更多地了解松材线虫病的由来、症状，以及在普查过程中哪种情况下死亡的松树需要取样，哪种情况下死亡松树不需要取样，哪些情况需要记录等「次年4月，参加在南京林业大学举办的松材线虫病监测鉴定技术培训班，学习了松材线虫病管理对策和防治技术解读、松材线虫病流行现状与防控对策、松材线虫病野外监测技术、松材线虫取样与分离技术。
经过系列专业培训.让我在普查工作中能快速分辨松树死因，并对松材线虫病准确鉴定：在外业调查取样方面.如何应对关于线虫镜检的检测问题？普查过程中，主要从四个方面初步判断松树是否感染松材线虫病，一是外观正常.树脂分泌减少或停止，蒸腾作用下降；二是针叶开始变色.树脂分泌停止，通常能够观察到天牛或其它甲虫侵害和产卵的痕迹；三是大部分针叶变为黄褐色、萎蔦，通常可见到甲虫的蛀屑；四是针叶全部变为黄褐色.病树干枯死亡，但针叶不脱落。
松材线虫病的分布特点、危害症状及防治措施
松材线虫病的分布特点、危害症状及防治措施摘要：近年来，松材线虫病的蔓延范围越来越广泛，严重影响了生态安全。
目前来看，松材线虫病属于对森林威胁最为严重的病害之一，其传播的速度极快，因此林业管理人员应提高重视，提前做好防范措施，将松材线虫病的发生概率降到最低。
本文从松材线虫病的危害、松材线虫病的分布特点和松材线虫病防治措施三个方面加以论述，意在为林业相关人员提供参考意见。
关键词：松材线虫病；分布特点；危害；防治措施松材线虫病具有传播速度快、寄生虫种类多、死亡率高等特点，属于对森林打击最为严重的病害之一，一旦防控不及时的话，将会造成林木的大面积死亡，给当地带来巨大的经济损失，并且还会影响生态平衡。
对此，政府相关部门应加强预警，制定提前的防控措施，从根本上降低松材线虫病的发病率，构建完善的疫情防控体系，将责任落实到个人，增强使命感，最大限度上避免疫情的扩散。
1.松材线虫病的危害1.1具体病症一旦有林木感染了松材线虫病，可以看到明显的枝叶变黄，如果治疗不及时的话，将会导致林木的枯死。
1.1.1当年枯死一般情况下，当林木被感染以后，会在当年秋季枯死。
在高温干旱的天气，林木会枯死的更快，从感染松材线虫病到死亡仅仅三个月不到。
目前来看，松材线虫病的病症可以分成四个阶段，分别是：（1）前期阶段，当林木刚刚感染松材线虫病时，其树脂会变得代谢缓慢；（2）随着时间的推移，树脂的代谢会逐渐停止，树叶会变得逐渐发黄、枯萎，这时可以看到明显的寄生虫卵；（3）林木上大部分叶片会枯萎，可以看到成年寄生虫活动的痕迹；（4）树干上全部的枝叶会变得发红，直至全部枯萎，这时林木也会慢慢枯死。
1.1.2第二年枯死在气温较低的地区，一旦林木感染了松材线虫病，一般不会当年枯死，会在第二年的春季或者夏季会慢慢出现枯死的情况。
1.1.3枝干枯死在特殊情况下，林木感染了松材线虫病以后，会有一定的潜伏期，一般在1-2年内不会有特殊情况发生，只是少数的枝干会枯死，但随着时间的不断推移，枯死的枝干会逐渐增加。
松材线虫病防控技术精品PPT课件
1 松材线虫病侵染循环图
松材线虫病是由松墨天牛进行自然传播的，这种天牛在我国的分布非常 广泛。东至台湾，南至广东，西至西藏，西北至秦岭，北至河北，东北 至辽宁。均为它的适生区。
2 天 牛 传 播
Page 13
传播源
国内93.52%
国外6.48%
3 传播方式 传
播
扩
自然传播
散
人为传播
人为76.24%
区别 松材线虫病枯死
干旱枯死
整株 局部到整株
叶均匀褪绿，失水
