新生大鼠大脑皮层神经元原代培养方法
大鼠皮层神经元细胞原代培养 ppt课件
Hale Waihona Puke ppt课件11实验步骤
5 剪碎：
将大脑皮层转移到另一装有PBS的平皿中，用 手术剪将其剪成小块（1mm3），用PBS液洗 三次，转移至离心管中离心1000 rpm 5min 。
6 消化：
加入0.25%胰蛋白酶，放入37℃培养箱消化 20min,中间翻转振荡一次。使细胞分离。
ppt课件
9
实验步骤
布局
器械
PBS 剪碎组织块
取脑，分离皮层神经 元
剥离血管及筋膜
PBS
冰盒
ppt课件
酒精
PBS
断头
清洗血液
10
实验步骤
3 断头取脑： 超净台内，断头取脑，置于盛有PBS的培养皿
内，洗涤3次，弃除表面残余血迹，迅速置于无 菌的生理盐水冰浴上。
4 剥离软脑膜： 剥离大脑皮层至预冷的PBS中，用两把无齿弯
培养基
材料
包被
剥膜
消化
低温操作
ppt课件
16
影响因素
材料选择
胎鼠就要胎鼠，新 生鼠就要新生鼠， 不能混淆
★易于操作 ★有一些受体，在 培养的工作中失去 功能，会不能再生
ppt课件
17
影响因素
培养基选择
不建议血清培养
1 血清刺激胶质细胞和杂细胞分裂，影响神经元产量； 2 抑制胶质生长，往往要加入阿糖孢苷。严重的毒性会影响许多灵敏实验； 3血清培养的细胞状态很不均一，从正常到凋亡都有，严重影响试验准确，
皮层神经元细胞原代培养
ppt课件
1
☞ 主要内容 :
1
2
3
4
实验原理
原代神经细胞培养方法解析
神经细胞培养体外神经细胞的培养已成为神经生物学研究中十分有用的技术手段。
神经细胞培养的主要优点是:(1)分散培养的神经细胞在体外生长成熟后,能保持结构和功能上的某些特点, 而且长期培养能形成髓鞘和建立突触联系,这就提供了体内生长过程在体外重现的机会。
(2)能在较长时间内直接观察活细胞的生长、分化、形态和功能变化,便于使用各种不同的技术方法如相差显微镜、荧光显微镜、电子显微镜、激光共聚焦显微镜、同位素标记、原位杂交、免疫组化和电生理等手段进行研究。
(3)易于施行物理（如缺血、缺氧）、化学和生物因子（如神经营养因子）等实验条件, 观察条件变更对神经细胞的直接或间接作用。
(4)便于从细胞和分子水平探讨某些神经疾病的发病机制，药物或各种因素对胚胎或新生动物神经细胞在生长、发育和分化等各方面的影响。
我们实验室从80年代始开展了神经细胞的体外培养工作，取得了一些经验，现将培养细胞分类及方法简要介绍如下:一.鸡胚背根神经节组织块培养主要用于神经生长因子（NGF）等神经营养因子的生物活性测定。
在差倒置显微镜下观察以神经突起的生长长度和密度为指标半定量评估NGF的活性。
1．材料和方法（1）选正常受精的鸡蛋，置于37℃生化培养箱内孵化，每日翻动鸡蛋一次。
（2）取孵化8-12 d 的鸡蛋, 用70% 酒精消毒蛋壳，从气室端敲开蛋壳，用消毒镊剥除气室部蛋壳。
（3）用弯镊钩住鸡胚颈部，无菌条件下取出鸡胚置小平皿内，除去头部后，腹侧向上置灭菌毛玻璃片上,用眼科弯镊子打开胸腹腔，除去内脏器官。
（4）在解剖显微镜下，小心除去腹膜，暴露脊柱及其两侧，在椎间孔旁可见到沿脊柱两侧排列的背根节（图1），用一对5号微解剖镊小心取出。
（5）置背根节于解剖溶液内，用微解剖镊去除附带组织，接种于涂有鼠尾胶的玻璃或塑料培养瓶中，在DMEM无血清培养液中培养。
2．结果鸡胚背根神经节在含神经生长因子(NGF, 2.5S，20ng/ml)的无血清培养液中培养24 h,神经节长出密集的神经突起。
大鼠大脑皮层星形胶质细胞原代培养及传代
