大鼠大脑皮层星形胶质细胞原代培养及传代
星型胶质细胞文档
3．厡代星形胶质细胞的培养和纯化(1)取新生1天内的wistar大鼠，全身浸入75%酒精中消毒4-5min;(2)在无菌操作台内采用无菌方法迅速取出大脑，置于一盛放无菌D-Hank’s液的玻璃培养皿中（置于冰上低温操作），洗掉大脑表面的血液; (3)然后将大脑放入另一盛放无菌D-Hank’s液的玻璃培养皿中，小心用软毛刷刷掉软脑膜;(4)剪取大脑皮层组织，放入另一盛放0.125%胰酶（2ml）的玻璃称量瓶里，用眼科剪将所取组织剪成小块，盖上盖子，放入培养箱内37℃下消化15min;(5)取出消化后的组织，加入2ml含10%胎牛血清的DMEM/F12培养液终止胰酶消化，用巴士德吸管反复吹打组织至无肉眼可见组织块的浑悬状态，经直径70μm的钢质筛网过滤;(6)然后将细胞悬液在低温(4℃)离心机中离心(1000rpm，5分钟) 后去上清，细胞沉淀加入10%胎牛血清的DMEM/F12培养液制成细胞悬液;(7)计数后以1×106个/m1的细胞密度接种于0.lmg/ml多聚赖氨酸包被过的塑料培养瓶中;(8)放于饱和湿度培养箱中培养（37℃，5%CO2，95%空气）。
第二天换液，以后每3天换一次液直至汇合;(9)细胞汇合后(约第6天)后在37℃恒温摇床振摇(150rpm)1小时，弃上清以纯化星形胶质细胞;(10)用D-Hank’s液涮洗细胞，后用含0.25%的胰酶的D-Hank’s液消化约5分钟后，加等量含血清培养基终止消化，吹悬细胞，以1:2传代种于新的塑料培养瓶;(11)两次传代后接种于铺有包被过盖玻片（0.lmg/ml多聚赖氨酸包被）的六孔板中(用于免疫组化)，或直径为100mm培养皿(用于流式细胞仪检测或Western blot检测)。
4.星形胶质细胞氧糖剥夺和复氧(OGD-R)培养同一代的原代皮层星形胶质细胞分组进行OGD-R损伤模型的制备。
将实验分为3组：正常培养对照组，OGD-R组，OGD-R+C225干预组，正常培养对照组不作处理维持在正常氧、糖、血清的状态下培养，OGD-R 组细胞用无糖无血清DMEM培养基洗涤2次，然后加入无糖无血清DMEM培养基，放入缺氧培养箱（93%N2，5%CO2，2%O2 ，37℃）中培养2小时；C225干预实验在OGD处理前加入不同浓度的C225（2µg/ml，10µg/ml）预处理1小时，然后同样用无糖无血清DMEM 培养基洗涤2次，加入无糖无血清DMEM培养基并再次加入不同浓度的C225（同前）放入缺氧培养箱中同样缺氧培养2小时；然后将各组细胞取出，换上正常糖、血清的培养基（C225组再次加入C225）放入正常氧培养箱中进行复氧，根据各组复氧不同时间（3h，6h，12h，24h）后收取细胞进行相关检测。
大鼠脊髓星形胶质细胞的体外培养与鉴定
大鼠脊髓星形胶质细胞的体外培养与鉴定作者：马超冯世庆班德翔刘洋高仕杰来源：《中国医学创新》2014年第02期【摘要】目的：探讨大鼠脊髓组织星形胶质细胞体外培养、纯化和鉴定的方法。
方法：于无菌条件下取新生1～2 d的SD大鼠脊髓组织，采用机械吹打及胰酶消化法制成细胞悬液，通过差速贴壁和恒温摇床震荡去除杂细胞，进行培养。
用胶质纤维酸性蛋白（GFAP）免疫细胞化学染色对所培养的细胞进行鉴定。
结果：分离培养的细胞具有典型的星形胶质细胞的形态，传至第3代细胞纯度达95%以上。
结论：成功建立了大鼠脊髓星形胶质细胞体外培养方法，为脊髓星形胶质细胞的实验研究奠定基础。
【关键词】星形胶质细胞；脊髓；细胞培养；大鼠胶质细胞是神经系统内数量众多的一大类细胞群体，约占中枢神经系统细胞的90%以上，而星形胶质细胞是其中最主要的组成成分之一，在调控神经元微环境、诱导神经细胞迁移、维持神经组织形态、提供神经营养因子及辅助完善突触联系等方面均发挥着重要功能[1]。
体外培养是研究星形胶质细胞形态、功能及神经生物学和神经药物学的重要手段，但以往的取材以大脑皮质为主，脊髓相对较少[2-4]。