枝条 从下部老叶开始变色，再到上部新叶 从上部新叶开始变色，再到老叶
针叶 针叶基部褪绿褐变到端部，无松脂 叶尖到叶基，基部不褐变，有松脂
2
病
死
树
初
诊
3、松材线虫病枯死树取样技术
发现松树异常枯死时，及时报告 当取地样林对业象主：管尚未部完门全，枯进死行或刚科死学不取久样。
肿腿蜂 （6-9月 天牛幼 虫期）
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松材线虫病防控措施三：持续控制
4、综合配套技术（3-10月）
人工设置立式诱木
诱捕器＋诱饵木
诱捕器＋白僵菌无纺布
Page 30
诱捕器＋立式诱木＋肿腿蜂
松材线虫病防控措施三：持续控制
5、林间卫生伐
清理疫点内衰弱 木和健康松树的枯 枝，清除松墨天牛 在林间的滋生场所
FJ-MA新一代多功能塑料轻型诱捕器与铁皮旧式诱捕器相比，平均每个塑 料诱捕器所诱捕的松墨天牛数量是铁皮诱捕器的3倍，诱捕器重量减轻了 40% 。
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松材线虫病防控措施三：持续控制 3、生物防治
白僵菌（4--6月天牛成虫期）
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绿僵菌（4--6月）
松材线虫两种实用分子检测技术
松材线虫两种实用分子检测技术陈凤毛;叶建仁;吴小芹;谈家金;黄麟【期刊名称】《北京林业大学学报》【年(卷),期】2011(33)4【摘要】为检验已开发的SCAR标记与实时PCR两种分子检测方法鉴定松材线虫的可靠性,本文选用线虫未知种样品7个以及已知种样品3个为实验材料,采用上述两种分子检测方法进行检测,并且对7个线虫未知种样品进行形态鉴定。
结果表明:1)运用SCAR标记检测,第2、3、4、7号4个未知种样品与8号松材线虫样品出现了一条清晰、明亮的860bp特异条带,第1、5、6号样品与9号拟松材线虫、10号大核滑刃线虫均未出现扩增谱带,表明第2、3、4、7号4个待测样品中含有松材线虫,而第1、5、6号3个待测样品中不含有松材线虫;2)运用实时PCR检测,第2、3、4、7号4个样品与8号松材线虫样品表现有明显的阳性扩增信号,其余样品均未出现扩增信号,也无循环阈值(Ct值);3)对7个未知种样品的形态鉴定结果为:第2、4、7号样品为松材线虫样品,3号样品中除松材线虫外还含有其他线虫,第1、5、6号3个样品不含松材线虫。
对于松材线虫的检测,两种分子检测结果与形态鉴定结果完全一致,且两种分子检测方法对松材线虫都具有很强的特异性,都可以在较短时间内对松材线虫进行鉴定。
其中SCAR标记检测方法约需2h,实时PCR检测方法约需1h。
实现了对松材线虫幼虫快速检测目标,检测结果便于判读。
【总页数】4页(P149-152)【关键词】松材线虫;实用分子技术;SCAR标记;实时PCR;检测【作者】陈凤毛;叶建仁;吴小芹;谈家金;黄麟【作者单位】南京林业大学森林资源与环境学院江苏省有害生物预防与控制重点实验室【正文语种】中文【中图分类】S763.1【相关文献】1.松材线虫分子检测技术研究进展 [J], 汤坚;陈凤毛;叶建仁;苏胜荣2.松材线虫系列分子检测技术 [J],3.“松材线虫SCAR标记与系列分子检测技术及试剂盒研制”项目通过鉴定 [J],4.3种松材线虫分子检测技术的比较分析 [J], 王焱;季镭;余本渊;林茂松;叶建仁5.“松材线虫SCAR标记与系列分子检测技术及试剂盒研制”项目通过鉴定 [J],因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