大鼠大脑皮层星形胶质细胞原代培养及传代、试剂Poly-L-lysine (Sigma,P2636)DMEM (Invitrogen,11995-065)二、器械手术器械：眼科剪x2、眼科镊直、弯各x2、显微镊x2 （金钟，WA3050）、显微剪x13ml 移液管( Biologix, 30-0138A1)南京军区总院神经内科实验室 许丽丽 2012-12-011) 2) 3) FBS (Invitroge,10099-141)4) HBSS, no Calcium, no Magnesium (Invitrogen, 14170-112)5) 0.25% Trypsin-EDTA ( Invitrogen, 25200-056)6) DPBS (HyClone ，SH30028.01B )7) dd H 2O8) 75％酒精1) 2) 100 ml 小烧杯3) 200 目不锈钢筛4) 细胞计数器（求精）5) 50ml 离心管( Corning ， 430828)、 15ml 离心管( Corning ， 430790)6) 25ml 培养瓶( Corning ， 430639)或 75ml 培养瓶( Corning ， 430641)7) 100ml 玻璃瓶（蜀牛）8) 直径为 60mm 的培养皿 LabServ,310109010)9)10) 过滤器( Millex-GP, SLGP033R)B11) 注射器：50ml、5ml 各112) Pipette and pipette tips13) 冰袋、手套、口罩Day 11、消毒1.1 将解剖器械、枪头高温高压消毒15 分钟，消毒结束后放入烘箱中烘干待第二天使用。
1.2 打开操作台紫外线灯消毒30 分钟。
2、包被培养板2.1 戴手套，用酒精棉球擦拭操作台、移液枪，点燃酒精灯。
2.2取PLL用DPBS将其稀释至100 pg/ml 。
2.3以PLL包被培养瓶，量以覆盖培养瓶底面为宜。
一种改进的大鼠皮层神经元原代培养方法及其性质鉴定_姜茜
·技术方法·一种改进的大鼠皮层神经元原代培养方法及其性质鉴定姜 茜,姜玉武■,王静敏,秦 炯,吴希如(北京大学第一医院儿科,北京 100034)[摘 要]目的:对原有大鼠皮层神经元原代培养方法进行改进,以获得数量更多、纯度更高、体外生长时间更长的神经细胞进行相关实验研究。
方法:使用3种不同成分的液体对培养器皿进行序贯预处理,分离16～17d 胎龄的Wi s t a r 大鼠胎鼠皮层,采用木瓜蛋白酶化学消化与机械吹打相结合的方法制备单细胞悬液,经细胞计数后按照不同实验目的进行梯度密度接种。
细胞接种当日4～6h 将含有血清的接种培养液换为添加B 27的N e u r o b a s a l 无血清培养基,培养第3天(D I V 3)用终浓度10μm o l /L 的阿糖胞苷(c y t o s i n e a r a b i n o s i d e ,A r a -C )处理24h 抑制胶质细胞增殖,以后每周半量换液1次。
用倒置相差显微镜观察细胞形态,利用神经元特异性标志物微管相关蛋白2(m i c r o t u b u l e -a s s o c i a t e dp r o t e i n 2,M A P 2)与细胞核双标记法鉴定培养神经细胞的纯度,并以免疫荧光法检测突触前、后标记物以评估突触形成情况。
结果:与单纯多聚赖氨酸预处理培养器皿,胰蛋白酶化学消化法分离细胞及含血清培养基培养的原方法相比,方法改进以后收获的细胞产量明显增加,且消化过程对细胞损伤小,接种后细胞分散均匀,杂质少,纯度高,树突、突触发育正常,可长期存活。
结论:该方法简便可行,结果稳定,用该方法培养的大鼠皮层神经元可作为神经元体外培养的良好实验模型。
[关键词]大脑皮质;神经元;细胞,培养的;木瓜蛋白酶;免疫组织化学[中图分类号]R 329.2 [文献标识码]A [文章编号]1671-167X (2009)02-0212-05d o i :10.3969/j .i s s n .1671-167X .2009.02.019A ni m p r o v e dm e t h o df o r p r i m a r y c u l t u r e o f r a t c o r t i c a l n e u r o n a n d c e l l i d e n t i f i c a t i o nJ I A N GQ i a n ,J I A N GY u -w u ■,WA N GJ i n g -m i n ,Q I NJ i o n g ,WUX i -r u (D e p a r