突破衍射极限的超高分辨率成像技术发展 (修改)
超分辨显微镜的工作原理与成像技术
超分辨显微镜的工作原理与成像技术超分辨显微镜是一种先进的光学显微镜，具有很高的分辨率和成像能力，可以观察到微观领域中细小的结构和现象。
本文将介绍超分辨显微镜的工作原理和成像技术，以及其在生物医学、材料科学和纳米技术等领域的应用。
一、工作原理超分辨显微镜的工作原理基于曲折规律和波的衍射。
传统光学显微镜由于照明光束的衍射限制，无法分辨出比光的波长还要小的物体细节。
而超分辨显微镜通过使用特殊的技术，克服了这一限制。
1.1 衍射极限传统光学显微镜的分辨率受到衍射极限的限制。
衍射极限（称为耐克斯特准则）是由德国物理学家安德烈亚斯·耐克斯特提出的，规定了光学系统能够分辨物体的最小尺寸，即0.61倍的照明光波长。
超过这个极限，显微镜就无法分辨出物体的细节。
1.2 超分辨技术超分辨显微镜采用了多种技术来突破衍射极限，实现更高的分辨率。
其中最常见的技术包括：1.2.1 利用荧光标记超分辨显微镜可以通过利用荧光标记结合合适的成像技术，将被观察物体的特定部分标记出来，并对其进行成像。
这些标记物在光的刺激下会发出荧光信号，通过检测和分析这种信号，可以实现纳米级的分辨率。
1.2.2 利用近场效应近场光学显微镜利用装载在探针尖端的金属纳米结构，利用探针与样品之间的极短距离来增强照明光的局部电场，从而实现超分辨成像。
这种技术在表面等离子激元共振和原子力显微镜中得到广泛应用。
1.2.3 利用建构性干涉通过将两束光进行干涉，可以在显微镜中形成特定的干涉模式。
这种模式包含了被观察物体的高频细节信息。
运用适当的算法和数学处理，可以从干涉模式中提取出高分辨率的图像。
二、成像技术超分辨显微镜采用多种成像技术来获取高分辨率图像。
以下是几种常用的成像技术：2.1 结构光成像结构光成像利用相干光束通过物体表面，通过记录物体与光束的相互作用，实现高分辨率的三维成像。
利用这种技术，可以获得具有亚微米分辨率的物体表面拓扑图像。
2.2 荧光成像荧光成像是利用带有荧光标记的样品在激发光线照射下发出的荧光信号进行成像。
高分辨率成像技术及其应用
高分辨率成像技术及其应用随着科技的不断发展和进步，高分辨率成像技术成为了现代工程与科学领域中不可或缺的一部分。
本文将介绍高分辨率成像技术及其应用，包括原理、方法和实际应用领域。
一、高分辨率成像技术的原理高分辨率成像技术是指通过利用特殊的仪器和方法，以高精度获取目标物体的图像细节。
其原理主要基于以下几个方面：1. 光学原理：高分辨率成像技术利用光学原理，通过控制光的传播和收集，进而提高图像的清晰度和细节。
2. 探测器技术：高分辨率成像技术利用高性能的探测器，能够更准确地捕捉目标物体反射或发射的能量，并将其转化为数字信号，以获得更高的图像质量。
3. 信号处理：高分辨率成像技术利用信号处理技术对采集到的图像数据进行降噪、增强和重建等处理，以获得更清晰、更细节丰富的图像。
二、高分辨率成像技术的方法高分辨率成像技术有多种方法，常见的包括：1. 光学显微镜：光学显微镜是最基本的高分辨率成像技术之一，通过将目标物体放大并观察光的散射或透射，以获取高精度的图像。
2. X射线成像技术：X射线成像技术通过利用X射线的穿透能力，可以观察到物体的内部结构和组织，广泛应用于医学、材料科学等领域。
3. 磁共振成像技术（MRI）：MRI利用强磁场和无线电波的相互作用，可以获得人体或物体的高分辨率图像，非常适用于医学诊断和研究。
4. 红外成像技术：红外成像技术通过探测物体发出或反射的红外辐射，可以观察到物体的热分布情况，广泛应用于军事、安防等领域。
三、高分辨率成像技术的应用领域高分辨率成像技术由于其高度精确和细节丰富的特点，被广泛应用于以下领域：1. 生命科学：高分辨率成像技术在生命科学研究中起着重要作用。