关于松材线虫病鉴定方法的商讨
个碱基的故意错配 ，设计了一对特异性引物 ，运用 均不 同松 材线 虫 和拟松 材线 虫 。此 外松 材线 虫和拟 ＰＲ Ｃ 方法 ， 最终实现 了对单条松材线虫的快速检测。 松材线虫排 泄开 口在食道与肠交接处平行位置 ， 其
（ 总第 ７ ６期）
Ｊ Ｕ Ｎ４ ＦＣ ＮＧ Ｉ Ｏ Ｅ Ｔ ＹＳ ＩＮ Ｅ４ Ｄ Ｔ Ｃ Ｏ Ｏ Ｏ Ｒ ＬＯ ＨＯ ＱＮＧＦ Ｒ Ｓ Ｒ ＣＥ Ｃ Ｎ Ｅ ＨＮ Ｌ ＧＹ
表 １ 松材 线虫 虫体测 计数 值 比较
测计项 目
— — — ～～—
— ～
南京
雌 （ Ｏ ２）
李笃肇
（ 南大 学） 西
摘 要： 松材线虫病的鉴定是根据松材线虫的形态， 这种方法虽然准确， 但受诸 多因素制约， 当务之急是 改进采样和分 离方法， 高快速鉴定水平。 Ａ 提 ＤＮ 快速检测法， 由于必须有一条松材线 虫， 因此该法实用性
不 强， 只能作 为一 项基 础研 究 。 关键 词 ： 材 线 虫病 松 鉴 定
Ｚ、 材 线 虫的 形 态特 征 是 准 确 的 鉴 定 三 、 －松 改进 鉴 定技 术提 高快速 鉴 定 水平
方 法
松材线虫病 的鉴定 ，依据松材线虫的形态特征
１ 品采集 ： 新枯 死 或萎 蔫 松株 ， ． 样 对 取样 部 位应 重点 放 在２ ｍ以上树 干及 有 天 牛刻 槽 的粗 树 上 ， 对外
明显 ， 至 肉眼看 不 见 。因此 ， 变现象 的有 无不 是 甚 兰
几种线虫形态上的差异 ：首先要 区别松材线虫 原名钝尾伞滑刃线虫与拟松材线虫病原名尖尾伞滑 刃线 虫 的 区别 ， 名思 义前 者 尾形钝 、 顾 雌虫尾 末端 宽
拟松材线虫病的危害特征及控制措施
拟松材线虫病的危害特征及控制措施摘要：拟松材线虫病是林业种植中一种常见的疾病，对其危害特征及控制措施展开探讨十分必要。
本文对拟松材线虫的基本属性及其与松材线虫的形态区别进行了介绍，并分析了拟松材线虫病的危害特征，提出了马尾松拟松材线虫病的控制措施。
关键词：拟松材线虫病；危害特征；控制措施引言马尾松是一种用途广泛、经济价值高、富含树脂的优良树种，，在华中、华南各地具有广泛的分布，同时也是松木是建筑、制板、家具以及纤维工业的重要用材。
在马尾松种植中，拟松材线虫病常有发生，导致了许多马尾松枯死，极大地影响到了马尾松的种植效益。
基于此，笔者进行了相关介绍。
1 拟松材线虫的基本属性拟松材线虫属于滑刃线虫属，是松材线虫的近缘种。
两者在其显微形态特征和生物学特性等方面极为相似，而且都具有致病力，其主要传播媒介昆虫同样也是松墨天牛。
在我国，拟松材线虫比松材线虫分布广，主要松树分布区均有分布。
拟松材线虫属于弱性寄生物类群，大多发生于受害虫危害或其他因素致死的松树或濒死松树上。
2 拟松材线虫与松材线虫形态区别拟松材线虫的雌虫和幼虫的尾部呈圆锥形，尾端有一明显的指状锐突，长约5微米左右，而松材线虫的雌虫和幼虫的尾形为广圆形或指状，无尾尖突或少有短的尾尖突（长约1微米左右）。
而且松材线虫端生交合伞为卵形，而拟松材线虫的为方形。
