ThermoScientificMaxima第一链cDNA合成试剂盒适用于RT-qPCR
总RNA提取,cDNA第一条链合成,cDNA纯化,3‘端加尾实验,荧光定量PCRprotocol
RNA Extraction Protocol1.实验原理异硫氰酸胍/苯酚法-----目前实验室使用的方法！✓细胞在变性剂异硫氰酸胍的作用下被裂解，同时核蛋白体上的蛋白变性，核酸释放✓释放出来的DNA和RNA由于在特定pH下溶解度的不同而分别位于整个体系中的中间相和水相，从而得以分离细胞或组织1. 样品裂解2. 分离总RNA2.实验试剂与器材2.1实验试剂RNA提取试剂Trizol（Invitrogen）、氯仿、异丙醇、75%乙醇、无水乙醇、DEPC 水，反转录试剂盒（Fermentas），cDNA纯化试剂盒（Promega），末端加尾酶TdT （Thermo）。
2.2实验器材微量移液器（Eppendorf），电泳仪，电泳槽，超净工作台，4℃低温离心机（Eppendorf），常温离心机（Eppendorf），匀浆机（IKA），高压蒸汽灭菌锅，通风橱，紫外分光光度计（Eppendorf），PCR仪（Takala），剪刀，镊子，0.2mL、1.5mL离心管，枪头。
3.实验前准备工作实验前将要用到的试剂配好（75%乙醇：75mL的无水乙醇+25mL的去离子水；DEPC水：在1000ml双蒸水中加入DEPC原液1ml，然后摇匀过夜），与离心管、枪头、剪刀、镊子（用DEPC水处理过的，浸泡过夜）一起灭菌（126℃，90min），之后剪刀和镊子最好在紫外灯下照射半小时。
提前20min打开低温离心机预冷。
准备两幅手套，一个口罩，塑胶手套不能离开通风橱，整个实验过程尽量降低外源RNA酶对样品中RNA的降解。
4.实验步骤4.1取样（1）组织样品：将组织在RNA保护液中用剪刀剪碎，每50～100mg组织加入1ml TRIzol，用匀浆仪进行匀浆处理。
样品体积不应超过TRIzol体积10℅。
（2）贴壁培养细胞：不须消化，直接在培养板中加入TRIzol裂解细胞，每10cm2面积（即3.5cm直径的培养板）加1ml，用移液器吸打几次。
第一链cDNA合成试剂盒Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit 中文说明书
第一链cDNA合成试剂盒Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit中文说明书2013-12-07 13:20:16Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒包装与含量小瓶/瓶盖标签适用于a) 04 379012001b)04896866001c************1红色TranscriptorReverseTranscriptase（逆转录酶）a) 1瓶，25 μl (20 U/μl)b) 1瓶，50 μl (20 U/μl)c) 2瓶，各50 μl (20 U/ μl)•储存缓冲液：200 mM 磷酸钾，2 mM 二硫苏糖醇，0.2% Triton X-100(v/v)，50% 甘油(v/v)，pH 约为7.22无色Transcriptor RTReaction Buffer(5×)（逆转录缓冲液）a) 1瓶，1 mlb) 1瓶，1 mlc) 2瓶，各1 ml• 5×浓度：250 mM Tris/HCl，150 mM KCl，40 mM MgCl2，pH约为8.5(25°C)3无色ProtectorRNase Inhibitor（RNase抑制剂）a) 1瓶，50 μl(40 U/μl)b) 1瓶，100 μl(40 U/μl)c) 2瓶，各100 μl(40 U/μl)•储存缓冲液：20 mM Hepes-KOH，50 mM KCl，8 mM 二硫苏糖醇，50 % 甘油(v/v)，pH 约为7.6 (4°C)4黄色/紫色Deoxynuc-leo-tideMix（dNTP）a) 1瓶，100 μl(黄色瓶盖)b) 1瓶，200 μl(紫色瓶盖)c) 2瓶，各200 μl(紫色瓶盖)• dATP, dCTP, dGTP, dTTP各10 