t m e n t o f P e d i a t r i c s ,P e k i n g U n i v e r s i t y F i r s t H o s p i t a l ,B e i j i n g 100034,C h i n a )A B S T R A C T O b j e c t i v e :T o i m p r o v e p r e v i o u s m e t h o d o f p r i m a r y r a t c o r t i c a l n e u r o nc u l t u r e t o g e t p u r e ra n d m o r e l o n g -l a s t i n g c e l l s f o r s t u d y .Me t h o d s :T i m e d -p r e g n a n t W i s t a r r a t s a t a g e s t a t i o n a l a g e o f 16o r 17d a y s (16-17d )w e r e u s e d .F e t a lb r a i n s w e r e r e m o v e d a n d t h ec e r e b r a l c o r t i c e s w e r ed i s se c t e d o u t .P a p a i n d i g e s t i o na n dm e c h a n i c a l d i s s o c i a t i o nw e r ec o m b i n e dt oc o n d u c t m o n o -c e l l s u s p e n d i n g m e d i a .F o u r t o s i x h o u r s (4-6h )p o s t -p l a t i n g ,a l l p l a t i n g m e d i a w e r e r e m o v e df r o mc u l t u r e s a n d r e p l a c e d w i t h N e u r o b a s a l m e d i u ms u p p l e m e n t e d w i t h B 27.O n t h e t h i r d d a y ,10μm o l /L c y t o s i n e a r a b i n o s i d e (A r a -C )w a s a d d e d t o t h e c u l t u r e f o r 24h t o i n h i b i t t h e o u tg r o w t ho f g l i a l c e l l s .H a l f o f th e c u l t u r e m e di u mw a s c h a n g e d e v e r yw e e k .T h e m o r p h o l o g i c a l c h a n g e s o f n e u r o nc e l l s w e r eo b s e r v e db yl i g h t m i c r o s c o p e .D o u b l e i m m u n o -s t a i n i n g o f m i c r o t u b u l e -a s s o c i a t e d p r o t e i n 2(M A P 2)a n d k a r y o n w e r e a p p l i e d t o a s s e s s t h e c u l t u r e p u r i t y .E v a l u a t i o n o f s y n a p s e f o r m a t i o n w a s p r o c e s s e d b y i m m u n o c y t o c h e m i c a l a n