3 拟松材线虫的危害特征近几年来国内外的研究表明，拟松材线虫能破坏薄壁细胞，导致松树幼苗死亡，且通过接种，还能加速松树死亡，从而表明拟松材线虫也有一定的致病力。
松墨天牛能携带传播拟松材线虫，是拟松材线虫的主要媒介昆虫。
据观察，马尾松感染拟松材线虫后，其外部症状表现与松材线虫相似，首先是针叶退绿，失去光泽，后逐渐变成灰褐色、黄褐色直至红褐色，萎蔫，最后造成整株死亡。
受害针叶当年不脱落，树脂分泌减少，甚至停止。
松树木质部有蓝变现象。
4 拟松材线虫病综合控制措施4.1 检疫预防一是加强省、市、区间关卡检疫，杜绝疫区松木及其制品或包装材料携带拟松材线虫病入境；二是加强检疫检查（复检），一旦发现入境疫木，及时除害处理，同时严厉查处违规调运行为；三是加强松林疫情日常监测，及时掌握和了解疫情动态；四是增强检疫技能，熟悉掌握松材线虫病及拟松材线虫病的有关知识，以提高鉴别和除害处理能力。
松树松材线虫病的发生特点及综合防治策略
松材线虫病是对松树危害性很大的传染性疾病，被称为松树的“癌症”，引起此病的病原为松材线虫，松树感染后经过2～3个月就会死亡，而且松树感染后很难防治，松材线虫已经被列为重点检疫对象。
到目前为止，国内外许多国家都有松材线虫病的分布区。
1982年，我国首次在南京发现松材线虫病，随后，江苏、广东、山东、安徽、陕西等省市地区也相继发生，对林业的发展威胁很大。
小陇山林区虽然还没有发现此病，但是也要充分认识到该病的危害，并做好防范工作。
一、松材线虫病的发生特点松材线虫是一种从国外引进的害虫。
属于侧尾腺滑动叶片目伞叶家族。
松材线虫成虫形态细长，主要侵染松材。
松材线虫的侵染性随环境、树龄和种源的不同而略有不同。
松材线虫主要依靠昆虫传播，而松材褐公牛是主要的传播媒介。
在我国北方，每年都有一代松树褐天牛，其出苗期一般在5月中旬至6月初。
几乎所有从病树中逃逸出来的天牛都携带大量的松材线虫，每一个都携带数万条松材线虫，主要分布在天牛的气管中。
当松树褐天牛啃食松树时，它会将这种害虫接种到健康的松树上。
松材线虫从伤口侵入松材，造成松材线虫伤害，使松材线虫枯死。
第二年，松树褐甲虫也以同样的方式传播，导致病情逐渐加重、蔓延和蔓延。
在松树体内寄生的线虫种类很多，仅在中国就已经报道有40多种，其中伞滑刃属线虫16种，在松材线虫病的病害诊断过程中，准确鉴定松材线虫是十分重要的。
同为伞滑刃属的线虫，有些种类在形态上与松材线虫十分相近，在实际病害诊断中常会引起误判，如拟松材线虫与松材线虫的区别主要表现在尾部尾尖突的长短等一些细微差异上。
二、松材线虫病主要病症松材线虫在早期很难被发现。
由于检测技术落后，疾病症状不明显，难以采取及时有效的控制措施。
松材线虫的传播速度非常快，给林区的防治和预警带来了更大的困难，大多数松材线虫发生在中后期，症状复杂，不能快速诊断。
落叶松木材线虫感染可分为几种传播方式，但主要通过松木褐牛肉传播，也可通过人工木材贸易或木材运输传播。
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根据上述形态观察和测量,初步鉴定为草莓滑刃线虫,并经浙江大学郑经武教授复核确认。
3 讨论草莓滑刃线虫是一种叶和芽寄生线虫,可引起草莓春矮病(Spring Dwarf Disease ),还可侵染蕨类、百合科等47个科250多种植物。
该线虫危害草莓时,在草莓芽和叶片表面取食,造成植株发育不良,叶片发红或叶片卷曲皱缩,芽和花畸形,影响产量。