mM5蓝色Anchored-oligo(dT)18Primer（锚定oligo(dT)18引物）a) 1瓶，100 μl(50 μM)b) 1瓶，200 μl(50 μM)c) 2瓶，各200 μl(50 μM)6Random Hexamera) 1瓶，100 μl(600 μM)蓝色Primer（随机引物）b) 1瓶，200 μl(600 μM)c) 2瓶，各200 μl(600 μM)7绿色Control RNA（对照RNA）a) 1瓶，20 μl(50 ng/μl)•包含提取于永生细胞系(K562)的总RNA片段稳定溶液8绿色Control Primer Mix PBGD（对照基因引物）a) 1瓶，40 μl•5 μM 人类PBGD特异性正向与反向引物9(b和c为瓶7)无色Water, PCR-gradea) 1瓶，1 mlb) 2瓶，各1 mlc) 3瓶，各1 ml注意：货号为***********和***********的产品不含有control试剂(瓶7和瓶8)，因此瓶7即为Water, PCR-grade。
ThermoScientificRevertAidFirstStrandcDNASynthesisKitK说明书第一链cDNA合成试剂盒
RevertAid第一链cDNA Synthesis试剂盒#K1621, #K1622分析证明书质量控制#K1621Lot采用100 fg对照GAPDH RNA和对照引物进行RT-PCR反应，通过在1%琼脂糖上进行凝胶电泳和溴化乙锭染色显示得到足够量的496 bp的产物质量认证人：Jurgita Zilinskiene目录页码试剂盒组成 (2)存储条件 (2)产品说明 (2)注意事项 (3)操作步骤 (6)RT-PCR (6)合成cDNA用于克隆………..………………………………………7 实验对照……………………………………………………………….8 问题分析与解决 (10)** 一个单位的RiboLockRNase酶抑制剂抑制5ng RNA酶A 50%的活性。
存储条件试剂盒中所有组分应存储在-20°C。
对照用RNA可存储于-70°C以便长期使用。
产品说明RevertAid第一链cDNA合成试剂盒以mRNA或者总RNA为模板，高效合成第一链cDNA。
本试剂盒使用RevertAid M-MuLV反转录酶，它的RNA酶H的活性与AMV反转录酶相比较低。
该反转录酶可耐受42-50°C温度，合成的cDNA片段长度达13kb。
试剂盒中含有RiboLock 重组RNA酶抑制剂，防止RNA降解，可耐受55°C高温。
试剂盒同时含有oligo(dT)18和随机六聚体引物。
随机六聚体引物与模板非特异性地结合，以总RNA中任何RNA为模板合成cDNA。
oligo(dT)18选择性和RNA 3’po ly(A)配对结合，只以有poly(A)尾巴的mRNA为模板合成cDNA。
使用本试剂盒也可采用序列特异性引物。
合成的第一链cDNA能直接用作PCR或荧光定量PCR的模板，第二链cDNA的合成或线性RNA扩增，也可用于需要用带有放射性或非放射性核苷酸标记第一链cDNA的实验，比如将标记好的第一链cDNA 作为杂交实验中的探针或者用于微阵列分析。
原发性高血压患者血清miRNA-663水平与RAAS生化标志物的相关性分析
原发性高血压患者血清miRNA-663水平与RAAS生化标志物的相关性分析刘文果;陈石磊;万志佳;魏星【摘要】目的探讨原发性高血压患者血清miRNA-663水平与肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAAS)生化标志物的相关性.方法受试者分为原发性高血压组、健康对照组,每组50例.分别采用荧光实时定量聚合酶链反应、化学比色法及放射免疫法检测外周血血清miRNA-663、血管紧张素转换酶(ACE)活性,以及肾素(RA)、血管紧张素(Ang)Ⅱ 、醛固酮(ALD)的表达.结果相对于健康对照组,原发性高血压组患者外周血血清miRNA-663表达显著降低,ACE活性及RA、AngⅡ 、ALD表达均显著升高(P<0.01);原发性高血压患者血清miRNA-663水平与血清ACE活性及RA、AngⅡ 、ALD水平均呈显著负相关.