a l y s i s u s i n g a n t i b o d i e s a g a i n s t b o t h p r e -a n d p o s t s y n a p t i c p r o t e i n m a r k e r s .R e s u l t s :T h e i m p r o v e d m e t h o d c o u l dr e -m a r k a b l y i n c r e a s e t h e c e l l n u m b e r a n d r e d u c e n e u r o n a l d a m n i f i c a t i o n .T h e p r i m a r y c u l t u r e w a s c h a r a c t e -r i z e d b y h i g h u n i f o r m i t y ,p u r i t y ,n o r m a l s y n a p s e f o r m a t i o n a n d l o n g t i m e l i v a b i l i t y .C o n c l u s i o n :T h i s i s a s i m p l e a n d r e l i a b l e t e c h n i q u e f o r t h e i n v i t r o p r i m a r y c u l t u r e o f r a t c o r t i c a l n e u r o n s .K E Y WO R D S C e r e b r a l c o r t e x ;N e u r o n s ;C e l l ,c u l t u r e d ;P a p a i n ;I m m u n o h i s t o c h e m i s t r y 基金项目:国家自然科学基金资助项目(30270448、30470555、30870865)S u p p o r t e db yN a t i o n a lN a t u r a lS c i e n c eF o u n d a t i o no fC h i n a (30270448,30470555,30870865)■C o r r e s p o n d i n ga u t h o r 's e -m a i l ,j i a n g y w @263.n e t 神经细胞是构成神经系统的基本结构和功能单位。
新生大鼠视皮层神经元的原代培养及鉴定
新生大鼠视皮层神经元的原代培养及鉴定宋海岩;邓晓慧;赵超;连辉【摘要】目的探讨新生大鼠视皮层神经元的原代培养方法,以获取数量多、纯度高的视皮层神经元.方法取新生1d内的SD大鼠视皮层,通过胰酶消化法获取单细胞悬液,倒置相差显微镜下计数后种植于6孔培养板内培养.培养24 h后用终浓度10μmol·L-1阿糖胞苷处理,抑制非神经元的生长,作用24h后半量换液,以后每隔1d半量换液1次.每天倒置相差显微镜下观察细胞的生长状况和形态变化,Nissl染色法进行视皮层神经元鉴定,免疫荧光显示神经元特异性烯醇化酶鉴定培养视皮层神经元的纯度.结果接种4h后,大部分细胞已贴壁,细胞立体感较强；接种后24h,大部分细胞长出短的突起,细胞形态发生变化,胞体呈多边形或三角形,细胞周围有或多或少的光晕；培养4d后,细胞突起伸长、增粗；培养6～8d后,细胞状态较佳,细胞胞体饱满,光晕明显,突起进一步伸长、增粗,且分支多,突起交织成网状,非神经元细胞减少,为实验的最佳时间；培养14 d后,细胞开始退化.培养6d行焦油紫染后,倒置相差显微镜下观察,可见细胞内的尼氏体呈蓝紫色的颗粒或斑块.免疫荧光染色结果显示,原代培养的细胞中,大部分细胞为绿染细胞,形态良好,核大而清晰,神经元所占比例高.结论本研究获得视皮层神经元的方法简单经济,通过形态学观察、Nissl 染色及免疫荧光染色可以对体外培养的视皮层神经元细胞进行准确鉴定.【期刊名称】《眼科新进展》【年(卷),期】2013(033)008【总页数】3页(P733-735)【关键词】视皮层;神经元;原代培养;大鼠【作者】宋海岩;邓晓慧;赵超;连辉【作者单位】453003 河南省新乡市,新乡医学院基础医学院解剖学教研室;453003 河南省新乡市,新乡医学院基础医学院解剖学教研室;453000 河南省新乡市,解放军371医院;453003 河南省新乡市,新乡医学院基础医学院解剖学教研室【正文语种】中文视皮层是视觉系统的高级中枢，培养观察视皮层神经元对弱视等与视皮层相关性眼科疾病的基础研究具有重要的意义。