危害百合引起百合黑死病,线虫侵染导致叶片从茎基部自下而上枯死。
幼嫩梢被侵染时,线虫在生长点取食,使新梢矮缩、扭曲,不能开花。
滑刃属线虫主要特征如下:体长014～112mm ,头部通常略缢缩,口针长度10～12μm ;食道前体部圆柱形,中食道球及中食道球瓣发达,后食道腺叶发达、覆盖肠的背面;雌虫阴门位于虫体的60%～75%;后阴子宫囊通常存在并含有精子;尾圆锥形,尾端及尾尖突形态多样。
雄虫尾圆锥形,向腹面弯成钩状;交合刺玫瑰刺形,基顶及基喙通常发达;无交合伞。
Shahina 提出,按尾尖突形状及有无将滑刃属线虫分为4组:11尾简单,无尾尖突;21尾具1～2个尾尖突;31尾尖突四叉或星形;41尾尖突为其他形状。
草莓滑刃线虫被分在第2组,具有1个尾尖突。
而其他文献一般称草莓滑刃线虫尾为钝穗状或钝钉状,无任何附属物。
此次观察到的草莓滑刃线虫雌虫和雄虫均有一尾尖突。
致谢 承蒙浙江大学郑经武教授复核鉴定草莓滑刃线虫标本并提供资料,特此感谢!参考文献1 谢辉编著1植物线虫分类学1合肥:安徽科学技术出版社,20002 刘维志主编1植物病原线虫学1北京中国农业出版社,20003 Shaniha F 1A Diagnostic C ompendium of The G enus A phelen 2choides Fischer ,1894W ith S ome New Records of The groupFrom Pakistan 1Pak 1J 1Nematol ,1996,14(1):1～32区分松材线虫和拟松材线虫的生化及分子鉴别方法Ξ蒋立琴 郑经武ΞΞ(浙江大学农业与生物技术学院植物保护系,杭州310029)摘要 本文从蛋白质、激素、脂类及核酸等不同的角度,概述了松材线虫和拟松材线虫的一些生化和分子鉴别方法及其优缺点。
其中以DNA 为基础的分子诊断技术(如对rDNA 中ITS 区的PCR -RFL P 等)系目前较稳定可靠的鉴别方法;而以蛋白质为基础的单克隆抗体技术对于正确、快速地鉴别两种线虫也有极大的潜力。
关键词 松材线虫 拟松材线虫 诊断方法—78—ΞΞ联系作者收稿日期:2002-09-13浙江省自然科学基金项目(300267)和浙江省科技厅项目(2002C34003)资助 松材线虫[B ursaphlenchus xylophil us(Steiner &Buhrer ,1934)Nickle ,1970]是特大林业病害———松树萎蔫病的病原物。
我国外来的松材线虫主要是来自进口木质包装材料。
目前,我国出入境检验检疫部门多次截获到该线虫,但与松材线虫相似的拟松材线虫(B.m ucronat us )也常被检测到,而拟松材线虫对松科植物的致病力非常弱甚至近乎不致病,又常常在一些其它原因致死的松树中分离到,因此从检疫的角度,能否正确区分两种线虫就非常重要。
在日本,Mamiya 等早在1979年就提出了采用尾部的尾尖突来区分这两种线虫[1],这也是目前两种线虫鉴别中的主要形态学依据。
由于北美的松材线虫有些群体中的雌虫尾部也有尾尖突,因此从形态上要将两者正确区分开来对一些非专业从事植物线虫分类的人员是非常困难的。
除了形态学鉴定外,近十多年来发展起来的许多技术和方法对正确区分松材线虫和拟松材线虫提供了一些重要的途径。
本文概述了相关的一些研究进展。
