肠出血性大肠埃希菌O157噬菌体的生物学特性

［文章编号］　１６７１－５８７Ⅹ（２０１２）０１－００７９－０５

［收稿日期］　２０１１－０７－１３

［基金项目］　吉林省计划经济委员会科研基金资助课题（２００９　６３３）［作者简介］　刘　悦（１９７８－）女，吉林省四平市人，在读医学硕士，主要从事噬菌体的生物学研究。［通信作者］　孙延波（Ｔｅｌ：０４３１－８５６１９５７４，Ｅ－ｍａｉｌ：ｓｕｎｙｂ＠ｊｌｕ．ｅｄｕ．ｃｎ）

肠出血性大肠埃希菌Ｏ１５７噬菌体的生物学特性刘　悦１，李菁华１，史红艳１，温剑平２，孙延波１

（１．吉林大学白求恩医学院病原生物学系，吉林长春１３００２１；２．吉林大学白求恩医学院分子生物学系，吉林长春１３００２１）

［摘

　要］　目的：分离并鉴定肠出血性大肠埃希菌Ｏ１５７噬菌体，对其生物学特性进行研究，为开发抗肠出血

性大肠埃希菌Ｏ１５７的生物制剂提供实验依据。方法：以肠出血性大肠埃希菌Ｏ１５７为宿主菌，采用噬斑法从环境污水中分离出针对肠出血性大肠埃希菌Ｏ１５７的噬菌体。噬菌体经超滤浓缩后，电镜观察其大小和形态；将宿主菌和噬菌体以不同的比例混合，测定噬菌体的最佳感染复数并观察其一步生长曲线；利用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析噬菌体的结构蛋白和非结构蛋白；提取噬菌体基因组，进行酶切电泳分析。结果：电镜显示噬菌体的头部呈球形、直径４０ｎｍ，噬菌体的尾部长约８０ｎｍ。噬菌体的最佳感染复数为１０－２

，即当宿主菌和噬菌体之间的比例为

１∶１００时裂解效率最高。一步生长曲线示噬菌体在裂解宿主菌时，潜伏期约为１０ｍｉｎ，爆发期约为３０ｍｉｎ，裂

解量为１３０

。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ凝胶电泳呈现１３种蛋白，相对分子质量为１６　０００～２２　０００。琼脂糖凝胶电泳显示噬菌体

基因组大小约２３　０００ｂｐ

。结论：成功分离并鉴定一株针对肠出血性大肠埃希菌Ｏ１５７的噬菌体，是一种裂解性

强、特异性高的毒性噬菌体，肠出血性大肠埃希菌Ｏ１５７噬菌体属于有尾病毒目，管尾噬菌体科。［关键词］　肠出血性大肠杆菌Ｏ１５７；噬菌体；最佳感染复数

［中图分类号］　Ｒ３４２ ［文献标志码］

Ａ

Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ　ｏｆ　ｅｎｔｅｒｏｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ　Ｅ．ｃｏｌｉＯ１５７－ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅｓ　ｉｓｏｌａｔｅｄ　ｆｒｏｍ　ｒａｗ　ｓｅｗａｇｅ