新生鼠海马、皮层神经元原代培养
新生鼠海马、皮层神经元原代培养实验材料1. 实验动物新生Wistar大鼠，当天出生（<12 h）的乳鼠，SPF级。
2. 试剂Hibernate ANeurobasal AB27 serum-free supplementsPapin （木瓜蛋白酶）DNAase IOptiPrep Density Gradient MediumPoly-L-lysine （多聚赖氨酸）L-glutamine （L-谷氨酰胺）Penicillin （青霉素）Streptomycin （链霉素）D-Hank’s solutiondd H2O3. 溶液配制1. 多聚赖氨酸：取多聚赖氨酸25 mg，用双蒸水溶解并稀释浓度为50μg/ml，用0.2 μm的微孔滤膜过滤，4 °C保存备用。
（可配成25×）2. 解剖液：HA：含0.5mM L-谷氨酰胺的Hibernate A，0.22μm微孔滤膜过滤，4°C保存备用。
3．Papin：用HA配制含Papin 2mg/mL的消化液，37°C孵育20~30min，0.22μm 微孔滤膜过滤，冰上保存至实验。
在使用前3h内配制。
4．DNAase I：取DNAase I粉末用D-Hank’s液配制成50μg/mL，0.22μm微孔滤膜过滤。
可一次配好，-20°C保存，每次取用。
4．终止消化液：HABG：含2% B27的HA。
现用现配，37°C保存备用。
5．Optiprep离心介质：Optiprep medium∶HABG为124∶876，每离心管1~1.5mL。
5．种植液和培养液：Neurobasal-A/B27：含2% B27，0.5mM L-谷氨酰胺的Neurobasal-A。
现用现配，37°C保存备用。
4．实验方法1. 包被培养皿使用前2 d，在无菌条件下取6孔培养板，加多聚赖氨酸1 mL/孔，放置2 h，吸去多余多聚赖氨酸，自然干燥，灭菌水洗板2次，干燥备用。
大鼠大脑皮层神经元细胞原代培养
大鼠大脑皮层神经元细胞原代培养大鼠大脑皮层神经元细胞原代培养南京军区总院神经内科实验室许丽丽2012年10月一、试剂1)Poly-L-lysine（Sigma,P2636）2)DMEM（Invitrogen,11995-065）3)FBS（Invitroge,10099-141）4)Neurobasal（Invitrogen, 21103-049）5)B27（Invitrogen ,17504-044）6)GlutaMAX （Invitrogen ,35050-061）7)HBSS, no Calcium, no Magnesium（Invitrogen, 14170-112）8)0.25% Trypsin-EDTA （Invitrogen, 25200-056）9)DPBS（HyClone，SH30028.01B）10)dd H2O11)10％水合氯醛12)75％酒精二、器械1)手术器械：组织剪x2、组织镊x1、直弯镊各x1、眼科剪x2、眼科镊直、弯各x2、显微镊x2（金钟，WA3050）、显微剪x12)200 ml小烧杯（盛放胎鼠）3)200目不锈钢筛4)细胞计数器（求精）5)50ml离心管（Corning，430828）、15ml离心管（Corning，430790）6)6孔板（Corning，3516）或24孔板（Corning，3524）96孔板（cosrer,3599）7)直径为60mm的培养皿（LabServ,310109010）8)3ml移液管（Biologix, 30-0138A1）9)过滤器（Millex-GP, SLGP033RB）10)注射器：50ml、5ml各 111)Pipette and pipette tips12)冰袋、手套、棉球、棉签Day 11、消毒1.1 将解剖器械、枪头高温高压消毒15分钟，消毒结束后放入烘箱中烘干待第二天使用。
