大鼠大脑皮层神经元细胞原代培养
大鼠大脑皮层星形胶质细胞原代培养及传代
大鼠大脑皮层星形胶质细胞原代培养及传代、试剂Poly-L-lysine (Sigma,P2636)DMEM (Invitrogen,11995-065)二、器械手术器械：眼科剪x2、眼科镊直、弯各x2、显微镊x2 （金钟，WA3050）、显微剪x13ml 移液管( Biologix, 30-0138A1)南京军区总院神经内科实验室 许丽丽 2012-12-011) 2) 3) FBS (Invitroge,10099-141)4) HBSS, no Calcium, no Magnesium (Invitrogen, 14170-112)5) 0.25% Trypsin-EDTA ( Invitrogen, 25200-056)6) DPBS (HyClone ，SH30028.01B )7) dd H 2O8) 75％酒精1) 2) 100 ml 小烧杯3) 200 目不锈钢筛4) 细胞计数器（求精）5) 50ml 离心管( Corning ， 430828)、 15ml 离心管( Corning ， 430790)6) 25ml 培养瓶( Corning ， 430639)或 75ml 培养瓶( Corning ， 430641)7) 100ml 玻璃瓶（蜀牛）8) 直径为 60mm 的培养皿 LabServ,310109010)9)10) 过滤器( Millex-GP, SLGP033R)B11) 注射器：50ml、5ml 各112) Pipette and pipette tips13) 冰袋、手套、口罩Day 11、消毒1.1 将解剖器械、枪头高温高压消毒15 分钟，消毒结束后放入烘箱中烘干待第二天使用。
1.2 打开操作台紫外线灯消毒30 分钟。
2、包被培养板2.1 戴手套，用酒精棉球擦拭操作台、移液枪，点燃酒精灯。
2.2取PLL用DPBS将其稀释至100 pg/ml 。
2.3以PLL包被培养瓶，量以覆盖培养瓶底面为宜。
原代培养
原代培养：清洁级180-220g SD大鼠，断头处死，无菌操作取一段胸主动脉，洗去血液，去除外膜纤维脂肪组织，用眼科剪纵行剪开血管，刀片刮血管内膜2~3遍，然后将血管切成约1mm2大小碎片，分装贴入培养瓶中，加入含10%小牛血清的DMEM培养基，倒置3~4小时后翻转，于37% 5%CO2的细胞培养箱中静置3天(静置期间不许震动或移动培养瓶, 以防刚贴壁的组织细胞块脱落)，然后每2天换液。
一般4~7天左右平滑肌细胞从组织块中爬出，2~3周出现致密细胞层。
待细胞快融合时用0.25%胰蛋白酶消化传代，取3-8代细胞做实验。
细胞传代：将原代细胞培养瓶中的培养液吸出, 加D-Hanks液到瓶中清洗细胞表面2次。
弃掉清洗液，加入0.25%胰蛋白酶1.0 ml, 将消化液均匀覆盖细胞表面，消化时间为2~4 min。
这时在倒置显微镜下观察, 可见细胞成片皱缩变圆，细胞边缘折光增强。
在细胞未脱落前倒去消化液，立即加入血清或含血清的培养基以终止消化。
然后用滴管将细胞从培养瓶壁上轻轻反复吹打下来。
然后根据细胞密度, 以1: 2~4分瓶培养。
每2~3天换液, 待细胞生长到接近融合时(一般为7~10天)再传代。
hpsusan2006 wrote:我们培养血管平滑肌采用的也是组织块法，尝试想用消化酶消化老养不成，但组织块法从组织块爬出细胞挺费时间，要好几个礼拜，一旦细胞传代后速度就快了，方法和上面说的差不多（北国木棉）但是我们胰酶浓度用的0.2％的，可供大家参考，还用双抗液用的浓度100U/ml。
下面是一张组织块周围爬出的细胞。
我现在的方法是组织块法，效果还是理想的。
就我的经验而言，一般5－7天细胞就可以从组织中爬出来了。
但是那些一开始取材时就游离出来的细胞倒是最快长成集落（一般3到4天）。