本研究参照国内外培养分离星形胶质细胞的方法，拟建立脊髓源性星形胶质细胞的体外分离、培养、纯化体系。
1 材料与方法1.1 材料1.1.1 实验动物新生1～2 d的SD大鼠，由天津医科大学实验动物中心提供，雌雄不限。
1.1.2 主要设备及试剂 CO2 培养箱（美国Thermo公司），200目滤网、DMEM/F12培养基（美国HyClone公司），胎牛血清（美国Gibco公司），青霉素-链霉素双抗，EDTA-0.25%胰酶，D-Hank’s液（北京索莱宝公司），兔抗大鼠胶质细胞原纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）多克隆抗体，TRITC标记羊抗兔免疫球蛋白（武汉博士德生物有限公司），倒置相差显微镜、共聚焦荧光显微镜（日本Olympus公司）[2]。
大鼠大脑皮层星形胶质细胞体外培养方法的建立及鉴定
ＲＡＴ’ Ｓ ＣＥＲＥＢＲＡＩ Ｃ０ＲＴＥＸ Ｆ ＡＮ Ｙｕ ｅ ， Ｓ ＨＡＮＧＹａ － ｚ ｈ ｅ ｎ
（ Ｈ ｅ ｂ ｅ ｉ Ｋ ｅ ｙ Ｌ ａ ｂ ｏ ｒ ａ ｔ ｏ ｒ ｙ ｏ ｆ Ｓ ｔ ｕ ｄ ｙ ａ ｎ ｄ Ｅ ｘ ｐ ｌ ｏ ｉ ｔ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｏ ｆ Ｃ ｈ ｉ ｎ ｅ ｓ ｅ Ｍｅ ｄ ｉ ｃ ｉ ｎ ｅ ， Ｉ ｎ ｓ ｔ ｉ ｔ ｕ ｔ ｅ ｏ ｆ Ｔ ｒ ａ ｄ ｉ ｔ ｉ ｏ ｎ ａ ｌ Ｃ ｈ ｉ ｎ ｅ ｓ ｅ Ｍ ｄｉ ｅ ｃ ｉ ｎ ｅ ， Ｃ ｈ ｅ ｎ ｇ ｄ ｅ
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星形胶质细胞 的形 态且 生长旺盛 ， 第３代星形胶质细胞纯度达９ ５ ％。 结论 ： 本研究建立 的星形胶质 细胞体 外培 养方法操作简单 、 可靠 。
新生大鼠大脑皮层少突胶质前体细胞的培养分离及鉴定
新生大鼠大脑皮层少突胶质前体细胞的培养分离及鉴定【摘要】［目的］探讨新生（spraguedaley,SD）大鼠大脑皮层少突胶质前体细胞在体外条件下的生长情况及培养分离，以获得纯化的少突胶质前体细胞，为今后细胞移植治疗研究提供良好的种子细胞。
［方法］出生48hSD大鼠取大脑皮层进行混合胶质细胞的体外培养，原代培养第9～10d时采用水平振荡、差速贴壁的方法分离、纯化少突胶质前体细胞，继续用定向培养基传代培养。
相差显微镜观察少突胶质前体细胞在体外条件下的生长情况，免疫细胞化学技术进行细胞鉴定。
［结果］混合胶质细胞原代培养第9～10d时出现明显的细胞分层，少突胶质前体细胞散布于单层的星形胶质细胞表面，胞体呈椭圆形或圆形，具有典型的双极突起，少数呈三极突起。
经振荡分离后少突胶质前体细胞纯度达95％，少突胶质细胞特异性标记lig2反应阳性，胶质纤维酸性蛋白抗体反应阴性。
［结论］新生SD大鼠大脑皮层原代培养中少突胶质前体细胞能够维持在未成熟阶段，细胞分层后通过振荡法及差速贴壁法可以获得较高纯度的少突胶质前体细胞。
【关键词】少突胶质前体细胞;细胞培养；脱髓鞘化；脊髓损伤Keyrds：ligdendrytepreursrell;ellulture;deyelinatin;spinalrdinjury脊髓损伤是一种常见的中枢神经系统损伤，可以造成患者严重的神经功能损害。
目前，临床上尚无有效办法治疗脊髓损伤。
随着研究深入，人们对于脊髓损伤的病理过程有了更进一步的认识。
脊髓损伤不仅导致神经元丢失，同时还造成大量少突胶质细胞的死亡，从而引起残留神经轴突的脱髓鞘改变，进一步影响了脊髓神经功能的恢复。
近来不少研究显示通过髓鞘形成细胞移植治疗脊髓损伤，有利于脱髓鞘轴突的再髓鞘化，促进损伤脊髓的神经功能恢复［1,2］。
研究表明，少突胶质细胞不仅形成髓鞘包绕轴突，同时它还起着为其他神经细胞提供营养因子、促进轴突生长等作用［3］。