例如，在细胞学研究中，高分辨率显微镜可以观察到细胞的微观结构和功能，帮助科学家深入了解细胞的机制。
2. 医学诊断：高分辨率成像技术在医学诊断中具有重要意义。
例如，X射线和MRI技术可以提供人体内部的详细图像，帮助医生准确诊断疾病并提供最佳处理方案。
STED超分辨成像技术
STED超分辨成像技术超分辨光学成像超分辨光学成像特指分辨率打破了光学显微镜分辨率极限（200nm）的显微镜，技术原理主要有受激发射损耗显微镜技术和光激活定位显微镜技术。
简介光学显微镜凭借其⾮接触、⽆损伤等优点，长期以来是⽣物医学研究的重要⼯具。
但是，⾃1873年以来，⼈们⼀直认为，光学显微镜的分辨率极限约为200 nm，⽆法⽤于清晰观察尺⼨在200 nm以内的⽣物结构。
超分辨光学成像(Super-resolution Optical Microscopy)是本世纪光学显微成像领域最重⼤的突破，打破了光学显微镜的分辨率极限（换⾔之，超越了光学显微镜的分辨率极限，故被称为超分辨光学成像），为⽣命科学研究提供了前所未有的⼯具。
光学显微镜的分辨率1873年，德国物理学家恩斯特·阿贝(Ernst Abbe)提出，光学显微镜受限于光的衍射效应和光学系统的有限孔径，存在分辨率极限（也称阿贝极限），其数值约为l / 2NA（分辨率极限公式），其中l是光波波长，NA是光学系统的数值孔径（Numerical Aperture）。
, n为介质的折射率，a为物镜孔径⾓的⼀半。
成像时若使⽤波长为400 nm的光，并采⽤空⽓（折射率为1）作为物镜和样本之间的介质，可计算得到分辨率极限为200 nm。
因此，我们通常说，光学显微镜的分辨率极限约为200 nm。
此后的研究表明，光学显微镜的分辨率决定于光学系统中聚焦光斑（称为艾⾥斑, Airy disc）的尺⼨。
另外，当⼀个艾⾥斑的边缘与另⼀个艾⾥斑的中⼼正好重合时，此时对应的两个物点刚好能被⼈眼或光学仪器所分辨（这个判据称为瑞利判据，Rayleigh Criterion）。
利⽤瑞利判据以及艾⾥斑的数学表达式，我们可以得到光学显微镜的分辨率公式：0.61λ/NA。
值得指出的是，光学显微镜的分辨率公式跟前⾯提到的分辨率极限公式有所不同，⽽前者更⼴泛的被光学成像领域使⽤。
突破光学分辨率极限的方法
突破光学分辨率极限的方法在日常生活中，我们用肉眼能够看到被光照射的物体，一个主要的因素就是分辨率，它是衡量我们能够分辨出两个物体之间最小距离的度量。
然而，随着科技的发展，人们对分辨率的需求越来越高，而光学分辨率的极限又已经被突破，这让很多科学家对探索更加微小的事物感到着迷。
在此，我们将探讨几种突破光学分辨率极限的方法。
超分辨率显微镜超分辨率显微镜是一种使用荧光标记的技术，通常被用来对细胞和单细胞结构以及蛋白质运动性质的研究。
与传统显微镜不同的是，超分辨率显微镜在成像时用到了亚波长光源，这意味着可以突破传统光学分辨率极限。
此外，不同于传统显微镜，超分辨率显微镜可以在非活动生物组织中使用，让科学家们能够对其进行更深入的研究。
透射电子显微镜透射电子显微镜是一种专业的仪器，用于成像具有纳米级结构的样本。
它能够使用电磁透镜来聚焦电子束，使其成像，电子束的波长比光长得多，因此可以突破光学分辨率极限。
此外，样品也可以进行旋转、倾斜和对接等操作，使它在结构和功能上的研究更为完整。
透射电子显微镜通常用于研究晶体、配位化合物和生物分子等物质。
尽管它在范围和可靠性方面进行了很大的改进，但还需要更多的工作来解决特定样品性质的挑战。
计算显微镜随着计算机技术的发展，出现了一种称作计算显微镜的技术，它可以通过组合多个图像以增加图像的分辨率。
计算显微镜使用的技术不涉及在成像过程中使用高分辨率电子束或亚波长光源，而是将多个图像以不同的方式进行组合，从而提高分辨率。