有几点我个人的经验：1.取材要熟练，尽量缩短时间，如果可以把从取材到铺瓶的时间缩短到15分钟以内，那么最终的成功率会比较高。
时间拖得越长，最终的细胞长出来的时间越是慢甚至最后会失败。
各类神经元细胞的培养方法
体外神经细胞的培养已成为神经生物学研究中十分有用的技术手段。
神经细胞培养的主要优点是:(1)分散培养的神经细胞在体外生长成熟后,能保持结构和功能上的某些特点, 而且长期培养能形成髓鞘和建立突触联系,这就提供了体内生长过程在体外重现的机会。
(2)能在较长时间内直接观察活细胞的生长、分化、形态和功能变化,便于使用各种不同的技术方法如相差显微镜、荧光显微镜、电子显微镜、激光共聚焦显微镜、同位素标记、原位杂交、免疫组化和电生理等手段进行研究。
(3)易于施行物理（如缺血、缺氧）、化学和生物因子（如神经营养因子）等实验条件, 观察条件变更对神经细胞的直接或间接作用。
(4)便于从细胞和分子水平探讨某些神经疾病的发病机制，药物或各种因素对胚胎或新生动物神经细胞在生长、发育和分化等各方面的影响。
我们实验室从80年代始开展了神经细胞的体外培养工作，取得了一些经验，现将培养细胞分类及方法简要介绍如下:一、鸡胚背根神经节组织块培养主要用于神经生长因子（NGF）等神经营养因子的生物活性测定。
在差倒置显微镜下观察以神经突起的生长长度和密度为指标半定量评估NGF的活性。
1、材料和方法（1）选正常受精的鸡蛋，置于37℃生化培养箱内孵化，每日翻动鸡蛋一次。
（2）取孵化8-12 d 的鸡蛋, 用70% 酒精消毒蛋壳，从气室端敲开蛋壳，用消毒镊剥除气室部蛋壳。
（3）用弯镊钩住鸡胚颈部，无菌条件下取出鸡胚置小平皿内，除去头部后，腹侧向上置灭菌毛玻璃片上,用眼科弯镊子打开胸腹腔，除去内脏器官。
（4）在解剖显微镜下，小心除去腹膜，暴露脊柱及其两侧，在椎间孔旁可见到沿脊柱两侧排列的背根节（图1），用一对5号微解剖镊小心取出。
（5）置背根节于解剖溶液内，用微解剖镊去除附带组织，接种于涂有鼠尾胶的玻璃或塑料培养瓶中，在DMEM无血清培养液中培养。
2、结果鸡胚背根神经节在含神经生长因子(NGF, 2.5S，20ng/ml)的无血清培养液中培养24 h,神经节长出密集的神经突起。
大鼠大脑皮质神经元的原代培养
大鼠大脑皮质神经元的原代培养【摘要】目的探讨大鼠大脑皮质神经元的培养方法。
方法体外原代培养新生大鼠大脑皮质神经元，应用免疫细胞化学法及电子显微镜鉴定神经元。
结果用神经基础培养基(Neurobasal-A)+B27培养的神经元纯度可达85%，生长状态较佳。
结论以Neurobasal-A+B27培养的大鼠大脑皮质神经元活性较佳，纯度较高，是体外研究神经系统相关理论的良好模型。
【关键词】大脑皮质; 神经元; 疾病模型，动物；细胞，培养的ABSTRACT: Objective To establish a primary culture method of the rat cortical neurons. Methods Primary culture of cortical neurons was made from newborn rats. Immunocytochemical and electronic micoscopic methods were used to identify the cultured neurons. Results The primary cortical neurons cultured with neurobasal-A/B27 grew quite well and the purity was about 85%. Conclusion The primary cortical neurons cultured with neurobasal-A/B27 medium are active and rather pure and could be a good model for research of the nervous system.KEY WORDS: cerebral cortex; neurous; disease models，animal; cells，cultured; nuride中枢神经系统的各种疾病如缺氧缺血性脑病、中风等对大脑皮质神经元均有不同程度的损伤，为研究其具体的作用机理及防治措施，建立合适的体内外模型至关重要。