ＬＩＵ　Ｙｕｅ１，ＬＩ　Ｊｉｎｇ－ｈｕａ１，ＳＨＩ　Ｈｏｎｇ－ｙａｎ１，ＷＥＮ　Ｊｉａｎ－ｐｉｎｇ２，ＳＵＮ　Ｙａｎ－ｂｏ１（１．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｐａｔｈｏｇｅｎｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｎｏｒｍａｎ　Ｂｅｔｈｕｎｅ　Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｊｉｌｉｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈａｎｇｃｈｕｎ　１３００２１，Ｃｈｉｎａ；２．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｎｏｒｍａｎ　Ｂｅｔｈｕｎｅ　Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｊｉｌｉｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈａｎｇｃｈｕｎ　１３００２１，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ　Ｔｏ　ｉｓｏｌａｔｅ　ｅｎｔｅｒｏｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ　Ｅ．ｃｏｌｉ　Ｏ１５７ｐｈａｇｅｓ　ｆｒｏｍ　ｒａｗ　ｓｅｗａｇｅ　ａｎｄ　ｔｏ　ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ　ｔｈｅｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ　ｏｆ　ｉｓｏｌａｔｅｄ　ｐｈａｇｅｓ　ａｎｄ　ｔｏ　ｐｒｏｖｉｄｅ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　ｂａｓｉｓ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ｏｆ　ａ　ｂｉｏｌｏｇｉｃ　ａｇｅｎｔａｇａｉｎｓｔ　ｅｎｔｅｒｏｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ　Ｅ．ｃｏｌｉ　Ｏ１５７．Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅｓ　ｗｅｒｅ　ｉｓｏｌａｔｅｄ　ｆｒｏｍ　ｒａｗ　ｓｅｗａｇｅ　ａｎｄ　ｗｅｒｅｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ　ｂｙ　ｐｌａｑｕｅ　ｍｅｔｈｏｄｓ　ｕｓｉｎｇ　ｅｎｔｅｒｏｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ　Ｅ．ｃｏｌｉ　Ｏ１５７ａｓ　ｈｏｓｔ　ｃｅｌｌｓ．Ａｆｔｅｒ　ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐｈａｇｅｓ　ｗｉｔｈｕｌｔｒａｆｉｔｒａｔｉｏｎ，ｔｈｅ　ｓｉｚｅ　ａｎｄ　ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ　ｏｆ　ｐｈａｇｅｓ　ｗｅｒｅ　ｅｘａｍｉｎｅｄ　ｂｙ　ｅｌｅｃｔｒｏｎ　ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ，ａｎｄ　ｔｈｅ　ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ　ｏｆｉｎｆｅｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｇｒｏｗｔｈ　ｃｕｒｖｅ　ｏｆ　ｐｈａｇｅｓ　ｗｅｒｅ　ｃａｒｒｉｅｄ　ｏｕｔ　ｂｙ　ｍｅａｎ　ｏｆ　ｈｏｓｔ　ｂａｃｔｅｒｉａ　ａｎｄ　ｐｈａｇｅｓ　ｍｉｘｔｕｒｅ　ｉｎ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｐｏｒｔｉｏｎｓ．Ｔｈｅ　ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ　ａｎｄ　ｎｏｎｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｏｆ　ｐｈａｇｅｓ　ｗｅｒｅ　ａｎａｌｙｚｅｄ　ｂｙ　ＳＤＳ－ＰＡＧＥ　ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ．Ｔｈｅｅｘｔｒａｃｔｅｄ　ｇｅｎｏｍｅｓ　ｏｆ　ｐｈａｇｅｓ　ｗｅｒｅ　ｄｉｇｅｓｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ　ｅｎｚｙｍｅｓ．Ｒｅｓｕｌｔｓ　Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｏｆ　ｅｌｅｃｔｒｏｎ　ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｈｅａｄ　ｏｆ　ｐｈａｇｅｓ　ｅｘｈｉｂｉｔｅｄ　ａ　ｓｐｈｅｒｉｃａｌ　ｆｏｒｍ，４０ｎｍ　ｉｎ　ｄｉａｍｅｔｅｒ　ａｎｄ　ｔｈｅｓｅ　ｐｈａｇｅｓ　ｈａｄ　ａ　ｔａｉｌ，ａｂｏｕｔ８０ｎｍ　ｉｎ　ｌｅｎｇｔｈ．Ｔｈｅ　ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ　ｏｆ　ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐｈａｇｅｓ　ｗａｓ　１０－２，ｔｈａｔ　ｗａｓ，ｗｈｅｎ　ｔｈｅ　ｒａｔｉｏ　ｏｆ　ｈｏｓｔ　ｂａｃｔｅｒｉａ　ｔｏｐｈａｇｅｓ　ｂｅｉｎｇ　１∶１００，ｔｈｅ　ｍｏｓｔ　ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ　ｌｙｓｉｓ．Ｔｈｅ　ｇｒｏｗｔｈ　ｃｕｒｖｅ　ｏｆ　ｐｈａｇｅｓ　ｒｅｖｅａｌｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ　ｗａｓ　１０ｍｉｎ，ｔｈｅ　ｏｕｔｂｒｅａｋ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｔｉｍｅ　ｗａｓ　３０ｍｉｎ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｌｙｓｉｓ　ａｍｏｕｎｔ　ｗａｓ　１３０．ＳＤＳ－ＰＡＧＥ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　１３ｋｉｎｄｓ　ｏｆ