尽管这种方法主要用于处理生物样品，但它也能够被用于其他科学领域，比如纳米线、金属薄膜和半导体材料等的表征。
总的来说，突破光学分辨率极限的方法有很多种，其中涉及到了多种技术和方法，这些技术和方法给科学家们提供了新的突破光学分辨率的思路，为研究更微观的事物打开了新的大门。
尽管这些技术都有其自身的优缺点，但它们都在加速科研的进程，让我们对这个世界有了更深入的认识。
衍射极限艾里斑分辨率-概述说明以及解释
衍射极限艾里斑分辨率-概述说明以及解释1.引言1.1 概述在概述部分，我们将介绍衍射极限艾里斑分辨率这一主题的背景和重要性。
衍射极限艾里斑分辨率是一种用于评估和描述光学系统分辨能力的指标。
光学系统的分辨能力是指其能够将空间中两个点状物体分辨为两个离散的点的能力。
衍射极限艾里斑分辨率的概念源于19世纪的衍射理论和光的波动性质。
根据衍射理论，当光束通过一个孔径较小的光学系统时，光的波动会导致光斑的扩散和干涉现象，从而限制了系统的分辨能力。
艾里斑分辨率是一种经典的衡量光学系统分辨能力的方法。
它是由物理学家Ernst Abbe于1873年提出的，并以他的名字命名。
艾里斑分辨率的计算基于光学系统的参数，包括光的波长和系统的数值孔径。
衍射极限艾里斑分辨率在科学研究和实际应用中具有重要意义。
在生物医学领域，它可以用于评估显微镜的分辨能力，进而实现对细胞和组织结构的高分辨率成像。
在光刻技术中，艾里斑分辨率的理论极限可以指导光刻机的设计和性能改进。
然而，衍射极限艾里斑分辨率也存在一定的局限性。
实际光学系统往往受到各种因素的限制，如光的衍射、散射、畸变等，这些因素会降低系统的实际分辨能力。
因此，进一步研究和改进光学系统，以提高其分辨能力成为未来发展的方向。
在接下来的文章中，我们将详细介绍衍射极限的定义和原理，以及艾里斑分辨率的概念和计算方法。
我们还将讨论衍射极限艾里斑分辨率在不同领域的应用，并探讨其存在的局限性和未来的发展方向。
通过对这一主题的全面了解，我们可以更好地理解光学系统的分辨能力，并为相关领域的进一步研究和应用提供指导。
1.2文章结构文章结构部分的内容可以是对整篇文章的组织和布局进行介绍。
可以提及文章的各个章节主题、内容概要以及各个章节之间的逻辑关系等。
以下是关于文章结构部分的一个示例：第2节正文部分是本文的核心内容，将详细介绍衍射极限和艾里斑分辨率的定义、原理和计算方法。
通过对衍射极限的研究和艾里斑分辨率的计算，我们可以更好地理解光学成像中的分辨率限制和相关原理。
医学影像学前沿技术发展
构建医学知识图谱，将医学知识和 经验以图谱的形式进行表达和存储 ，为人工智能辅助诊断系统提供强 大的知识支持。
在医学影像诊断中应用场景举例
肺结节检测
利用人工智能辅助诊断系统对CT 影像进行自动分析，能够快速、 准确地检测出肺结节，提高诊断
效率和准确性。
乳腺癌诊断
通过对乳腺X线摄影（钼靶）影 像的自动分析，能够辅助医生进
特点
该技术具有非侵入性、实时性、连续性和可重复性等优点，能够减少患者的痛苦和感染风险，提高诊断的准确性 和效率。
在不同疾病监测中应用价值
1 2 3
心血管疾病
实时监测心血管功能，评估心脏负荷、心肌供血 和心脏电生理等，对预防和治疗心血管疾病具有 重要意义。
神经系统疾病
通过监测脑血流、代谢和神经电生理等指标，评 估脑功能和神经损伤程度，指导神经系统疾病的 诊断和治疗。
医学影像三维重建技术
利用计算机图形学和图像处理技术，对医学影像进行三维重建，实现病变的三维可视化 ，有助于医生更直观地了解病变情况。
未来发展趋势预测与挑战分析
• 人工智能与医学影像学的深度融合：随着人工智能技术的不断发展，未来医学 影像学将更加依赖人工智能技术，实现自动化、智能化的诊断和治疗。