神经元细胞原代培养完美版说明(重医舟之行)
神经元细胞原代培养完美版说明1.材料选择。
一定要严格按照国际上，NCBI数据库，其他文献的材料一致。
胎鼠就要胎鼠，新生鼠就要新生鼠，不能混淆。
因为新生鼠有一些受体，在培养的工作中失去功能，会不能再生，比如NMDA 受体。
和文献不同会导致错误结论，甚至困惑。
很多人写信问我新生鼠的培养问题，我回答用新生鼠的实验很少，八成是你自己搞错了实验对象，请确认国际上的相关研究文献所用老鼠，再来问我下面的问题。
2.培养基选择(neurbasal/neurobasal-a,invitrogen Co.ltd)。
我强烈不建议用血清培养。
原因是：首先，血清刺激胶质细胞和杂细胞分裂，最后非常影响神经元产量;其次，为了抑制胶质生长，往往要加入阿糖孢苷。
严重的毒性会影响许多灵敏实验;再次，最重要的，血清培养的细胞状态很不均一，从正常到凋亡都有，严重影响试验准确，而无血清专用培养基所有的正常细胞都处于一样的状态，要么都好，要么都差，高度一致。
Invitrogen/GIBCO 无血清培养基neurobasal(neurbasal-A)被认为是最标准，最好的培养基。
需要的添加剂为B27和谷氨酰胺。
培养出的细胞状态均一，胶质细胞几乎不分裂。
其中，neurobasal是胎鼠培养基，而-A 为新生鼠培养基。
不过根据笔者实验，没什么太大区别，都能很轻松培养成功，但是，切忌中途换培养基，要从一而终。
很多实验室是不加抗生素的，也有的实验室加。
由于很多初学者操作不熟练，不注意，很多人会污染，所以我还是建议加双抗。
注意!由于无血清培养基添加剂不是血清，而是人工合成的B27(也有用N2的，但是推荐B27，只差10美金)，血清有复杂的解毒作用而B27没有，双抗对细胞的干扰，无血清培养基要大的多。
所以，如果你在neurobasal里添加抗生素，记得用量只要标准量的一半。
另一个添加成分谷氨酰胺溶液不稳定，所以每次用时候要现配现加。
大概是0.5-2mmol/l大部分人用0.5mmol/l.虽然笔者试过，没加这个也正常生长，但是几乎所有文献都添加，we just simply follow.3.解剖过程一定要全程在冰上遇冷。
大鼠大脑皮层神经元细胞原代培养(严选优质)
大鼠大脑皮层神经元细胞原代培养南京军区总院神经内科实验室许丽丽2012年10月一、试剂1)Poly-L-lysine（Sigma,P2636）2)DMEM（Invitrogen,11995-065）3)FBS（Invitroge,10099-141）4)Neurobasal（Invitrogen, 21103-049）5)B27（Invitrogen ,17504-044）6)GlutaMAX （Invitrogen ,35050-061）7)HBSS, no Calcium, no Magnesium（Invitrogen, 14170-112）8)0.25% Trypsin-EDTA （Invitrogen, 25200-056）9)DPBS（HyClone，SH30028.01B）10)dd H2O11)10％水合氯醛12)75％酒精二、器械1)手术器械：组织剪x2、组织镊x1、直弯镊各x1、眼科剪x2、眼科镊直、弯各x2、显微镊x2（金钟，WA3050）、显微剪x12)200 