1.2 打开操作台紫外线灯消毒30分钟。
原代神经细胞培养
原代神经细胞培养新生鼠神经元细胞的培养准备工作：1、解剖器械一套（实验室有专门用于细胞间取材用的成套器械），需提前一天灭菌，过夜烤干。
2、试剂、溶液：Neuralbasal培养基（2mM glutamine）；D-PBS缓冲液；0.25%trypsin/0.02%EDTA消化液；0.05%poly-lysin。
3、包被玻片：干烤灭菌12 x 12mm2玻片，12孔板。
包被过程：0.05%poly-lysin滴于置培养板中的盖玻片上（注意勿溢出玻片），37℃放置12hr后纯水洗3遍，晾干。
4、操作中所用枪头均用剪刀剪去枪头尖，然后在酒精灯上迅速过一下抛光。
取材：1、从-200C取出三个冰袋，预冷若干皿D-PBS，一大皿用于冷却剥出的脑子，另外的35mm的皿用于冷却分离出的脑组织，如：海马，皮层，下丘脑等，分离几个部位就预冷几小皿D-PBS，小皿盖子上做好标记，第三个冰袋上放一皿盖，上面放灭过菌的滤纸，用于剥离脑子的操作。
2、取1-3天鼠，75％酒精浸泡片刻后，用大剪子断头处死。
3、弯头眼科剪剪开颅骨，取出完整脑至盛有预冷D-PBS的培养皿中，在体式镜下分离相应部位的组织,分别放在相应的皿中。
4、将组织块用弯头眼科剪剪碎，每小块约2mm3左右，用枪移入5mlEP中，稍为沉淀1分钟，吸弃上清，加入0.25%trypsin/0.02%EDTA，37℃消化10-15分钟左右，期间每3分钟颠倒几下。
注：每四个海马用胰酶1ml，每个皮层用胰酶2ml。
5、消化完毕，每毫升胰酶加入100ul血清以终止胰酶，颠倒混匀；1000rpm，4分钟，离心沉淀。
6、吸弃上清，注意不要将组织吸出。
7、加入37℃预热的1-2ml DMEM／10%FBS，用枪头吹打20下左右，此时液体浑浊，组织块明显变小。
8、放置沉淀3分钟左右，可见组织块沉底，吸取上清，其中包含所要的细胞。
9、计数，将细胞密度调整至2－4 x 10 5 /ml后接种于预先用poly-lysine包被过的盖玻片或皿上，100ul每玻片（12 x 12mm玻片）。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
Ｄ Ｍ） 粉 培 养 基 １ ｇ （ ｉｉ ＭＥ 干 ０ ／ Ｇｂｃ 包 ｏ公 司 ）０２ ％胰 ，．５ 蛋 白酶 溶 液 （ 云天公 司 ） 优级 胎 牛 血 清 Ｆ Ｓ（ ． 碧 ， Ｂ Ｈｙ
水 ， 容 至 １ ０ ｍｌ调 节其 ｐ 值至 ７２ 用 ０２ ｍ 微 定 ００ ， Ｈ ．， ．１ ｘ
出短小 突起 。培 养 １ ， 胞 突起增 长 ， 长度 约为胞 ｄ细 其
管轻 轻 吹 打 ， 其成 为细胞 悬 液 ， 使 待消 化 结 束 时 ， 用
Ｆ Ｓ终 止 消 化 ，０ ｒｍ 离 心 ，ｍ ｎ Ｂ ８ ０ｐ ５ ｉ ；吸 去 上 清 液 ， 用
种 植 液重 悬 ， 滤 ， 过 制成 单 细 胞悬 液 ， 细胞 计 数 板 用
（ ｏ ｓ ｇ ｒＤｕｂ ｅ ｏ ｄｆ ｄ Ｅ ｇｅＳｍｅ ｉｍ， — Ｌ ｗ— ｕ ａ ｌ ｅ ｃ Ｓｍｏ ｉ ｅ ａ ｌ ｄｕ Ｌ ｉ
① ０ＯＭ 磷 酸盐 缓 冲液 （Ｂ ） ．１ Ｐ Ｓ 的配 制 ：． ａ ８５ Ｎ — ｇ
Ｃ ，．ｇＮ ２ Ｐ １ Ｈ Ｏ，． ｇＮ Ｈ Ｐ ４溶解 于三 蒸 ｌ３５ ａＨ Ｏ ・２ ２ ０２ ａ ２Ｏ ， ５
作 者 简 介 ： 怀 林 （９ ５ ） 女 ， 师 ， 士 熊 １７ － ， 讲 硕
用 ０２ ． ｍ微孔 过 滤器 过滤 ， 分装 ，ｃ保存 。 阿糖 胞 ４Ｃ ③
苷储 备 液 的配置 ：ｍｇ阿糖胞 苷 ， １ ｌ 菌 超纯 水 １ 用 ｍ无