此外，少突胶质前体细胞是处于分化早期阶段的未成熟细胞，既能够定向分化为成熟少突胶质细胞，同时又具有一定的增殖与迁移能力［4］，更加适合于细胞移植治疗。
离体脊髓星形胶质细胞的纯化与鉴定
离体脊髓星形胶质细胞的纯化与鉴定【摘要】目的探讨新生大鼠脊髓星形胶质细胞的分离、培育与传代及纯化方式，鉴定其培育纯度。
方式分离、培育新生大鼠脊髓星形胶质细胞，用换液时暴露结合旋转法加以纯化，酶消化法传代后进行免疫组化鉴定，并染核计数星形胶质细胞的纯度。
结果星形胶质细胞贴壁快，多在12 h内，3 d后数量显著增加；免疫细胞化学染色显示，NF200抗体染色为阴性，提示培育盖片中不含神经元；GFAP阳性染色细胞高达%。
结论换液时短暂暴露结合恒温旋转法可纯化取得高纯度的星形胶质细胞，是一种简单、高效的星形胶质细胞纯化方式。
【关键词】星形胶质细胞；神经微丝蛋白；胶质纤维酸性蛋白Purification and identification of astrocyte of spinal cord in vitroAbstract: Objective To explore the method of isolation, culture, and purification of astrocyte derived from spinal cord of neonate rats, and identified by immunocytochemical stain. Methods Astrocyte derived from spinal cord of neonate rats were isolated and cultured, purified by exposed a short time when exchanging medium and rotation. Passage through enzymedigestion and identified by immunocytochemical stain, to count the purity coefficient of astrocyte. Results Astrocytes adhered after plated 12 h, the numbers increased significantly after 3 d. Immunocytochemical stain showed: there were no neuron on culture covers because the stain of NF200 was negative, while the positive rate of GFAP stain was up to %. Conclusion High purified astrocytes could be got by exposed a short time when exchanging medium and rotation, so it is a simple and high effective method for the purification of astrocyte.Keywords: astrocyte; neurofilament; glial fibrillary acidic protein最近几年，神经胶质细胞（astrocyte，AST）已成为神经科学研究的热点之一［1］，它不仅具有支持、分隔、营养和爱惜神经元的作用，而且参与了脑的高级功能活动，并在突触形成中起着重要作用［2-3］。
白藜芦醇对培养大鼠脑皮层星形胶质细胞增殖及谷氨酸代谢的影响
白藜芦醇(resveratrol ，Res)是一种多酚类化合物，化学名为3，5，4，三羟基－反－均二苯乙烯，分子量为228．25。
在多种植物中发现，如葡萄、浆果和花生。
近年来的研究焦点都集中在其抗血小板聚集，抗氧化，抗炎特性及其抗肿瘤作用等。
而对正常的星形胶质细胞的谷氨酸代谢功能方面研究较少。
谷氨酸（盐）是中枢神经系统主要的兴奋性神经递质，其累积会导致神经变性紊乱。