ml小烧杯（盛放胎鼠）3)200目不锈钢筛4)细胞计数器（求精）5)50ml离心管（Corning，430828）、15ml离心管（Corning，430790）6)6孔板（Corning，3516）或24孔板（Corning，3524）96孔板（cosrer,3599）7)直径为60mm的培养皿（LabServ,310109010）8)3ml移液管（Biologix, 30-0138A1）9)过滤器（Millex-GP, SLGP033RB）10)注射器：50ml、5ml各 111)Pipette and pipette tips12)冰袋、手套、棉球、棉签Day 11、消毒1.1 将解剖器械、枪头高温高压消毒15分钟，消毒结束后放入烘箱中烘干待第二天使用。
1.2 打开操作台紫外线灯消毒30分钟。
2、包被培养板2.1 戴手套，用酒精棉球擦拭操作台、移液枪，点燃酒精灯。
神经元原代培养
神经元原代培养一、准备1. 试剂1）胎牛血清灭活：血清室温自然融解，摇匀。
选用与血清瓶同规格的对照瓶一个，并加入与血清等体积的水。
对照瓶内插入1～2支温度计(保证测试温度的准确性)。
将血清瓶与对照瓶同时放入恒温水浴箱，待温度计所示温度上升至56℃时，定时30分钟。
灭活后分装，10ml/瓶，一瓶放在培养箱做无菌实验，其余-20～-70℃保存。
2）D-Hank’s液(g/L)：NaCl: 8, KCl: 0.4, KH2PO4: 0.06, Na2HPO42H2O: 0.06, NaHCO3: 0.35; 酚红：0.02，超纯水溶解，调节PH至7.2，高压灭菌（购自南方医院临床试验中心）。
3）多聚赖氨酸：避光，用超纯水配制好后过滤，200µl或400µl/tube分装, -20度储存。
母液浓度为5mg/ml，工作液浓度为0.1mg/ml（购自Sigma，P2636，100mg）。
配置方法：20ml超纯水溶解，分装为1ml/管。
用时加入49ml超纯水稀释为0.1mg/ml的工作液。
4）50mM谷氨酸：超纯水溶解，滤过除菌，分装50µl/tube，-20℃保存。
使用时需将终浓度调整为25µM（购自Sigma，G8415，100g，分子量：147.13）。
配制方法：电子天平称量谷氨酸1.4713g，即0.01mol=10mmol，溶于200ml超纯水中，配制为50mM的谷氨酸母液。
例：500ml的Neurobasal Medium中加入Glutamate母液（50mM）250μl，此时终浓度约为25μM。
5）胰蛋白酶：0.25%（购自Hyclone，SH30042.01，100ml）。
6）阿糖胞苷（AraC）母液：10mM，(阿糖胞苷，1：1000稀释用)（购自Sigma，C1768，100mg，分子量：243.22）；配制方法：100mg/243.22≈0.41mM，加入41ml超纯水溶解，配制成10mM的AraC母液。
神经细胞图片集锦（高清）
神经细胞培养精美图片一、细胞种类：原代培养大鼠脑皮质神经元细胞培养天数：8天放大倍数：倒置相差显微镜放大200倍细胞状态说明：细胞之间形成明显的神经网络，神经元胞体呈圆形或椭圆形，突起细长多为2到3个。
二、【原创图片】神经细胞1. 细胞种类：胎鼠（16天）皮层神经元2. 培养的天数：5天3. 放大倍数：数码相机套在倒置显微镜镜头上拍的，倍数不确切。
4. 培养基种类：Neurobasal＋B27＋L-glutamine5. 细胞状态与特征简述：贴壁生长，胞体类圆形，见丝状突起连成网络状。
三、1、细胞种类：大鼠脑皮质神经元2、培养的天数：8天3.放大倍数：倒置荧光显微镜×1004. 培养基种类：高糖DMEM培养基＋10％胎牛血清5.细胞状态与特征简述：MAP-2染色阳性的神经元，染色主要集中在神经元的树突和胞体。