1 蛋白质111 酶学胡凯基等(1994)[2]对松材线虫与拟松材线虫的不同株系进行多种酶电泳的研究发现,谷氨酸草酰乙酸转氨酶是唯一可区分两种线虫的酶。
该酶具有种内均一性和种间特异性,有相当的稳定性,可用于初步确定松材线虫和拟松材线虫的生化鉴定。
K ojima 等(1994)[3]对松材线虫的分泌物进行了电泳分析,结果表明:松材线虫分泌的纤维素酶的谱带类型与拟松材线虫的纤维素酶的不同,而且松材线虫分泌的纤维素酶还具有分解结晶纤维素的能力。
蒋丽雅等(1994)[4]通过对松材线虫虫体提取液和分泌液中的致病物纤维素酶的生化检测,确定了纤维素酶扩散法为其简单而灵敏的检测方法,结果显示出拟松材线虫虫体提取液和分泌液中几乎没有纤维素酶,而松材线虫则有。
故用此法对纤维素酶的测定也可将两者区分开来。
这与K ojima 的结果似乎有点不同,这可能与他们所采用的方法有关。
Noel G.R.(1998)[5]利用酯酶同工酶正确区分了大豆孢囊线虫不同分离物。
Evans (1971)[6]用酯酶也正确区分了两类密切相关的茎线虫———甘薯腐烂线虫(Ditylenchus dest ructor )和蘑菇茎线虫(D.m ycelioph 2ague )。
这方面最成功的要属酯酶在4种常见的根结线虫———南方根结线虫(Meloi dog 2yne i ncognita ),北方根结线虫(M.hapla ),爪哇根结线虫(M.javanica )和花生根结线虫(M.arenaria )的种甚至小种的鉴定和鉴别上,目前在鉴定和鉴别上述4种常见根结线虫的种和小种时,还常常应用该方法[7]。
De Guiran 等(1985)[8]用来自日本的松材线虫及拟松材线虫各一株系和来自法国的线虫作聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分析,结果发现3个线虫株系有简单的同功酶和苹果酸脱氢酶谱,并可以之相互区别。
但胡凯基等[2]对松材线虫与拟松材线虫的酯酶进行分析的结果表明:酯酶的稳定性并不好,同一株系在不同菌上培养后也有变化。
这可能与酶本身易受外界环境条件如培养线虫的条件(湿度和温度等)、提取过程及提取物的贮藏条件、分析方法及线虫本身即线虫的各发育阶段或在某一阶段线虫的生理状况的影响有关。
因此,酶虽然在密切相关的种类间保持着高度保守性,但由于上述因素,利用电泳分析线虫蛋白易导致结果的不稳定性。
因而采用该方法进行种类鉴定尽量用线虫相同的发育阶段,以便减少误差。
112 血清学方法利用血清学技术和方法进行种类鉴定,其所需蛋白量少,测定结果也不会受到线虫的生理状态如卵的滞育的影响,而且能在短时间内快速完成。
该技术在根结线虫和孢囊—88—类线虫方面探索较早、应用也较多、技术也相应比较成熟,这与易从这两类线虫中分离各个发育阶段的线虫有关。
在松材线虫及近似种的鉴别上也有报道。
11211 多克隆抗体技术Lawler C.等(1993)[9]研究结果表明:松材线虫与拟松材线虫的多克隆抗体可用Western杂交将两者区分开来,用酶联免疫吸附法EL ISA却不易将两者区分开,这说明虽然EL ISA的敏感度高,但种间区分度并不好,这跟多克隆抗体的特异性差有关。
但免疫后获得的多克隆抗体的带型表明:日本和美国的松材线虫分离物与加拿大分离物比起来其亲缘关系更近。
11212 单克隆抗体技术与多克隆抗体相比,单克隆抗体的特异性与敏感性均较好,而且不易发生交叉反应。