星形胶质细胞是脑负责谷氨酸（盐）转运的主要胶质细胞，通过谷氨酸依赖性的转运体（GLAST 和GLT-1）调节其细胞外水平。
星形胶质细胞具有特异酶即谷氨酰胺合成酶（Glutamine Synthetase,GS ）能催化谷氨酸（盐）的酰胺化反应形成谷氨酰胺，后者对神经元细胞具有重要作用。
而且，星形胶质细胞摄取谷氨酸也可以合成维持谷胱苷肽，维持脑的抗氧化功能。
本文主要通过白藜芦醇影响皮层星形胶质细胞的增殖及谷氨酸代谢功能，而对其神经保护作用进行研究。
1材料与方法1.1主要试剂与仪器设备白藜芦醇（德宝生化，HPLC>98%)，GFAP 抗体（CHEMICON ）,免疫组化试剂盒与DAB 显色试剂盒（中杉金桥），高糖DMEM (GIBCO)，胎牛血清（GIBCO ）,总GSH 检测试剂盒作者单位：350001福建医科大学协和临床医学院检验科通讯作者：曹颖平白藜芦醇对培养大鼠脑皮层星形胶质细胞增殖及谷氨酸代谢的影响郑小华曹颖平侯娟王梅华郑培烝【摘要】目的探讨不同浓度白藜芦醇(resveratrol ，Res)对培养大鼠脑皮层星形胶质细胞增殖及谷氨酸代谢功能的影响。
方法原代提取并纯化培养脑皮层星形胶质细胞。
采用5-溴脱氧尿核苷（BrdU ）掺入法检测细胞增殖；通过同位素掺入法和ELISA 法检测谷氨酸代谢指标：谷氨酸摄取量、总谷胱苷肽（GSH ）含量和谷氨酰胺合成酶（Glutamine Synthetase,GS ）含量与活性。
结果Res 抑制细胞增殖并随着浓度升高和培养时间延长而抑制增强。
大鼠大脑皮层星形胶质细胞体外培养方法建立及鉴定
大鼠大脑皮层星形胶质细胞体外培养方法建立及鉴定范悦;颜勇;商亚珍【摘要】目的:纯化和鉴定体外培养的大鼠大脑皮层星形胶质细胞.方法:取1～3天新生大鼠大脑皮层细胞进行体外培养,通过差速贴壁和传代去除成纤维细胞和神经元等,采用免疫组化法检测星形胶质细胞特异性蛋白一胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)鉴定星形胶质细胞.结果:培养的细胞具有典型的星形胶质细胞形态且生长旺盛,第3代95％以上为星形胶质细胞,特异性抗原GFAP 表达阳性.结论:该方法操作简单,可靠,是一种有效的新生大鼠大脑皮层星形胶质细胞体外培养方法.【期刊名称】《神经药理学报》【年(卷),期】2011(001)006【总页数】6页(P22-27)【关键词】星形胶质细胞;体外培养;免疫组织化学;胶质纤维酸性蛋白【作者】范悦;颜勇;商亚珍【作者单位】河北省中药研究与开发重点实验室,承德医学院中药研究所,承德,067000,中国;河北省中药研究与开发重点实验室,承德医学院中药研究所,承德,067000,中国;河北省中药研究与开发重点实验室,承德医学院中药研究所,承德,067000,中国【正文语种】中文【中图分类】R965.2神经胶质细胞是神经组织中除神经元以外的另一大类细胞，广泛分布于中枢神经和周围神经。
中枢神经胶质细胞主要有三大类：星形胶质细胞、少突胶质细胞和小胶质细胞，其中星形胶质细胞数量最多，几乎承担着胶质细胞所有的功能。
星形胶质细胞与神经元之间存在复杂的联系与作用，以此维持神经系统内环境的稳定，星形胶质细胞直接参与了神经元的生长发育、生理生化以及病理生理过程［1-2］。
星形胶质细胞作为中枢神经系统的免疫吞噬细胞，在致炎因素作用下被激活成反应性星形胶质细胞，其既具有保护神经元的作用，也能分泌细胞毒因子、炎症因子、补体蛋白损害神经元［3］。
本实验建立了一种实验室内可行的，细胞纯度较高的星形胶质细胞体外培养方法，为星形胶质细胞的生物学研究提供条件。
Long Evans大鼠视皮层星型胶质细胞的体外培养
胶质细胞是神经系统内数量众多的一大类细胞群体，约占中枢神经系统（central nervous system，CNS）细胞总数的90%，星型胶质细胞（astrocyte）是其中主要的组成成分。