• 医学影像大数据分析与挖掘：随着医学影像数据的不断积累，未来将通过大数 据分析和挖掘技术，发现更多疾病与影像特征之间的关系，为精准医疗提供有 力支持。
特点
该技术能够提供更丰富的病灶信息，提高诊断的准确性和可 靠性；同时，多模态融合成像技术还具有无创、无辐射等优 点，为疾病的早期发现和精准治疗提供了有力支持。
在不同疾病诊断中应用价值
神经系统疾病
多模态融合成像技术能够清晰显示脑 组织的结构和功能，对于脑肿瘤、脑 血管疾病等神经系统疾病的诊断具有 重要价值。
衍射极限1.13
衍射极限是指一个理想点物经光学系统成像，由于衍射的限制，不可能得到理想像点，而是得到一个夫朗和费衍射像。
因为一般光学系统的口径都是圆形，夫朗和费衍射像就是所谓的艾里斑。
这样每个物点的像就是一个弥散斑，两个弥散斑靠近后就不好区分，这样就限制了系统的分辨率，这个斑越大，分辨率越低。
这个限制是物理光学的限制，是光的衍射造成的。
这种衍射限制本质上来源于量子力学中的测不准关系限制。
对于给定频率的光子，当它在某个方向上的动量范围给定时，它的分辨率也就定了。
一般当一个艾里斑的中心和另一个艾里斑的边缘暗环刚好重合时，认为两个像斑刚好能够分辨（瑞利判据）。
这一现象用傅立叶分析理论可解释为：携带物体信息的入射光波的傅立叶分量中，较大的横向分量对应着高频成分，代表着物体的细节部分；但含高频横向分量的光波因满足2222x y k k w c +〉 (k x 、k y 为波矢量K 在x和y 方向分量，ω为光波角频率、c 为光速，传播方向为z 轴)而成为倏逝波，倏逝波在传播过程中因振幅呈指数衰减而无法到达像面，不能参与成像，造成物体细节部分的丢失，因而普通透镜的成像总是有缺陷的。
图1. 艾里斑图形（三维强度值和和平面图像）衍射极限公式是sinθ=1.22λ/D 。
其中θ是角分辨率，λ是波长，D 是光圈直径。
当θ很小时，sinθ约等于tanθ，约等于d/f ，其中d 是最小分辨尺寸，f 是焦距。
推导出d/f=1.22λ/D 。
显微镜的可分辨的最小线度为：δy=0.61λ/N.A.，其中N.A.为镜头的数值孔径。
目前，普通显微镜的分辨率一般为200nm 以上。
突破衍射极限：在物理概念上从只使用实数推广到使用虚数；从物理上讲，属于从传统中那样使用实光子辐射场推广到使用非辐射的虚光子场（不在光子质壳上的光子都是虚光子），前者就是传统中的光学成像，后者则属于近场成像。
产生电磁波的源都可以称为天线。
天线产生辐射远场和非辐射近场，前者包括我们通常看到的一束光，它在真空中传播，幅度不会衰减；后者则随空间距离迅速衰减，主要局域于天线附近，属于局域性的电磁波，或者附在材料表面附近的“表面波”。
光学成像在生命科学中的应用,从2014年诺贝尔奖纳米显微镜技术谈起
400年前，显微镜发明
第一次打开了人类认识微观世界的大门 开启了人类生命与生活的重要内容
Robert Hooke
1665
软木的木栓组织 上的微小气孔
• 1665 年，Robert Hooke(胡克)：「细胞」名词便是由虎克利用 显微镜观察软木的木栓组织上的微小气孔而得来的。 • 1674 年， Leeuwenhoek( 列文虎克 ) ：发现 了原生动物，并随后首次发现「细菌」。
三、突破衍射极限成像
阿贝衍射极限
德国科学家阿贝，1873
能看多小？
阿贝衍射极限
显微镜可分辨的最小线度为： L =0.61λ/N.A. N.A.为镜头的数值孔径。 可见光：380～780nm 普通显微镜的分辨率一般为 200nm以上。
斯特凡⋅赫尔的受激发射损耗 (STED)
STED 扫描成像过程
• 1930年，Lebedeff(莱比戴卫)：搭建第 一架干涉显微镜，同时Zernike(卓尼克) 在1932年发明出相位差显微镜，适用于 观察活细胞和未染色标本。