９７第３８卷　第１期２０１２年１月吉　林　大　学　学　报　（医　学　版）Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｊｉｌｉｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　Ｅｄｉｔｉｏｎ）Ｖｏｌ．３８Ｎｏ．１　Ｊａｎ．２０１２ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｏｆ　ｐｈａｇｅｓ　ｗｅｒｅ　ｆｏｕｎｄ　ａｎｄ　ｔｈｅｉｒ　ｒｅｌａｔｉｖｅ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｍａｓｓ　ｗｅｒｅ　１６　０００－２０　０００．Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ　ｏｆ　ＤＮＡｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｓｉｚｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｇｅｎｏｍｅ　ｏｆ　ｐｈａｇｅｓ　ｗａｓ　２３　０００ｂｐ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ　Ａ　ｓｔｒａｉｎ　ｏｆ　ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅｓ　ａｇａｉｎｓｔｅｎｔｅｒｏｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ　Ｅ．ｃｏｌｉ　Ｏ１５７ｉｓ　ｉｓｏｌａｔｅｄ　ａｎｄ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ，ａｎｄ　ｉｔ　ｉｓ　ｌｙｔｉｃ　ａｎｄ　ｈｉｇｈｌｙ　ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｔｏ　Ｅ．ｃｏｌｉ　Ｏ１５７．Ａｃｃｏｒｄｉｎｇ　ｔｏ　ｔｈｅ　ｂｉｏｌｏｇｉｃ　ｆｅａｔｕｒｅｓ，ｅｎｔｅｒｏｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ　Ｅ．ｃｏｌｉ　Ｏ１５７ｐｈａｇｅｓ　ａｒｅ　ｃｌａｓｓｉｆｉｅｄ　ｉｎｔｏ　Ｃａｕｄｏｖｉｒａｌｅｓ，Ｓｉｐｈｏｖｉｒｉｄａｅ．Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：ｅｎｔｅｒｏｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｏ１５７；ｂａｃｔｅｒｏｐｈａｇｅｓ；ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ　ｏｆ　ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ

肠出血性大肠埃希菌（ｅｎｔｅｒｏｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ　Ｅ．ｃｏｌｉ，ＥＨＥＣ）所致的感染性腹泻和出血性肠炎是世界范围内的公共卫生问题，常见的血清型包括ＥＨＥＣ　Ｏ１５７、Ｏ２６和Ｏ１１１等。ＥＨＥＣ经污染的食物和水感染人，临床表现包括腹泻、出血性肠炎、溶血性尿毒综合征和血栓性血小板减少性紫癜［１］。２０１１年５月中旬以来，从德国开始爆发的ＥＨＥＣ感染疫情不断蔓延，截止２０１１年６月１５日，已造成３　３４３人感染，３７人死亡，８２３例发生溶血性尿毒综合征［２］。我国自１９８７年以来已在江苏、山东、北京等地发现了ＥＨＥＣ感染者，究其原因多与污染的食物有关［３］。目前ＥＨＥＣ感染尚无有效的治疗方法，有资料显示：利用肠道内的正常菌群，如双歧杆菌产生的乙酸盐可以拮抗ＥＨＥＣ　Ｏ１５７在肠道内的生长［４］，但无法应用在水源及食品的污染控制上。噬菌体是细菌的病毒，广泛存在于自然环境中。噬菌体对细菌裂解的特异性和高效性，再度引起人们的关注。目前，最新的研究包括肺炎链球菌噬菌体裂解酶的开发［５］和针对某种病原菌感染的噬菌体疗法［６］。由于噬菌体可在细菌性疾病（特别是耐药性细菌所致的感染）的治疗中发挥重要的作用，因此对噬菌体展开深入的研究具有重要的现实意义和潜在的应用价值。本实验通过噬斑法分离一株针对ＥＨＥＣ　Ｏ１５７噬菌体，经纯化后对其生物学特性进行分析，为开展噬菌体作为抗菌生物制剂的研发提供实验依据。１　材料与方法１．１　菌株及主要试剂　ＥＨＥＣ　Ｏ１５７由北京药品生物制品鉴定所惠赠，ＥＨＥＣ　Ｏ１５７抗血清凝集反应阳性；营养琼脂、ＰＥＧ８０００、氯仿、平衡饱和酚和蛋白预染ｍａｒｋｅｒ购自北京鼎国生物技术有限公司，ＤＮａｓｅ　Ｉ、ＲＮａｓｅ　Ａ、蛋白酶Ｋ和考马斯亮蓝Ｒ－２５０购自Ａｍｒｅｓｃｏ公司，限制性内切酶ＥｃｏＲⅠ、ＥｃｏＲⅤ和ＨｉｎｄⅢ购自ＴＡＫＡＲＡ公司。１．２　ＥＨＥＣ　Ｏ１５７噬菌体分离及纯化　取污水５００ｍＬ，加入ＣａＣｌ２至终浓度为１ｍｍｏｌ·Ｌ

－１，

５　０００ｒ·ｍｉｎ－１离心８ｍｉｎ，滤过除菌。取上清液

３００ｍＬ，加入ＬＢ液体培养基１００ｍＬ和新鲜培养的ＥＨＥＣ　Ｏ１５７菌悬液１０ｍＬ

，３７℃振荡培养１６ｈ，

１０　０００ｒ·ｍｉｎ－１离心５ｍｉｎ，上清液用０．２２μｍ滤膜过滤除菌，即得噬菌体原液。取１０ｍＬ无菌试管加入０．３ｍＬ噬菌体原液和０．３ｍＬ新鲜培养的ＥＨＥＣ　Ｏ１５７菌悬液，充分混合，室温放置１５ｍｉｎ，使噬菌体和宿主菌充分吸附。加入６０℃左右融化的０．７％ＬＢ琼脂５ｍＬ

，均匀铺在固体营

养琼脂平板上，３７℃培养１０ｈ，

观察噬斑生长情

况。噬斑形成后，挑取单个噬斑接种于新鲜培养的宿主菌中，３７℃震荡培养６ｈ，进行噬菌体扩增，

１０　０００ｒ·ｍｉｎ－１离心５ｍｉｎ

，取上清液。单个噬

斑经过３～５次反复纯化后即得较纯化的噬菌体。１．３　噬菌体滴度测定　

取纯化后的噬菌体原液进

行倍比稀释，每稀释度取０．１ｍＬ加入０．２ｍＬ宿主菌，制备噬菌斑，测定噬菌体滴度。噬菌体滴度（ＰＦＵ·ｍＬ－１）＝噬斑个数×稀释倍数×１０。１．４　噬菌体的电镜观察　取噬菌体悬液１０μＬ滴在有支持膜的铜网上，作用１５ｍｉｎ，用２％的磷钨酸（ＰＴＡ，ｐＨ７．０）染色１０ｍｉｎ，