结论原发性高血压患者外周血血清miRNA-663表达显著下调,RASS生化标志物显著升高,外周血血清miRNA-663表达与RASS生化标志物呈显著负相关关系.【期刊名称】《检验医学与临床》【年(卷),期】2018(015)019【总页数】4页(P2899-2901,2905)【关键词】miRNA-663;高血压;肾素;血管紧张素转换酶;血管紧张素Ⅱ【作者】刘文果;陈石磊;万志佳;魏星【作者单位】重庆市结核病防治所检验科 400050;陆军军医大学军事预防医学院防原医学教研室,重庆400038;重庆市沙坪坝区妇幼保健计划生育服务中心检验科400030;重庆市奉节县人民医院检验科 404600【正文语种】中文【中图分类】R446.11原发性高血压是以血压升高为主要临床表现的综合征，是多种心、脑血管疾病的重要病因和危险因素。
原发性高血压会严重影响心、脑、肾等重要脏器的结构与功能，最终导致这些器官的功能衰竭，迄今其仍是心血管疾病死亡的主要原因之一[1-2]。
原发性高血压的发病机制十分复杂且不明确，目前研究表明原发性高血压是多因素、多层次共同作用的结果。
ThermoScientificMaxima第一链cDNA合成试剂盒适用于RT-qPCR
产品信息Thermo ScientificMaxima第一链cDNA合成试剂盒（适用于RT-qPCR）#K1641，#K1642/onebio分析证书经验证，在两步法RT-qPCR中，对于不同起始量（5 ng-0.5 fg）的RNA逆转录产物，使用Thermo Scientific Maxima SYBR Green/ROX qPCR 预混液进行qPCR扩增。
其反应效率在90-110％之间，曲线斜率在-3.09和-3.58之间，且相关系数>0.99。
质量授权人：Jurgita Zilinskiene目录页码试剂盒组分 (4)贮存条件 (4)产品描述 (4)重要提示 (5)RT-qPCR实验方案 (6)对照反应 (6)疑难解答 (7)参考文献 (8)试剂盒组分贮存条件所有试剂盒成分都应贮存于-20 °C。
产品描述Thermo Scientific Maxima第一链cDNA合成试剂盒是合成cDNA第一链的方便系统，适用于两步法实时定量RT-PCR（RT-qPCR）中的cDNA合成。
试剂盒采用先进的Maxima 反转录酶（RT），该酶源自M-MuL V 逆转录酶的体外进化。
这种酶相比M-MuL V逆转录酶热稳定性高，扩增效果强劲且具有更高的cDNA合成效率。
Maxima第一链cDNA合成试剂盒能够在较高温度下（55-65℃），在很宽的总RNA量范围内（从1 pg到5 μg）合成cDNA。
合成反应能在15-30分钟内完成。
Maxima第一链cDNA合成试剂盒的各组分经预混合，以节约时间和减少移液错误。
试剂盒由Maxima Enzyme Mix、5×反应混合液、无核酸酶的水三部分组成。
Maxima Enzyme Mix包含Maxima反转录酶和Thermo Scientific Ribolock RNase抑制剂。
重组的Ribolock RNase抑制剂能有效保护RNA模板在高于55℃时不被RNase A、B和C降解。
天根 一步法逆转录PCR试剂盒说明书
通用型一步法RT-PCR试剂盒说明书前言本试剂盒适用于对各种动、植物、病毒RNA进行PCR 检测。
用户可根据被分析基因，配合一对引物，或同时采用Taqman 荧光探针，先将提取的RNA反转录(reverse transcription).成cDNA，再经过聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)技术对特异性片段进行扩增，进行电泳或实时荧光分析。
一步法RT-PCR可使RT及PCR过程在单管中完成，比分开进行RT及PCR更方便。
由于不需要在RT完成后打开反应管，尽可能地避免了样品间的相互污染。
规格20人份适用仪器适用于各种普通PCR仪器和实时荧光PCR仪器。
试剂盒组成试剂准备根据下表配制反应液：振荡混匀后，按每管 40 μl(可根据需要调整)分装，备用。
PCR扩增将均一化后的RNA提取样本10 μl加入各反应管，混匀、离心后，置普通PCR仪器或实时荧光PCR仪器上进行扩增及实时检测。