应用单克隆抗体技术在一些重要的植物寄生线虫的鉴定中已有成功先例,如Arjen Schots 等[10]应用单克隆抗体技术区分出马铃薯金线虫(Globodera rostochiensis)和马铃薯白线虫(G.palli da),其他如大豆孢囊线虫(Het2 erodera glyci nes)和南方根结线虫(M.i ncog2 nita)也有过单克隆抗体技术的应用。
作为一种快速、准确且灵敏的检测方法,应用单克隆抗体技术在松材线虫与拟松材线虫种的鉴别上有非常大的发展前景,目前我们所在的实验室正在进行此方面的研究。
2 激素Riga(1992)[11]研究表明,松材线虫与拟松材线虫产生的性外激素具有种特异性,即松材线虫或拟松材线虫只有各自的雌虫才能吸引各自相应的雄虫,这是各自雌虫释放性外激素引起的反应。
因此可利用测定性外激素来区分两者。
另外,可针对其性外激素作进一步的分析,比如成分、性状,是否借此可对两者进行区分有待于进一步的研究。
3 脂类Krusberg等(1973)[12]报道南方根结线虫和花生根结线虫的成熟雌虫和卵的脂肪酸性质相同,但是两种线虫中某种脂肪酸的含量不同,因此可以以此来区分两种线虫。
目前尚未见有用脂类来区分松材线虫与拟松材线虫的报道,在这方面是否可行,也可进行一番尝试。
4 核酸随着近几年分子生物学技术的迅猛发展,以DNA为基础的诊断,在线虫分类鉴定中的作用也与日俱增,在许多植物线虫类群中已建立了较成熟的分子诊断系统[13]。
早期研究曾有通过制备特异性DNA探针及杂交技术来区分松材线虫与拟松材线虫的;另外利用DNA指纹技术,像RFL P(限制性内切酶片断长度多态性,就是利用靶DNA经限制性内切酶的酶切片段的数量差异及不同迁移率来区分线虫[14],但是这些早期的研究是以线虫基因组DNA为靶DNA,故利用限制性酶切和DNA探针杂交的方法需要较大量的线虫样品,操作复杂,而且可能要接触同位素,一定程度上限制了其应用。
RAPD技术是在PCR基础上演化而来的,也可用来鉴定两种线虫[15],但由于所用为单一引物,序列短,稳定性不好,近年来也较少被采用。
目前广泛采用的是PCR—RFL P对rDNA中ITS区的测定与分析[16];张立海等[17]尝试了用PCR—SSCP(单链构象多态性)技术对rDNA进行分析,实验结果表明,由于松材线虫与拟松材线虫在rDNA中的ITS1区存在着碱基差异性———30～40bp,而PCR—SSCP 检测DNA的碱基为400bp左右,因此这种差异可大幅度改变单链DNA的构象及迁移率,从而使之被检出,将两种线虫区分开来;此外,根据松材线虫和拟松材线虫两种间一些特异性的DNA序列,设计特异性的引物来进行特异性的扩增也可以达到鉴别两种线虫的目的[18]。
—98—综上所述,应用各种生化技术和各种分子生物学技术有助于松材线虫与拟松材线虫的鉴别。
利用生化技术为依据的鉴定方法时,要注意采用的样品具相对稳定性,对环境影响不敏感,而且与其它特征建立的分类系统相关。
在这些生化技术和分子鉴别方法中,尤其是以蛋白质为基础的单克隆抗体技术及以DNA 为基础的PCR 技术对两种线虫的鉴定和鉴别更是有着广泛的前途。
同时挖掘其他的一些新的分析方法,将各种方法和手段综合起来进行考虑,对松材线虫———这一国际的植物检疫对象的快速、准确的鉴定有着极为重要的意义。
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