四、1、细胞来源：大鼠脑灰质2、细胞种类：活化的小胶质细胞3、培养的天数：8天4、放大倍数：倒置显微镜×4005、培养基种类：高糖DMEM培养基＋10％胎牛血清6、细胞状态与特征简述：小胶质细胞是脑内的免疫细胞，正常静息状态下呈分支状，本照片为脑损伤后CD68鉴定的染成红色的活化的圆形小胶质细胞。
五．【原创】原代海马神经元细胞1.细胞种类：原代海马神经元细胞；2.Wistar新生24小时大鼠3.培养的天数：原代第7天；4.放大倍数：倒置显微镜 X400；5.培养基种类：DMEM/F12加10%胎牛血清和2%B27（换液用的是无血清培养基）；6.细胞状态与特征简述：神经细胞形态典型，胞体粗大，轴突相互交叉，突起成网络。
六、【原创】1.细胞种类：S-D大鼠原代海马神经元2.培养的天数：第七天3.放大倍速：倒置显微镜放大倍数：100倍4.培养基种类：DMEM+5%马血清＋NT-35.细胞状态与特征简述:细胞贴壁生长，呈锥形或圆形，3－4个突起，透光度很好。
底层有很多扁平的细胞，胞体紧挨着，大部分没有突起，培养第五天时底层以铺满。
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大鼠大脑皮层神经元细胞原代培养
南京军区总院神经内科实验室许丽丽2012年10月
一、试剂
1)Poly-L-lysine（Sigma,P2636）
2)DMEM（Invitrogen,11995-065）
3)FBS（Invitroge,10099-141）
4)Neurobasal（Invitrogen, 21103-049）
5)B27（Invitrogen ,17504-044）
6)GlutaMAX （Invitrogen ,35050-061）
7)HBSS, no Calcium, no Magnesium（Invitrogen, 14170-112）
8)0.25% Trypsin-EDTA （Invitrogen, 25200-056）
9)DPBS（HyClone，SH30028.01B）
10)dd H2O
11)10％水合氯醛
12)75％酒精
二、器械
1)手术器械：组织剪x2、组织镊x1、直弯镊各x1、眼科剪x2、眼科镊直、弯各x2、显
微镊x2（金钟，WA3050）、显微剪x1
2)200 ml小烧杯（盛放胎鼠）
3)200目不锈钢筛
4)细胞计数器（求精）
5)50ml离心管（Corning，430828）、15ml离心管（Corning，430790）
6)6孔板（Corning，3516）或24孔板（Corning，3524）96孔板（cosrer,3599）
7)直径为60mm的培养皿（LabServ,310109010）
8)3ml移液管（Biologix, 30-0138A1）
9)过滤器（Millex-GP, SLGP033RB）
10)注射器：50ml、5ml各 1
11)Pipette and pipette tips
12)冰袋、手套、棉球、棉签
Day 1
1、消毒
1.1 将解剖器械、枪头高温高压消毒15分钟，消毒结束后放入烘箱中烘干待第二天使用。
1.2 打开操作台紫外线灯消毒30分钟。
2、包被培养板
2.1 戴手套，用酒精棉球擦拭操作台、移液枪，点燃酒精灯。
2.2 取PLL，用DPBS将其稀释至100μg/ml。
2.3 以PLL包被培养板，量以覆盖培养板底面为宜。
6孔板：1 ml per well；24孔板：0.5 ml per well；96孔板：0.1 ml per well。
过夜。
3、配置培养基、消化酶
3.1 DMEM with 10% FBS
FBS：DMEM=1：10
取FBS 4ml、DMEM 40ml加入50ml离心管中混合。
3.2 Neurobasal-B27-Glutamine Medium
Neurobasal：B27=50:1