传统观念一直认为，胶质细胞在神经系统中仅起辅助作用，是支持神经元的骨架，为神经元提供营养以及清除突触间隙中过多的离子和（或）神经递质。
胶质细胞英文名Glia来自希腊语Glu，意为胶质。
自1997年Pfrieger和Barres[1]发现胶质细胞能促进神经元间的突触联系后，对胶质细胞的认识进入了一个崭新的阶段。
现已发现星型胶质细胞不仅参与维持中枢神经系统的正常结构和功能[2-4]，而且具有神经营养和神经生长抑制作用[5-6]。
此外，星型胶质细胞在脑损伤、神经退行性疾病和神经再生过程中均发挥着作用[7-8]。
本实验通过大鼠视皮质星型胶质细胞的原代和传代培养，采用免疫荧光化学方法进行鉴定，以期建立星型胶质细胞体外培养体系，为体外研究星型胶质细胞的功能和机制奠定基础。
1材料与方法1.1材料1.1.1实验动物动物采用出生1d的清洁级Long Evans（LE）新生鼠，雌雄不限，体质量3~5g，购于第三军医大学大坪医院野战外科研究所实验动物中心，动检证字SCXK（渝）20020003。
1.1.2主要试剂DMEM/F12培养液（Gibco，USA）；胰蛋白酶（Sig-ma，USA）；胎牛血清（Gibco，USA）；D-Hanks（天津百浩生物科技有限公司，中国）；小鼠抗胶质纤维酸性蛋白（GFAP）单克隆抗体（Sigma，USA）；小鼠抗硫酸软骨素（CS-56）单克隆抗体（Abcam，UK）；FITC标记的兔抗小鼠IgG（Sigma，USA）。
1.2方法1.2.1视皮层星型胶质细胞的培养新生LE大鼠经75%乙醇消毒5min后迅速断头处死，沿矢状线剪开，剥除头皮及颅骨，用解剖镊将大脑及小脑完整取出，置入一盛有4℃无菌解剖液的培养皿中，体视显微镜下剥离软脑膜。
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大鼠大脑皮层星形胶质细胞原代培养及传代
、试剂
Poly-L-lysine (Sigma,P2636)
DMEM (Invitrogen,11995-065)
二、器械
手术器械：眼科剪x2、眼科镊直、弯各x2、显微镊x2 （金钟，WA3050）、显微剪
x1
3ml 移液管( Biologix, 30-0138A1)
南京军区总院神经内科实验室 许丽丽 2012-12-01
1) 2) 3) FBS (Invitroge,10099-141)
4) HBSS, no Calcium, no Magnesium (Invitrogen, 14170-112)
5) 0.25% Trypsin-EDTA ( Invitrogen, 25200-056)
6) DPBS (HyClone ，SH30028.01B )
7) dd H 2O
8) 75％酒精
1) 2) 100 ml 小烧杯
3) 200 目不锈钢筛
4) 细胞计数器（求精）
5) 50ml 离心管( Corning ， 430828)、 15ml 离心管( Corning ， 430790)
6) 25ml 培养瓶( Corning ， 430639)或 75ml 培养瓶( Corning ， 430641)
7) 100ml 玻璃瓶（蜀牛）
8) 直径为 60mm 的培养皿 LabServ,310109010)
9)
10) 过滤器( Millex-GP, SLGP033R)B
11) 注射器：50ml、5ml 各1
12) Pipette and pipette tips
13) 冰袋、手套、口罩
Day 1
1、消毒
1.1 将解剖器械、枪头高温高压消毒15 分钟，消毒结束后放入烘箱中烘干待第二天使用。
1.2 打开操作台紫外线灯消毒30 分钟。
2、包被培养板
2.1 戴手套，用酒精棉球擦拭操作台、移液枪，点燃酒精灯。
2.2取PLL用DPBS将其稀释至100 pg/ml 。
2.3以PLL包被培养瓶，量以覆盖培养瓶底面为宜。
25ml培养瓶：3ml ；75ml培养瓶: 8m l 。
过夜。
3、配置培养基、消化酶