结果判断扩增产物可直接进行电泳检测；实时荧光检测可根据相应仪器的配套软件进行结果分析。
保存及有效期-20℃保存，有效期为6个月。
注意事项1. 开始检测前请仔细阅读本说明书全文。
2. 整个检测过程中，反应体系的配制、样本处理及加样、PCR扩增（荧光检测）应分区进行以避免污染。
3. 操作人员应戴口罩，经常更换一次性手套，以避免RNA酶的污染；实验中所用器具均应经过除RNA酶处理。
4. 试剂盒组成中的试剂使用前应充分融化并混匀。
5. 进行实时荧光分析时，应使用透光性能较好的一次性薄壁离心管；.荧光探针应避光保存，加入缓冲液中后，应尽快进行扩增。
6. 注意适当处理检测中遗留的样品、扩增产物及可能被污染的试剂。
生产企业：上海蓝创生物科技发展有限公司。
cDNA第一链合成试剂盒
cDNA 第一链合成试剂盒操作方法1、逆转录反应（ 1）在无菌薄壁管中加入以下成份：Total RNA 0.5-1.0 μg(dN) 9 or oligo(dT) 18 100pmol（ 2）混匀后， 70℃变性 5min，将薄壁管迅速置于冰上冷却，然后依次加入以下成份：5×M-MLV Buffer 4μldNTPs（ 10mM each）RNasin 1μl 10U100mM DTTM-MLV Reverse Transcriptase 2μl 100UDEPC-treated water up to 20 μl（ 3）混匀后短暂离心，使用oligo(dT) 18 引物时在42℃，使用随机引物(dN) 9 时在37℃下温育 1 小时。
（4） 94 ℃ 5min 终止反应后，冰上冷却。
（5）合成的 cDNA第一链可直接用于 PCR扩增或进行其它下游操作。
2、 PCR扩增（ 1）在 PCR薄壁管中加入以下试剂Synthesized cDNA 2-5 μl10×PCR Buffer 2μlUpper primer 10pmolLower primer 10pmoldNTPs（10mM each）0.5 μlTaq DNA Polymerase 1.5UddH2O up to 20 μl（ 2）混匀后短暂离心，然后进行PCR扩增。
94℃预变性 2.5min 。
进入下列30~40 个循环（此扩增条件仅供参考）：94℃30s， 60℃ 45s ，72℃ 1min ~3min。
最后 72℃延伸 7min。
注意事项1、确保 RNA完整性及纯度。
RNA质量是决定合成cDNA第一链成功的关键因素，其纯度及完整性可由 OD260/OD280比值和进行琼脂糖凝胶电泳检测。
较纯的 RNA 样品 OD260/OD280比值通常为 1.8-2.0 ，若该比值偏低，应进一步纯化。
真核生物RNA样品电泳图谱 28s 和 18s 的比值约为 2:1 ，否则，表明有 RNA降解。
ThermoScientificRevertAidFirstStrandcDNASynthesisKitK说明书第一链cDNA合成试剂盒
RevertAid第一链cDNA Synthesis试剂盒#K1621, #K1622分析证明书质量控制#K1621Lot采用100 fg对照GAPDH RNA和对照引物进行RT-PCR反应，通过在1%琼脂糖上进行凝胶电泳和溴化乙锭染色显示得到足够量的496 bp的产物质量认证人：Jurgita Zilinskiene目录页码试剂盒组成 (2)存储条件 (2)产品说明 (2)注意事项 (3)操作步骤 (6)RT-PCR (6)合成cDNA用于克隆………..………………………………………7 实验对照……………………………………………………………….8 问题分析与解决 (10)** 一个单位的RiboLockRNase酶抑制剂抑制5ng RNA酶A 50%的活性。
存储条件试剂盒中所有组分应存储在-20°C。
对照用RNA可存储于-70°C以便长期使用。
产品说明RevertAid第一链cDNA合成试剂盒以mRNA或者总RNA为模板，高效合成第一链cDNA。
本试剂盒使用RevertAid M-MuLV反转录酶，它的RNA酶H的活性与AMV反转录酶相比较低。
该反转录酶可耐受42-50°C温度，合成的cDNA片段长度达13kb。
试剂盒中含有RiboLock 重组RNA酶抑制剂，防止RNA降解，可耐受55°C高温。
