cDNA第一链合成试剂盒

cDNA第一链合成试剂盒

操作方法

1、逆转录反应

（1）在无菌薄壁管中加入以下成份：

Total RNA 0.5-1.0μg

(dN)9 or oligo(dT)18100pmol

（2）混匀后，70℃变性5min，将薄壁管迅速置于冰上冷却，然后依次加入以下成份：

5×M-MLV Buffer 4μl

dNTPs（10mM each）1μl

RNasin 10U

100mM DTT 2μl

M-MLV Reverse Transcriptase 100U

DEPC-treated water up to 20μl

（3）混匀后短暂离心，使用oligo(dT)18引物时在42℃，使用随机引物(dN)9时在37℃下温育1小时。

（4） 94℃ 5min终止反应后，冰上冷却。

（5）合成的cDNA第一链可直接用于PCR扩增或进行其它下游操作。

2、PCR扩增

（1）在PCR薄壁管中加入以下试剂

Synthesized cDNA 2-5μl

10×PCR Buffer 2μl

Upper primer 10pmol

Lower primer 10pmol

dNTPs（10mM each）0.5μl

Taq DNA Polymerase 1.5U

ddH2O up to 20μl

（2）混匀后短暂离心，然后进行PCR扩增。

94℃预变性 2.5min。进入下列30~40个循环（此扩增条件仅供参考）：94℃

30s，60℃ 45s，72℃ 1min~3min。最后72℃延伸7min。

注意事项

1、确保RNA完整性及纯度。RNA质量是决定合成cDNA第一链成功的关键因素，

其纯度及完整性可由OD260/OD280比值和进行琼脂糖凝胶电泳检测。较纯的RNA 样品OD260/OD280比值通常为 1.8-2.0，若该比值偏低，应进一步纯化。真核生物RNA样品电泳图谱28s和18s的比值约为2:1，否则，表明有RNA降解。2、避免RNA酶污染。进行cDNA合成所用的器皿、试剂和溶液必须完全无菌。操

作过程始终戴手套以杜绝各种RNA酶的污染。

3、合成cDNA第一链的引物选择。选择oligo(dT)12-18作为反转录引物，可保证

cDNA具有完整的3’-端，通常可得到接近全长的cDNA第一链；若选择随机寡核苷酸(dN)6或(dN)9作为引物，引物在整个mRNA的多个位点退火，产生短的部分长度的cDNA第一链。这种方法经常用于获得5’末端序列及从带有二级结构区域或带有逆转录酶不能复制的终止位点的RNA模板获得cDNA。

常见问题及参考意见

1、cDNA产量很低，为什么？

可能的原因：(1)RNA模板质量低；(2)对mRNA浓度估计过高；(3)反应体系中存在反转录酶抑制剂或反转录酶量不足；(4)反应体积过大，一般不应超过50μl。

2、合成不了长链的cDNA，为什么？

(1) RNA降解。对使用的器具、试剂用DEPC、干热或湿热灭菌处理，以杜绝RNase 污染。同时，在逆转录反应中加入RNase抑制剂。

(2) 反应条件不合适。通过预实验确定最合适的反应条件，包括酶量、盐浓度、

反应温度（37~56℃）、DTT浓度（0.5~10mM）。

(3) RNA结构问题。提高逆转录反应温度，或者使用随机引物。

注：经本公司实验证明某些DEPC处理水可能对Taq DNA聚合酶有抑制作用，因此PCR扩增时建议最好使用超纯水。