3.1 DMEM with 10% FBS
FBS：DMEM=1：10
取FBS8ml、DMEM 80ml加入100ml高温高压过的玻璃瓶中。
3.2 0.125％胰酶
取0.25%Trypsin-EDTA用DPBS稀释 2 倍。
将配置好的培养基、消化酶放入4°冰箱中，待第二天使用。
4、消毒
操作台使用完毕后清理垃圾，用酒精棉球擦拭操作台、移液枪，关闭酒精灯，打开紫外线灯消毒30 分钟。
Day 2
1、消毒
打开操作台紫外线灯消毒30 分钟。
2、洗板
用ddH20洗涤3 x 5 min,放入培养箱中晾干。
3、解剖新生鼠（所有操作在冰袋上进行）
3.1 将出生24小时之内的新生鼠在100ml 烧杯中用75%酒精浸泡5min。
3.2 戴手套,用酒精棉球擦拭操作台、移液枪,点燃酒精灯。
3.3取2个培养皿，内乘HBSS放置在冰袋上。
3.4 剪去新生鼠的头，将头放入一个培养皿中。
3.5 用眼科剪把新生鼠头骨剪开，取出脑组织，将脑组织放入另一乘HBSS的培养皿中（将
所有的新生鼠都同样处
理）。
3.6 用两支显微镊分离脑膜，尽可能的去掉所有的血管和血管膜，将分离好的脑组织放入
另一新的内乘HBSS的培养皿
中。
3.7 将分离好的脑膜用显微剪剪碎脑组织，约1mm3。
4、接种细胞
4.1用移液管将剪碎的脑组织移入两个15 ml离心管中。
4.2每支离心管加入3 ml 0.125%胰酶，摇匀，37C消化15分钟（为增加接触面积消化更充
分可将离心管平放，也可以用60 mm 培养皿消化。
）
4.3 消化期间整理操作
台。
4.4消化15min后，用移液管除去胰酶，每支离心管加入2 ml 10% FBS/DMEM终止消化。
4.5吹打：用1 ml枪头，吹打40次，静止2分钟，将上面液体移入一新的15ml离心管中。
F面沉淀的细胞团块不要丢弃，加入1-1.5ml10% FBS/DMEM吹打20次，重复上面的步骤。
一共这样分次吹打3次。
3次之后如果还有团块在下面，果断丢弃。
（ 吹打时候要注意，切 忌过快，要缓慢吹打。
吸入时候要很缓慢，吹出的时候可以略快，但是也要缓慢。
）
弃上清，沉淀的细胞加10% FBS/DMEM3ml 重悬，轻柔吹打100次（具体吹打次数据细 胞计数时看到的情况而定，若看到大量细胞团，应加大吹打次数）。
4.10用细胞计数板计数：细胞浓度 =（4个大格细胞总数/4） X 41Z0il 4.11调浓度，接种。
接种后摇晃培养板摇匀细胞（注意不要圈圈摇晃，圈圈摇晃会导致神经
元都集中到培养板的孔中间，导致浓度不均，生长不均匀。
要左右平行翻转角度，然后前后 平行翻转角度）。
具体细胞接种数值:
5、消毒
实验结束后清理垃圾，清洗器械，用酒精棉球擦拭操作台、移液枪，关闭酒精灯，打开紫外 线灯消毒30分钟。
6、换液
细胞种植成功后24小时全量换液，以后每天观察细胞生长状态，每 3天半量换液。
注意：换 液前要将10%FBS/DMEM 放入 37C 细胞培养箱中预热半小时。
7、传代
7.1待细胞长到第10天或看到细胞细胞爬满培养瓶的 90%左右时，在37C 恒温摇床200g/min 震荡 12-14 小时，全量换液。
4.6 过筛网至60 mm 培养皿中。
4.7 将培养皿中液体移入2支15 ml 离心管中。
4.8 离心：800g/min,5min 。
4.9
7.2震荡过后，弃培养基，DPBS洗涤2-3次，加入适量0.25%夷酶，37E消化1-3min （以镜下看到细胞突触回缩为最佳）。
7.3加入2ml 培养基中和胰酶，用移液管轻轻吹打细胞壁，使贴壁细胞脱落。
7.4将培养基移入15ml离心管中，200g/min离心5min,弃上清。
7.5加入新的培养基，吹打100次，使细胞散开。
7.6将细胞移入培养皿中，孵箱培养10-15min 后，将皿中培养液移至新的培养瓶中（不用包被）。
7.7每天观察细胞生长状态，每3天半量换液，待细胞爬满培养瓶的90%左右，可继续传代或
消化后将细胞接种在爬片中，进行下一步实验。