• 1952 年， Nomarski( 诺马斯基 ) ： 发明微分干涉相位差光学系统。 适用于观察活细胞的种种细节。
• 1988 年 ， Confocal 扫 描 显 微 镜被广为使用。既可以用于 观察细胞形态，也可以用于 进行细胞内生化成分的定量 分析、和实现长时间活细胞 动态观察。 • 1990年，发展了非线性光学多 光子显微成像技术。适用于生 物细胞、活组织的长时间动态 三维成像。
射频波段 核磁共振谱学及成像 —— 波谱学技术的代表之一
Isidor Isaac Rabi
Felix Bloch
Edward Mills Purcell
气态原子磁共振 1944年诺贝尔物理学奖
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结课论文题目突破衍射极限得超高分辨率成像得技术进展学生姓名学号学院专业班级二〇一五年十二月一引言1.1选题意义光学显微成像具有极为悠久得历史,但一直以来，光学成像一直受到衍射极限得限制而分辨率无法突破２0０nm.后来虽然有了电子显微镜、核磁共振显像、x光衍射仪等微观观测或者显像设备,但就是使用光学显微镜可以在活体状态下观察生命体使得其在生物、医学观察方面仍有巨大优势。
值得庆贺得就是近年来，超高分辨率显微技术得发展使得光学显微成像分辨率达到了2０nm以下。
其中德国科学家Stｅfａn Helｌ、美国科学家ErｉｃＢetzig与Wiｌｌiam Mo ｅｒｎer因其在超高分辨率显微技术方面得突出贡献获得了2014年得诺贝尔化学奖。
在这篇文章中，我们就简要介绍一下超高分辨率显微技术得发展与应用,并对诸位大师致以敬意.1.2 技术指标显微技术成像优劣一般通过X-Y 平面分辨率与Ｚ轴分辨率大小来判定,分辨率越高数值越小.下表就是各种显微成像技术得分辨率指标。
二 衍射极限2、1 衍射极限我们能瞧到什么?瞧到多小得范围?瞧得有多清楚？几百年来,依靠不断进步得科学手段，微观世界正一层层揭开面纱，让人们可以瞧得越来越“小”,进而可以进行研究。
人得肉眼能分辨0、１毫米尺度得物体，再小，就要借助工具。
1665年，英国科学家罗伯特·虎克制造了第一台用于科学研究得光学显微镜,用它观察薄薄得软木塞切片。
虎克瞧到了残存得植物细胞壁，它们一个个像小房间一样紧挨在一起,这就就是“细胞”一词得由来。
此后，显微镜制造与显微观察技术得迅速发展,帮助科学家第一次发现了细菌与微生物。
那么,光学显微镜就是否可以无止境地“放大"下去，让我们想瞧到多小就能瞧到多小？科学家为成像技术 Ｘ-Ｙ平面分辨率(ｎm) Z 轴分辨率(n ｍ) 普通光学显微镜 2０0－30０ 5０0—７0０4Pi 显微镜 1００-15０STED 显微技术 50—70 ST ＥD ＋４技术 50 50 ＰAL Ｍ技术 20 3０ 3D ST ＯＲM 技术 20—3０ 50—6０ ｄSTORM 技术 30 50 2D SSI Ｍ技术 ５0 3Ｄ SSI Ｍ技术 100 2０0 电子显微镜 ０、０5 X 光衍射仪 0、0３—10此做了很多尝试，最终发现,存在一道法逾越得“墙"—衍射极限.ﻫ 1873年，德国科学家阿贝提出了衍射极限理论：光就是一种电磁波,由于存在衍射，一个被观测得点经过光学系统成像后，不可能得到理想得点，而就是一个衍射像，每个物点就像一个弥散得斑,如果这两个点靠得很近,弥散斑就叠加在一起，我们瞧到得就就是一团模糊得图像。
阿贝提出，分辨率得极限近似于入射光波长得二分之一（d=λ/2）。
可见光得波长通常在380～780纳米之间，根据衍射极限公式,光学显微镜得分辨率极限就在200纳米（０、2微米)左右。
如果物体小于0、２微米，您仍旧瞧到得就是一个模糊得光斑。
这就就是很长一段时间内,光学显微镜得分辨极限—-衍射极限。
