大鼠大脑皮层星形胶质细胞原代培养及传代
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大鼠大脑皮层星形胶质细胞原代培养及传代
、试剂
Poly-L-lysine (Sigma,P2636)
DMEM (Invitrogen,11995-065)
二、器械
手术器械:眼科剪x2、眼科镊直、弯各x2、显微镊x2 (金钟,WA3050)、显微剪
x1
3ml 移液管( Biologix, 30-0138A1)
南京军区总院神经内科实验室 许丽丽 2012-12-01
1) 2) 3) FBS (Invitroge,10099-141)
4) HBSS, no Calcium, no Magnesium (Invitrogen, 14170-112)
5) 0.25% Trypsin-EDTA ( Invitrogen, 25200-056)
6) DPBS (HyClone ,SH30028.01B )
7) dd H 2O
8) 75%酒精
1) 2) 100 ml 小烧杯
3) 200 目不锈钢筛
4) 细胞计数器(求精)
5) 50ml 离心管( Corning , 430828)、 15ml 离心管( Corning , 430790)
6) 25ml 培养瓶( Corning , 430639)或 75ml 培养瓶( Corning , 430641)
7) 100ml 玻璃瓶(蜀牛)
8) 直径为 60mm 的培养皿 LabServ,310109010)
9)
10) 过滤器( Millex-GP, SLGP033R)B
11) 注射器:50ml、5ml 各1
12) Pipette and pipette tips
13) 冰袋、手套、口罩
Day 1
1、消毒
1.1 将解剖器械、枪头高温高压消毒15 分钟,消毒结束后放入烘箱中烘干待第二天使用。
1.2 打开操作台紫外线灯消毒30 分钟。
2、包被培养板
2.1 戴手套,用酒精棉球擦拭操作台、移液枪,点燃酒精灯。
2.2取PLL用DPBS将其稀释至100 pg/ml 。
2.3以PLL包被培养瓶,量以覆盖培养瓶底面为宜。25ml培养瓶:3ml ;75ml培养瓶: 8m l 。过夜。
3、配置培养基、消化酶
3.1 DMEM with 10% FBS
FBS:DMEM=1:10
取FBS8ml、DMEM 80ml加入100ml高温高压过的玻璃瓶中。
3.2 0.125%胰酶
取0.25%Trypsin-EDTA用DPBS稀释 2 倍。
将配置好的培养基、消化酶放入4°冰箱中,待第二天使用。
4、消毒
操作台使用完毕后清理垃圾,用酒精棉球擦拭操作台、移液枪,关闭酒精灯,打开紫外线灯消毒30 分钟。
Day 2
1、消毒
打开操作台紫外线灯消毒30 分钟。
2、洗板
用ddH20洗涤3 x 5 min,放入培养箱中晾干。
3、解剖新生鼠(所有操作在冰袋上进行)
3.1 将出生24小时之内的新生鼠在100ml 烧杯中用75%酒精浸泡5min
。
3.2 戴手套,用酒精棉球擦拭操作台、移液枪,点燃酒精灯。
3.3取2个培养皿,内乘HBSS放置在冰袋上。
3.4 剪去新生鼠的头,将头放入一个培养皿中。
3.5 用眼科剪把新生鼠头骨剪开,取出脑组织,将脑组织放入另一乘HBSS的培养皿中(将
所有的新生鼠都同样处
理)。
3.6 用两支显微镊分离脑膜,尽可能的去掉所有的血管和血管膜,将分离好的脑组织放入
另一新的内乘HBSS的培养皿
中。
3.7 将分离好的脑膜用显微剪剪碎脑组织,约1mm3。
4、接种细胞
4.1用移液管将剪碎的脑组织移入两个15 ml离心管中。
4.2每支离心管加入3 ml 0.125%胰酶,摇匀,37C消化15分钟(为增加接触面积消化更充
分可将离心管平放,也可以用60 mm 培养皿消化。)
4.3 消化期间整理操作
台。
4.4消化15min后,用移液管除去胰酶,每支离心管加入2 ml 10% FBS/DMEM终止消化。
4.5吹打:用1 ml枪头,吹打40次,静止2分钟,将上面液体移入一新的15ml离心管中。
F面沉淀的细胞团块不要丢弃,加入1-1.5ml10% FBS/DMEM吹打20次,重复上面的步骤。
一共这样分次吹打3次。3次之后如果还有团块在下面,果断丢弃。( 吹打时候要注意,切 忌过快,要缓慢吹打。吸入时候要很缓慢,吹出的时候可以略快,但是也要缓慢。)
弃上清,沉淀的细胞加10% FBS/DMEM3ml 重悬,轻柔吹打100次(具体吹打次数据细 胞计数时看到的情况而定,若看到大量细胞团,应加大吹打次数)。
4.10用细胞计数板计数:细胞浓度 =(4个大格细胞总数/4) X 41Z0il 4.11调浓度,接种。接种后摇晃培养板摇匀细胞(注意不要圈圈摇晃,圈圈摇晃会导致神经
元都集中到培养板的孔中间,导致浓度不均,生长不均匀。要左右平行翻转角度,然后前后 平行翻转角度)。
具体细胞接种数值:
5、消毒
实验结束后清理垃圾,清洗器械,用酒精棉球擦拭操作台、移液枪,关闭酒精灯,打开紫外 线灯消毒30分钟。
6、换液
细胞种植成功后24小时全量换液,以后每天观察细胞生长状态,每 3天半量换液。注意:换 液前要将10%FBS/DMEM 放入 37C 细胞培养箱中预热半小时。
7、传代
7.1待细胞长到第10天或看到细胞细胞爬满培养瓶的 90%左右时,在37C 恒温摇床200g/min 震荡 12-14 小时,全量换液。
4.6 过筛网至60 mm 培养皿中。
4.7 将培养皿中液体移入2支15 ml 离心管中。
4.8 离心:800g/min,5min 。
4.9