Thermo Scientific Rever id First Strand cDNA Synthesis Kit K 说明书 第一链cDNA合成试剂盒

RevertAid™第一链cDNA Synthesis试剂盒
#K1621, #K1622
分析证明书 #K1621 Lot
质量控制
采用100 fg对照GAPDH RNA和对照引物进行RT-PCR反应，通过在1%琼脂糖上进行凝胶电泳和溴 化乙锭染色显示得到足够量的496 bp的产物
质量认证人：Jurgita Zilinskiene
RT-PCR…………………………………………………………….6 合成cDNA用于克隆………..………………………………………7 实验对照……………………………………………………………….8 问题分析与解决……………………………………………………...10
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试剂盒成分
RevertAid™第一链cDNA合成试剂盒
2. 37°C 孵育 30 分钟。
3. 加入1 μl 50 mM EDTA，65°C 孵育10分钟。在含有二价阳离子(1)而缺乏螯合剂的环境中，RNA
产品说明
RevertAid™第一链cDNA合成试剂盒以mRNA或者总RNA为模板，高效合成第一链cDNA。本试剂 盒使用RevertAid™ M-MuLV反转录酶，它的RNA酶H的活性与AMV反转录酶相比较低。该反转录酶可 耐受42-50°C温度，合成的cDNA片段长度达13kb。
试剂盒中含有RiboLock™ 重组RNA酶抑制剂，防止RNA降解，可耐受55°C高温。 试剂盒同时含有oligo(dT)18和随机六聚体引物。随机六聚体引物与模板非特异性地结合，以总RNA 中任何RNA为模板合成cDNA。oligo(dT)18选择性和RNA 3’poly(A)配对结合，只以有poly(A)尾巴的 mRNA为模板合成cDNA。使用本试剂盒也可采用序列特异性引物。 合成的第一链cDNA能直接用作PCR或荧光定量PCR的模板，第二链cDNA的合成或线性RNA扩增， 也可用于需要用带有放射性或非放射性核苷酸标记第一链cDNA的实验，比如将标记好的第一链cDNA 作为杂交实验中的探针或者用于微阵列分析。
20 μl
20 μl
GAPDH反向引物, 10 μM 5’ – GTCCACCACCCTGTTGCTGTAG - 3’
20 μl
20 μl
对照GAPDH RNA 1.3 kb 3’-poly(A) tailed RNA transcript, 0.05 μg/μl
20 μl
20 μl
无核酸酶高纯度水
模板RNA 通过标准方法得到的细胞总RNA可用本试剂盒获得第一链cDNA。纯化过的RNA要保证不含有盐， 金属离子，乙醇和苯酚，因为以上成分会干扰第一链cDNA的合成反应。可采用乙醇沉淀RNA的方法去 除掉痕量污染物（然后再用75%冷乙醇冲洗沉淀两次）。如果要进行RT-PCR，模板RNA要确保没有DNA 污染。在进行cDNA合成前，模板RNA必须用无RNA酶的DNA酶I（#EN0521）处理去除掉痕量DNA。 实验过程要设置无RT对照反应，即此对照反应中含有除逆转录酶以外的其他所有RT-PCR成分（RT-对 照）。
目录
页码 试剂盒组成…………………………………………………………….2 存储条件……………………………………………………………….2 产品说明……………………………………………………………….2 注意事项…………………………………………………………….....3 操作步骤…………………………………………………………….....6
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注意事项
避免核酸酶污染 RNA的纯度和完整性对于合成全长cDNA至关重要。RNA很容易被RNA酶A降解，而RNA酶A广泛 稳定地存在于实验室中。试剂盒中的所有成分都经过了无RNA酶的严格验证并保证不含有RNA酶。为 防止污染，实验室和所有实验准备工作都必须保证没有RNA酶污染。 避免RNA酶污染的常规建议： ● 用DEPC处理实验用到的所有管子和枪头，或者购买已经证明无核酸酶的实验用具。 ● 整个实验过程戴手套，因为皮肤是RNA酶的一个常见来源。并经常更换手套。 ● 使用无RNA酶的试剂，即使是超纯水也要确保无RNA酶（比如RNA酶抑制剂，比如试剂盒中提供的Fermentas RiboLock™RNA酶抑制剂来保护RNA。 ● 试剂盒如不使用，要严格密封保存。在反转录过程中，所有管子要确保扣严。
2x1.25 ml 2x1.25 ml
* 一个单位的RevertAid™M-MLV逆转录酶在37℃10 分钟将1 nmol 的dTMP转化为多核苷酸组分（吸附在DE81上）。
** 一个单位的RiboLock™RNase酶抑制剂抑制5ng RNA酶A 50%的活性。
存储条件
试剂盒中所有组分应存储在-20°C。对照用RNA可存储于-70°C以便长期使用。
去除RNA中基因组DNA的实验步骤: 1. 将以下成分加入到一个无RNA酶的管子中：
RNA
1μg
10×反应缓冲液（含有MgCl2） DNA酶I，无RNA酶（#EN0521）*
1μl 1μl（1u）
无核酸酶的高纯度水
加到10μl
* 对于每1μg RNA，不要使用超过1u的DNA酶I（不含RNA酶的）。
150 μl 50 μl
500 μl 250 μl
Oligo(dT)18 引物 100 μM, 0.5 μg/μl (15 A260 u/ml) 随机六聚体引物 100 μM, 0.2 μg/μl (6 A260 u/ml)
25 μl 25 μl
120 μl 120 μl
GAPDH正向引物, 10 μM 5’ – CAAGGTCATCCATGACAACTTTG – 3’
20 次 #K1621
100 次 #K1622
RevertAid™ M-MuLV反转录酶（200 u*/μl）
25 μl
120 μl
RiboLock™ RNA酶抑制剂 (20 u**/μl)
25 μl
120 μl
5×反应缓冲液 （250 mM Tris-HCl (pH 8.3), 250 mM KCl, 20 mM MgCl2, 50 mM DTT） 10mM dNTP 混合物