溶解 ， 冻存 备用 。 种 植液 的配 置 ： 含有 ２ ％胎牛 血 ④ （ ０
ＣｏＲＴＩ ＣＡＬ ＮＥＵＲｏＮＳ ｏＦ ＮＡＴＡＬ ＲＡＴ
Ｘｉｎ ａｌｎ， ｔａ ｏ ｇ Ｈｕ ｉ ｉ ｅ ｌ
Ｄ ｐ ｒ ｅ ｔｆＡｎｔｍ ， ｃｏ ｌ Ｂ ｓｃＭｅ ｉｉｅ ｕｈ ｕＭｅ ｉ ｌ ｏ ｅｅ ｅ ａｔ ｎ ｍ ｏ ａ ｙ Ｓ ｈ ｏ ｏ ａｉ ｄｃｎ， ｚ ｏ ｄｃ ｌ ｇ ｏ ｆ Ｌ ａＣ ｌ Ａ ｓｒ ｃ ｊｃｉ ： ｏｉｔ ｄ ｃ ｉ ｐｅａ ｄｇｏ ｅ ｏ ｆ ｕｔｒ ｇｃ ￣ｃｌ ｅ ｒｎ ． Ｍｅｈ ｄ ： ｈ ｂ ｔａ ｔ ０ｂｅ ｔ ｅ Ｔ ｎｒ ｕ ｅａｓ ｌ ｎ ｏ ｄｍ ｔ ｄｏ ｌ ｉ ｏ ｉａ ｎ ｕｏ ｓ ｖ ｏ ｍ ｈ ｃ ｕｎ ｔｏ ｓ Ｔ ｅ
。
。
原代培养 ， 察培养神经元的生长形态 ， 用免疫荧光化学法对其进行鉴定 观 并
结 果 ： 养 的神 经 元 细 胞 清 晰 ， 晕 明 显 ， 培 光 生长 良 好 ， 疫 荧 光 鉴 定 结果 表明 该 方 法 培 养 的细 胞 纯 度 较 高 ， 够 达 到 实 验 研究 的要 求 。结论 ： 培 养 方法 简单 可 靠 ， 神经 元培 养 免 能 该 是
度 为 ０３ ｍ ， ．ｍ ／ ｌ使用 时 １１ ０稀释 ） 摇匀 ， ｇ ： ０ ， 以后 隔 ３ ｄ
用 Ｎ ｕｏ ａａ— ／ ２ ｅ ｒｂ ｓｌＡ Ｂ ７全 量 换 液 。
图 １原 代培 养 第 １ ｄ的 神经 细 胞 × ０ １０
２原 代 培 养 第 ３ ｄ的神 经 细 胞 ｘ１ （ ０）
６， ｄ 胞体 聚集 更 明显 。 随着 培养 时 问 的延 长 ， 经细 神 胞突起 纵 横交 错 ， 以辨认 突起 的起 源 （ 图 ４ 。 难 见 ）
Ｂ ７的 Ｎ ｕｏ ａａ— ２ ｅ ｒｂ ｓｌＡ培 养 液培 养 。细 胞培 养 至 ４ ～ ８
７ ， 胞 培 养 液 中 每 孔 加 入 Ａｒ— ０ ｌＡ ａ Ｃ： ２ｈ 细 ａ Ｃ ２ １ （ ｒ— 浓 ｘ
熊怀 林 ， 高 云 ， 朝鲜 杨
，
（ 州 医 学 院 ： 础 医 学院 解 剖 教 研 室 ；神 经 生 物 研 究 室 四 川 泸 州 泸 １ 基 摘 要
６６ ０ ） ４ ００
目的 ： 绍一 种 简 单 、 长 良好 的 大脑 皮层 神 经 元 的 培 养方 法 方 法 ： 性 分 离新 生 鼠大 脑 皮 层 制 作单 细 胞 悬 液进 行 介 生 急
ｓ ａｃ ． ｎ ｌｓｏ ： ｅｃ ｌ ｒ ｇｍｅｈ ｄ ｉ ｉ ｌ． ｌ ｂｅａ ｄｇ ｏ ． ｅ ｒｈ Ｃｏ ｃｕ ｉｎ Ｔ ｕｔ ｉ ｔｏ Ｓｓｍｐｅｒ ｉ ｌ ｎ ｏ ｄ ｈ ｕｎ ｅａ
Ｋｅ ｒ ｓ ｙ ｗｏ ｄ Ｎｅ ｒ ｎ ； ｉ ｒ ｕ ｔ ｒ ｕ ｏ ｓ Ｐｒｍａ ｙ ｃ ｌｕ ｅ
ｌ ｍｍｘ ｍｍｘ ｍ 小块 ：经 ０２ ％ 胰 蛋 白酶 消 化 ， ｌ １ｍ ．５ 吸
２ １ 形 态学 观察 ．
初 接种 时 ． 细胞 呈 圆形 ， 突起 ， 体透 明。 养 无 胞 培 １ ｈ 细 胞基 本 贴 壁 ， 体 呈 圆形 或椭 圆形 ， 积 小 ， ２， 胞 体 胞 体 发 亮 ， 边 可 见 明显 的光 晕 ， 体 感强 ， 胞伸 周 立 细
、
Hale Waihona Puke 的 良好 方 法 。 关 键 词 神 经元 ： 原代 培 养
中图 分 类号 Ｒ ４ Ｑ １．． ７ ； ８ ３１ｔ
文 献 标识 码 Ａ
文章 编 号 １０ — ６ ９ ２ １ － ２ — ３ ０ ０ ２ ６ （０ １ １ ００ ０
ＴＨ Ｅ ＴＵＤＹ Ｉ ＡＲＹ Ｓ ＰＲ Ｍ ＣＵＬＴＵＲＥ ＥＴＨ ｏＤ Ｍ ＦｏＲ
旋 多 聚赖 氨酸 ｆｉ Ｓｇ ｍａ公 司） ：神 经细 胞 基 础培 养 基
（ ｅ ｒｂ ｓｌＡ Ｂ ７补 充 物（ ｉｉｏ 司１阿糖 胞 苷 Ｎ ｕｏ ａａ １， ２ — Ｇ ｂｃ 公 ，
（ｉｍ Ｓｇ ａ公 司 ） 兔 源性 神经 元 特 异性 烯醇 化 酶 （ ｅ ． ， Ｎ ｕ