2、2 突破衍射极限为了更深入得观察世界,后来有了电子显微镜、核磁共振显像、x光衍射仪等微观观测或者显像设备,人们借助它们可以瞧得更“细”。
但就是这些设备依然没有突破衍射极限，她们依然遵循着阿贝衍射极限。
这些设备使用得就是电子束等波长非常短得入射光,自然,它们得分辨率就高。
比如电子显微镜,分辨率可以达到0、5埃（一埃等于十分之一纳米)，这样就可以瞧到一粒一粒得原子。
由于生物学、医学方面得研究，更希望在生命体存活得自然状态下进行观察，在这方面，光学显微镜有它不可比拟得优势。
因此,光学显微镜得研发还就是世界科学家得研究热点.突破性得进展发生在本世纪初，近年来,随着新得荧光探针与成像理论得出现,研究者开发了多种实现超出普通共聚焦显微镜分辨率得三维超分辨率成像方法。
较成熟得有基于单分子成像得超分辨率显微成像方法，包括光激活定位显微技术（pｈotｏaｃtivatｅd ｌｏcalizaｔioｎmicroscopy, PALM）与随机光学重构显微技术（stochａstｉｃoptical reconstruction microｓcｏpｙ, STOＲM)。
以及两大类通过改造光源得点扩散函数来提高成像分辨率得方法，分别就是受激发射损耗显微技术（stimulａted emiｓsｉon dｅpｌｅtiｏn，STEＤ）与饱与结构照明显微技术。
（参考文献:吕志坚，陆敬泽、几种超分辨率荧光显微技术得原理与近期进展)以上这些进展,都让光学显微镜突破了衍射极限，我们称之为“超分辨成像技术”。
美国光学学会把它列为2１世纪光学五大研究计划之首。
三超高分辨率显微技术3、1光激活定位显微技术PALM当显微镜需要分辨两个或者更多点光源得时候，很难突破光学分辨率得极限来进行精确定位．而当显微镜得物镜视野下仅有单个荧光分子得时候,通过特定得算法拟合,此荧光分子位置得精度可以很容易超过光学分辨率得极限,达到纳米级．如上所述,尽管单分子得定位精度可以达到纳米级，但它并不能提高光学显微镜在分辨两个或者多个点光源时得分辨率。
200２年，P ａtteｒsｏｎ与Lippincott-Sｃhwａrtz首次利用一种绿色荧光蛋白(GＦP)得变种(PＡ-ＧFP)来观察特定蛋白质在细胞内得运动轨迹．这种荧光蛋白PＡ－GFP在未激活之前不发光,用405nm得激光激活一段时间后才可以观察到48８nｍ激光激发出来得绿色荧光。
德国科学家EｒiｃＢetｚｉｇ敏锐地认识到，应用单分子荧光成像得定位精度，结合这种荧光蛋白得发光特性,可以来突破光学分辨率得极限．200６年9月, Betzig与Ｌippｉｎcoｔt－Sch ｗartｚ等首次在Ｓcience上提出了光激活定位显微技术( ｐｈotｏactivatｅd l ｏcalizａtioｎmiｃroscoｐy, ＰALＭ) 得概念．其基本原理就是用PA-GFP来标记蛋白质，通过调节405 ｎm激光器得能量，低能量照射细胞表面，一次仅激活出视野下稀疏分布得几个荧光分子，然后用４８8 nｍ激光照射，通过高斯拟合来精确定位这些荧光单分子。
在确定这些分子得位置后, 再长时间使用4８8 nm激光照射来漂白这些已经定位正确得荧光分子，使它们不能够被下一轮得激光再激活出来．之后，分别用4０5 nｍ与48８nm激光来激活与漂白其她得荧光分子,进入下一次循环。
这个循环持续上百次后,我们将得到细胞内所有荧光分子得精确定位.将这些分子得图像合成到一张图上, 最后得到了一种比传统光学显微镜至少高１0 倍以上分辨率得显微技术，如图 1 所示。
PALM显微镜得分辨率仅仅受限于单分子成像得定位精度,理论上来说可以达到1ｎｍ得数量级.200７年，Bｅtzig 得研究小组更进一步将PALM 技术应用在记录两种蛋白质得相对位置，并于次年开发出可应用于活细胞上得ＰALM成像技术来记录细胞黏附蛋白得动力学过程。