试剂盒同时含有oligo(dT)18和随机六聚体引物。
随机六聚体引物与模板非特异性地结合，以总RNA中任何RNA为模板合成cDNA。
oligo(dT)18选择性和RNA 3’po ly(A)配对结合，只以有poly(A)尾巴的mRNA为模板合成cDNA。
使用本试剂盒也可采用序列特异性引物。
合成的第一链cDNA能直接用作PCR或荧光定量PCR的模板，第二链cDNA的合成或线性RNA扩增，也可用于需要用带有放射性或非放射性核苷酸标记第一链cDNA的实验，比如将标记好的第一链cDNA 作为杂交实验中的探针或者用于微阵列分析。
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产品信息
Thermo Scientific
Maxima第一链cDNA合成试剂盒（适用于RT-qPCR）#K1641，#K1642
/onebio
分析证书
经验证，在两步法RT-qPCR中，对于不同起始量（5 ng-0.5 fg）的RNA逆转录产物，使用Thermo Scientific Maxima SYBR Green/ROX qPCR 预混液进行qPCR扩增。
其反应效率在90-110％之间，曲线斜率在-3.09和-3.58之间，且相关系数>0.99。
质量授权人：Jurgita Zilinskiene
目录页码
试剂盒组分 (4)
贮存条件 (4)
产品描述 (4)
重要提示 (5)
RT-qPCR实验方案 (6)
对照反应 (6)
疑难解答 (7)
参考文献 (8)
试剂盒组分
贮存条件
所有试剂盒成分都应贮存于-20 °C。
产品描述
Thermo Scientific Maxima第一链cDNA合成试剂盒是合成cDNA第一链的方便系统，适用于两步法实时定量RT-PCR（RT-qPCR）中的cDNA合成。
试剂盒采用先进的Maxima 反转录酶（RT），该酶源自M-MuL V 逆转录酶的体外进化。
这种酶相比M-MuL V逆转录酶热稳定性高，扩增效果强劲且具有更高的cDNA合成效率。
Maxima第一链cDNA合成试剂盒能够在较高温度下（55-65℃），在很宽的总RNA量范围内（从1 pg到5 μg）合成cDNA。
合成反应能在15-30分钟内完成。
Maxima第一链cDNA合成试剂盒的各组分经预混合，以节约时间和减少移液错误。
试剂盒由Maxima Enzyme Mix、5×反应混合液、无核酸酶的水三部分组成。
Maxima Enzyme Mix包含Maxima反转录酶和Thermo Scientific Ribolock RNase抑制剂。
重组的Ribolock RNase抑制剂能有效保护RNA模板在高于55℃时不被RNase A、B和C降解。
5×反应混合液包含剩余的反应组分：反应缓冲液、dNTPs、Oligo(dT)18和随机引物。
无核酸酶的水用于反应体系的配制和RNA样本的溶解。
已通过相关检验证明其中不含脱氧核糖核酸内切酶、脱氧核糖核酸外切酶、核糖核酸酶和磷酸酶。
重要提示
避免核糖核酸酶污染
RNA的纯度和完整性对于合成全长cDNA至为重要。
RNA能够被RNase A降解，而在任何实验环境中都能发现这种稳定的污染物。
本试剂盒中所有成分都经过严格检测，确保其不含RNase。
为了避免污染，实验环境以及所准备的试剂溶液都必须不含RNase。
避免RNase污染的一般建议：
∙使用确保无核酸酶的实验器具，或者用DEPC水处理cDNA合成中所用到的反应管和枪头等。
∙整个实验过程中请戴手套，因为皮肤是RNA酶的一个常见来源。
同时实验过程中注意经常更换手套。
∙使用无核酸酶的试剂，包括高纯度的水（如无核酸酶的水，#R0581）。
∙未使用试剂盒时请严格密封保存。
在反转录过程中，所有反应管要确保扣严。
模板RNA
通过标准方法分离的总细胞RNA适用于该试剂盒。
纯化的RNA需确保不含盐分、金属离子、乙醇和苯酚，以防其抑制cDNA合成反应。
对于RT-PCR，模板RNA需确保没有DNA污染。
在cDNA合成之前，可先用无核酸酶的DNase I（#EN0521）去除痕量DNA。
实验中需要逆转录酶负对照反应。
该反应含有除Maxima Enzyme Mix以外的所有其他RT反应组分。