ｒｎ Ｓ ｅ ｉｃｅ ｏ ｓ ． Ｓ 多 克 隆 抗 体 ｆ 京 中杉 金 ｏ ～ ｐ ｃ ｎｌ ｅ Ｎ Ｅ） ｉ ｆ ａ 北 桥 生 物 技 术有 限公 司１免 疫 荧 光试 剂 盒 （ 士 德公 ． 博
２ １
匀 ，℃保存 。⑤ 神 经 元培 养液 的 配制 ： ９ｍｌ ４ 将 ８ 神经
元基 础培 养基 一 Ｎ ｕｏａａ— ）】ｍ ２ １ｍ 青 Ａ ｆｅ ｒｂ ｓｌＡ 、 ｌ ７、 ｌ Ｂ 霉素 一 霉 素双抗 混匀 ，ｑ保 存 。 链 ４Ｃ １２２ 新 生 Ｓ ．＿ Ｄ乳 大 鼠大脑 皮质 神经元 原代 培 养 取新 生 ２ ｈ内 Ｓ ４ Ｄ乳 大 鼠 ４只 ，在 无 菌 条 件下 取 出 大脑 ． 入 盛 有 Ｐ Ｓ的培 养 皿 中 ， 除 脑 膜 及 放 Ｂ 剥
体 的 １ ２倍 （ 图 １ 。培养 ３ ， 体 明显增 大 ， 圆 ～ 见 ） ｄ胞 呈 形 、 圆形 或多 边形 ， 满 ， 椭 饱 折光 性 与立 体感 强 ， 突起 明显 增 长 ， 态 多样 ， 见单 级 、 形 可 双极 、 多极 突起 ， 较 多 突起 相 互连 接 （ 图 ２ 。培 养 ５ 见 ） ｄ时 ， 经 细胞 胞 神 体开 始 聚集 ， 突起 相连 呈 网络样 生 长 （ 图 ３ 。培养 见 ）
泸 州 医学 院学 报
２ ０
２ １ 年 ０１
第 ３ ４卷
．
第 １ 期
Ｊ ｕ ｎ ｌ ｆ ｕ ｈ ｕ Ｍｅ ｉａ ｏ ｅ ｅ Ｖｏ．４ ｏ ｒ ａ ｚ ｏ ｄ ｃ ｌ Ｈ ｇ ｏＬ Ｃ １ Ｎｏ１ ２ ３ ０１ １
ｊ 繁 —
新 生大 鼠大脑 皮层 神 经 元 原 代 培 养方 法
．
Ｔｈ ｈ ｐ ｓ ｏ ｕ ｔ ｒ ｄ ｎｅ ｒ ｎ ｒ ｂｓ ｒ ｅ ｕ ｉ ｇ ｇ ｏ ｈ ｐ ｏ ｅ ｓ ｍｍｕ ｆｕ ｒ ｓ ｅ ｅ ｔ ｏ ｓ ｕ ｅ ｏ ｉ ｅ ｓ ａ ｅ ｆ ｃ ｌｕ ｅ ｕ ｏ ｓ ｗｅ ｅ ｏ ｅ ｖ ｄ ｄ ｒｎ ｒ ｗｔ ｒ ｃ ｓ ．Ｉ ｎｏ ｏ ｅ ｃ ｎ ｅ ｍｅ ｈ ｄ ｗａ ｓ ｄ ｔ ． ｌ
清 ）Ｂ ０ ｌ 入 ２ ０ ｌ ＭＥ 基 础培 养液 中 ， Ｆ Ｓ５ｍ 加 ０ ｍ Ｄ Ｍ 并
添 加青 霉素 一 霉 素 双 抗 ２５ 链 ． ｍｌ（ 度 １１０ ， ０ 浓 ： ） 混 ０
第 １ 期 熊 怀 林 等 ： 生 大 鼠大 脑 皮 层 神 经 元原 代 培 养 方 法 新
ｃ ｒ ｂ ａ ｏ ｘ ｓｏ ｅ ｏ ｎ ｒ ｔ ｗｅ ｅ ｓ ｐ ｒ ｔ ｄ ａ ｕ ｅ ｙ ａ ｄ ｍａ ｅ ｉ ｔ ｉ ｇ ｅｌｓ ｓ ｅ ｓｏ ｏ ｒｍａ ｙ ｃ ｌ ｒ ｅ ｅ ｒ ｌｃ ￣ｅ ｅ ｆｎ ｗｂ ｒ ａｓ ｒ ｅ ａ ａｅ ｃ ｔ ｌ ｎ ｄ ｎ ｏ ｓｎ ｌｃ ｌ ｕ ｐ ｎ ｉ ｎ ｆｒ ｐ ｉ ｒ ｕ ｔ ｅ ｕ
孔滤过膜过滤 ， ℃保存。 ４ ＠Ｄ Ｅ Ｍ Ｍ基础培养液的配
制 ： Ｌ Ｄ Ｍ 干 粉培 养基 ｌ ． 将 — ＭＥ Ｏ０ ｇ溶解 于三蒸 水 ， 加
入 ２０ ａ Ｏ ， ｐ ．ｇＮ ＨＣ 将 Ｈ调定 到 ７２ 。 容 至 １ ０ ｍｌ ． 定 ０ ００ 。
Ｃｏ ｅ公 司）青 霉 素一 霉 素 双 抗 （ 云 天 公 司 ）左 ｌｎ ， 链 碧 ，
现神 经元 的形 态 比较 典型 ， 阳性率 也较 高 。 色 结果 染
ｃ ｅ ｒ ｍｍｕ ｏ ｕ ｒ ｓ ｅ ｅ ｅ ｕ ｔ ｈ ｗ ｈ ｔｔ ｕ ｔ ｒ ｄ ｃ ｌｓｗｉ ｇ ｒｔ ａ ｓ ｄ ｆ ｒｅ ｐｅ ｍｅ ｔｌｒ ． ｌａ ．Ｉ ｎ ｆ ｏ ｅ ｃ ｎｃ ｒ ｓ ｌｓ ｓ ｏ ｔ ａ ｈｅ ｃ ｌｕ ｅ ｅｌ ｔ ｈｉｈ ｐｕ ｉ ｃ ｎ ｂｅ ｕ ｅ ｏ ｘ ｒ ｌ ｈ ｙ ｉ ｎ ａ ｅ
计 数 ， １ １ ｍ 密 度 接 种 在 放 有 盖 玻 片 （ 旋 以 Ｘ ０ 个／ ｌ 左
多 聚赖 氨酸 处理 过 ） ６孔 细胞 培养 板 中 ， ３ 的 于 ７℃ 、 ５ Ｏ 细胞 培 养 箱 中进 行 培养 。２ ％Ｃ ４ｈ后 ， 种 植 液 将
（ ２ ％Ｆ Ｓ的 ＤＭ Ｍ 完 全 培 养 基 １全 量 换 成 含 ｌ 含 ０ Ｂ Ｅ ％
１ 材 料 与 方 法