（参考文献:Ｐattersｏn ＧH,Lipｐｉncotｔ—Sｃhｗartz Ｊ、A phoｔoａｃtivataｂle GFP ｆor ｓelective phｏtｏlabeling of proｔeins and ceｌlｓ；Ｂeｔzig E, Pａtterson G H,Souｇrａt R，et al、Imaginｇｉntraceｌlular ｆluorescent ｐroteins aｔnaｎomｅtｅｒreｓolｕtion；Ｓhｒoff Ｈ, Ｇａlｂraith ＣG, Ｇａlbｒaｉth J Ａ，ｅｔal、Ｄual—cｏloｒsuｐe ｒrｅｓｏlutｉoｎimaginｇoｆgenetｉｃalｌy eｘｐressed probes wiｔhiｎｉndｉviduaｌａdｈesiｏn pｌｅｘes)图１：应用PALM技术定位单个荧光分子最后实现超分辨率成像得示意图A， B, Ｃ， D， E, F 展示了实际实验过程及得到得原始数据；A′，B′，C′, Ｄ′，E′, Ｆ′ 展示了用高斯拟合确定荧光分子得中心,叠加产生了超分辨率图像;（A，A′）未激活任何荧光分子时；(B, B′）用40５ nｍ得激光激活了４个荧光分子；(C, C′）用４88 ｎｍ得激光观察一段时间后漂白了第一轮激活得4 个荧光分子; （D，D′)第二轮重新激活得另外得几个荧光分子；（Ｅ，Ｅ′)两轮激活得荧光分子总与组成得图像; (F，F′）Ｅ图得局部放大３、2多色随机光学重构显微法PALM得成像方法只能用来观察外源表达得蛋白质，而对于分辨细胞内源蛋白质得定位无能为力.但就是利用化学小分子Cｙ3与Cy5、Cy7等荧光分子对得光转换效应同样可以达到突破光学极限得效果。
这项技术被称为“随机光学重建显微术”（stoｃhastic optｉｃal reconｓtｒucｔion microscｏpy, STＯRM）.其发明人就是哈佛大学得庄小威教授。
这项技术就是用很弱得光激发荧光分子,使细胞内得一小部分荧光分子发光，而不就是全部.这样由于发光得点分布比较分散,重叠比较少,因此每个光晕可以近似为一个荧光分子.在一次激发中，可以确定一部分光晕得中心,在下一次激发中，可以确定另外一部分光晕得中心，把这许多次激发得结果叠加,就就是完整而清晰得图像（图2）。
因此，ＳTORM 需要利用荧光发色团标记抗体对靶蛋白进行识别，可以检测到内源性蛋白，避免由于外源性表达偶联荧光蛋白得靶蛋白对其定位产生得可能得影响，但就是在活细胞应用中受到限制,并且也有可能受到免疫荧光染色过程得影响。
随后,她们又利用光学像散性实现了3ＤＳTＯRM,达到了平面２0~３0 ｎm,纵向50～6０nm得成像精度。
（参考文献：夏鹏,窦震、超高分辨率显微技术研究进展;Ｈuang B，Ｗang W，Bａtｅs Ｍ，et al、Threｅ—ｄimensiｏnａl ｓｕpeｒresolutｉon imaｇiｎg by ｓtｏcｈastｉc optｉcal reｃoｎstｒuction microsｃｏｐy）利用某些荧光小分子自身可被反复激发淬灭得性质，通过与STORM相似得操作方法，可以实现单一荧光分子得超高分辨率成像,这一方法大大简化了原始ＳTＯRM得样品制备过程，被称为dSTORＭ(dirｅct STＯRＭ）。
值得一提得就是，庄小威研究组将SNＡP标签与靶蛋白融合表达，同时将荧光分子偶联到可以结合SNAＰ标签得小分子化合物上,进而标记靶蛋白,再通过降低溶解氧消耗系统以及脂肪族巯醇得添加量，成功地在三维超高分辨率得成像中实现了空间分辨率平面30 ｎm,轴向50nm，时间分辨率1~2s得优异效果。
有意思得就是几种细胞膜标记物也被鉴定出具有光转换性质,并被用于超高分辨率显微成像,在活细胞中得到了3０～6０nｍ得空间分辨率与1~2ｓ得时间分辨率。