Neurobasal：GlutaMAX =100:1
取Neurobasal 50ml、B27 1ml、GlutaMAX 0.5ml，加入50ml离心管中混合。
3.3 0.125％胰酶
取0.25％Trypsin-EDTA 5ml,用HBSS稀释至10ml。
将配置好的培养基、消化酶放入4°C冰箱中，待第二天使用。
4、消毒
操作台使用完毕后清理垃圾，用酒精棉球擦拭操作台、移液枪，关闭酒精灯，打开紫外线灯消毒30分钟。
Day 2
1、消毒
打开操作台紫外线灯消毒30分钟。
2、洗板
用ddH2O洗涤3 x 5 min，放入培养箱中晾干。
3、解剖孕鼠
3.1 将已消过毒的解剖工具和已乘HBSS的小烧杯端入动物房。
3.2 麻醉：取10％水合氯醛5ml,腹腔注射麻醉孕鼠。
3.3 75％酒精消毒切口部位。
3.4 开腹（尽量开口大一些，便于后面操作）
使用1把组织镊、1把组织剪。
3.5 分离胎囊。
换用另一幅直/弯镊、组织剪。
3.6 将分离出的胎囊放入HBSS中。
4、解剖胎鼠（所有操作在冰袋上进行）
4.1 将盛放胎囊的烧杯放进操作台。
4.2戴手套，用酒精棉球擦拭操作台、移液枪，点燃酒精灯。
4.3 取3个培养皿，内乘HBSS，放置在冰袋上。
将胎鼠从胎囊中取出，剪去头，将胎头放入一个培养皿中。
4.5 用两支显微镊撕开脑膜，取出脑组织，将脑组织放入另一乘HBSS的培养皿中（将所有的胎鼠都同样处理）。
4.6 用两支显微镊分离脑膜，尽可能的去掉所有的血管和血管膜，将分离好的脑组织放入另一新的内乘HBSS的培养皿中。
4.7 将分离好的脑膜用虹膜剪剪碎脑组织，约1mm3。
5、接种细胞
5.1 用移液管将剪碎的脑组织移入两个15 ml离心管中。
5.2 每支离心管加入3 ml 0.125％胰酶，摇匀，37℃消化15分钟（为增加接触面积消化更充分可将离心管平放，也可以用60 mm培养皿消化。
）
5.3 消化期间整理操作台。
5.4 消化15分钟后，用移液管移去胰酶，每支离心管加入2 ml 10％ FBS/DMEM终止消化。
5.5 吹打：用1 ml枪头，吹打40次，静止2分钟，将上面液体移入一新的15ml离心管中。
下面沉淀的细胞团块不要丢弃，加入1-1.5ml10％ FBS/DMEM吹打20次，重复上面的步骤。
一共这样分次吹打3次。
3次之后如果还有团块在下面，果断丢弃。
（吹打时候要注意，切忌过快，要缓慢吹打。
吸入时候要很缓慢，吹出的时候可以略快，但是也要缓慢。
）
5.6 过筛网至60 mm培养皿中。
5.7 将培养皿中液体移入2支15 ml离心管中。
5.8 离心：800转5分钟。
5.9 弃上清，沉淀的细胞加10％FBS/DMEM 3ml重悬，轻柔吹打100次（具体吹打次数据细胞计数时看到的情况而定，若看到大量细胞团，应加大吹打次数）。
5.10 用细胞计数板计数：细胞浓度 = (4个大格细胞总数/4) × 104 /ml
5.11 调浓度，接种。
接种后摇晃培养板摇匀细胞（注意不要圈圈摇晃，圈圈摇晃会导致神经元都集中到培养板的孔中间，导致浓度不均，生长不均匀。
要左右平行翻转角度，然后前后平行翻转角度）。
具体细胞接种数值：
培养液体积（ml/well）细胞密度（个/ml）总细胞数（个/ well）
6孔板 1.5ml 1x1061x106
96孔板0.1ml 1x1061x105
5.12 两小时后全量换液，换用NB27（应提前放入37℃细胞培养箱中预热半小时）。
换液前轻轻晃动培养板（细胞碎片贴壁很慢而且不牢固，这时候的摇晃可以最大程度去掉细胞碎片。
）
6、消毒
实验结束后清理垃圾，清洗器械，用酒精棉球擦拭操作台、移液枪，关闭酒精灯，打开紫外线灯消毒30分钟。
7、换液
细胞培养成功后每天观察细胞生长状态，每 3天1/3量或半量换液。
注意：换液前要将NB27放入37℃细胞培养箱中预热半小时。