RNA样本质量
在合成cDNA之前需对RNA的完整性进行评估。
真核生物总RNA能够通过琼脂糖凝胶电泳后进行EB染色来分析检测。
如果总RNA电泳后有18S和28S rRNA的锐利条带，可认为RNA是完整的。
28S RNA条带的亮度大约为18S rRNA条带的两倍。
rRNA条带出现任何拖尾现象都表示mRNA存在降解。
如果这种情况发生，需重新制备总RNA样品。
另外，也可用生物分析仪器（如Agilent 2100）分析总RNA，该仪器能对RNA样本的大致状况，RNA的完整数（RIN）（2）进行定量。
内参基因/目的基因3’:5’完整性分析（3）也能用于检测RNA样本的完整性。
引物
Maxima第一链cDNA合成试剂盒包含Oligo（dT）18引物和随机引物，以引导第一链cDNA的合成。
该引物混合物可确保检测低拷贝转录物时的高灵敏性。
RT-qPCR实验方案
开始前请阅读本手册的重要提示部分（第5页）。
第一链cDNA合成
第一链cDNA合成反应可以以单个反应进行，而对于不同的RNA模板，也可以进行一系列的平行反应。
因此，反应混合液既可以通过将各组分溶液单独混合，也可以将RT反应中除了RNA模板外的所有组分制成预混液。
解冻后，轻轻涡旋并短暂离心试剂盒所有组分。
冰上放置。
1.的反应管中。
2.
3.25℃孵育10分钟，之后再50℃孵育15分钟。
注：若RNA模板量大于1 μg，则延长反应时间至30分钟。
若RNA模板富含GC或含有大量的二级结构，可将反应温度提高至65℃。
4.85℃加热5分钟以终止反应。
该反转录反应产物能够直接用于qPCR，或者在-20℃条件下存放一周。
如需长时间贮存，推荐贮存于-70℃。
另外应避免cDNA的反复冻融。
qPCR
第一链cDNA合成的产物能够直接用于qPCR。
加入的合成的cDNA第一链产物体积不应超过PCR反应总体积的1/10。
通常情况下，在25 μl体系的qPCR反应中加入2 μl合成的cDNA第一链作为模板。
Maxima第一链cDNA合成试剂盒适于和Maxima qPCR master mixes （#K0221、#K0231、#K0241、#K0251、#K0261）搭配使用。
对照反应
实验中应利用如下负对照来确认第一链cDNA合成的结果。
Reverse transcriptase minus（RT-）负对照：RT-PCR和RT-qPCR中应利用此负对照来检验RNA样本中基因组DNA的污染情况。
此负对照RT-反应含有除Maxima Enzyme Mix 以外的所有组分。
无模板负对照（NTC）：此负对照用来检验试剂污染情况。
NTC反应含有除模板以外的所有组分。
疑难解答
参考文献
1.Wiame, I., et al., Irreversible heat inactivation of DNaseI without RNA degradation, BioTechniques, 29, 252-256, 2000.
2.Fleige, S., Pfaffl, M.W., RNA integrity and the effect on the real-time qRT-PCR performance, Mol. Aspects Med., 27, 126-139, 2006.
3.Nolan, T., et al., Quantification of mRNA using real-time RT-PCR, Nat. Protoc., 1,
1559-1582, 2006.
注：
本产品或使用本产品都必须遵守美国专利申请US20110251080A1及相应的副本。
购买本产品包括购买非转让许可，以便买方可将本产品用于其内部研究。
本产品的所有其他商业用途，包括但不限于诊断用途、原装或改装转售或利用产品提供商业服务，均需要一份单独的许可证。
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产品使用限制
本产品的开发、设计及销售专供研究和体外试验使用。
本产品不得用于诊断试验或药物开发，也不适合向人或动物注射。
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